Apostila Curso CultivoCelular UFV 2020

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Joice de Melo Agripino 
Larissa Coelho Pereira 
Luciana Ângelo de Souza 
Victor Hugo Ferraz da Silva 
CULTIVO CELULAR E ANÁLISE DE 
CITOTOXICIDADE APLICADOS À BUSCA DE 
NOVOS FÁRMACOS EM MODELO DE 
CÉLULA DE MAMÍFERO 
Outubro/2020 
 
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Cultivo Celular e seu Progresso Histórico 
 O cultivo celular representa uma grande mudança nas pesquisas das últimas 
décadas contribuindo de forma versátil em estudos e experimentos de diversas áreas no 
qual se aplica, sendo uma importante ferramenta de pesquisa nos laboratórios do mundo 
inteiro. A história dessa técnica denota do final do século XIX quando o zoólogo e 
embriologista alemão Wilhelm Roux, em seus estudos com embriões, conseguiu manter 
as células da placa neural de embriões de galinha viáveis por alguns dias em solução 
salina. 
 Em 1907, o biólogo e anatomista americano Ross Granville Harrison, na busca 
por compreender a dinâmica do desenvolvimento do tecido nervoso deu início ao uso de 
cultura de células. Harrison queria provar que as fibras nervosas eram formadas a partir 
de células nervosas. Para isso, desenvolveu um experimento capaz de mimetizar as 
condições básicas de crescimento para uma célula. Ele dissecou o tubo medular de um 
embrião de sapo e o mergulhou em sua linfa fresca. Em instantes, a linfa se coagulou. 
Prosseguindo, Harrison selou o frasco com parafina e observou a sua preparação ao 
microscópio todos os dias, com os devidos cuidados de assepsia. Com esse experimento, 
a sua hipótese foi confirmada, a de que as fibras nervosas são formadas a partir de células 
nervosas. A possibilidade de se manter in vitro células vivas por mais de uma semana foi 
um marco para a cultura de células. O sucesso da técnica despertou o interesse de muitos 
outros cientistas que passaram a adotar o modelo experimental proposto por Harrison em 
seu artigo intitulado “Cultivo de células nervosas e monitoramento do desenvolvimento 
de fibras nervosas”. No artigo, Harrison escreve: 
 
 
 
 
 Em 1912, o biólogo francês Alexis Carrel, baseado na descoberta feita por 
Harrison, publicou um trabalho com formas de prolongar o tempo de vida das células em 
cultura. Carrel trabalhou com células cardíacas de embrião de galinha e tecidos de 
“Quando se tomam as precauções assépticas adequadas, os tecidos 
sobrevivem nessas condições por uma semana e, em alguns casos, 
foram mantidos espécimes vivos durante aproximadamente quatro 
semanas”. 
 
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cachorro em seus experimentos. A temperatura do cultivo das células era controlada, 
38°C, e a cultura era suplementada com extrato de embrião ou músculos. Carrel verificou 
a necessidade da troca do meio de cultivo onde as células cresciam. A renovação 
constante de nutrientes prolongava o tempo de vida das células permitindo o cultivo das 
mesmas por períodos ainda maiores do que os utilizados por Harrison. 
 Em 1951, o biologista celular americano, George Otto Gey, diretor do Laboratório 
de Cultura de Tecidos da Escola de Medicina da Universidade Johns Hopkins (EUA), 
recebeu uma amostra de biópsia cervical proveniente da paciente Henrietta Lacks, 
diagnosticada com tumor cervical. Gey cultivou as células recebidas e descobriu que a 
linhagem celular era extremamente durável e apresentava divisão celular a cada 20 horas. 
Essa nova linhagem celular chamada HeLa (Henrietta Lacks), forneceu-lhe o meio mais 
eficaz para o desenvolvimento do poliovírus, permitindo o desenvolvimento da vacina 
Salk. As células HeLa foram então distribuídas para vários laboratórios e empresas 
farmacêuticas, tornando-se um dos recursos mais preciosos para estudos de tumores. 
 Os experimentos dos americanos Leonard Hayflick e Paul Moorhead, em 1961, 
contribuíram, em grande parte, com o avanço no cultivo celular. Seus experimentos são 
considerados clássicos, uma vez que utilizaram células de vida finita. Motivados em 
desenvolver sistemas de células humanas não-tumorigênicas que pudessem ser cultivadas 
por longos períodos de tempo, em especial, para o crescimento de vírus e produção de 
vacinas, Hayflick e Moorhead descobriram que as células humanas derivadas de tecidos 
embrionários podem se dividir apenas por um número finito de vezes (50 vezes) em 
cultura. Esse fato contribui para o uso do cultivo celular como valiosa ferramenta para o 
entendimento de processos biológicos, como a senescência celular. 
 Nakamura e colaboradores, em 1962 no Japão, estabeleceram a linhagem celular 
VERO, proveniente de rim de macaco-verde africano (Cercopithecus aethiops). Na 
atualidade, a linhagem VERO é uma das poucas aprovadas pela Organização Mundial de 
Saúde (OMS) para uso em produção de vacinas. 
 Atualmente, o cultivo celular vai muito além do estudo do comportamento de 
determinados tecidos ou células in vitro. A técnica é uma ferramenta essencial para o 
estudo e pesquisa de: 
 
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▪ Atividade Intracelular: transcrição de DNA, síntese proteica, 
metabolismo energético, ciclo celular, diferenciação, apoptose; 
▪ Fluxo Intracelular: processamento de RNA, receptores hormonais, fluxos 
metabólicos, mobilização de cálcio, transdução de sinais, tráfico de membranas; 
▪ Interação Célula-célula: morfogênese, controle parácrino, proliferação celular, 
cooperação metabólica, adesão, motilidade, interação com a matriz, invasividade; 
▪ Produtos celulares: proteômica, secreção, biotecnologia, biorreatores. 
 
O cultivo celular tem ainda aplicações em diversas áreas: 
▪ Farmacologia: ação de fármacos, interação entre ligante-receptor, metabolismo 
de fármaco, resistência a drogas; 
▪ Imunologia: produção de anticorpos monoclonais, pesquisa de epítopos na 
superfície celular, hibridomas, citocinas, processo inflamatório; 
▪ Genômica: análises genéticas, transfecção, infecção, transformação, 
imortalização, senescência; 
▪ Toxicologia: infecção, citotoxicidade, mutagênese, carcinogênese, inflamação; 
▪ Engenharia Tecidual: construção de tecidos, matrizes, propagação, 
diferenciação. 
 
 
Vantagens e Limitações do Cultivo Celular 
 
 O cultivo celular possibilita estudar fenômenos inacessíveis em tecidos intactos, 
controlar o ambiente extracelular, conhecer o comportamento e função de uma população 
isolada de células, além de reduzir a utilização de animais como modelos experimentais. 
Quando executado com qualidade, proporciona consistência e reprodutibilidade dos 
resultados obtidos, característica esta primordial na pesquisa científica. 
 Apesar das diversas vantagens, vale lembrar que, como toda e qualquer técnica, o 
cultivo celular possui algumas limitações, a começar pela proliferação em condições in 
vitro que diferem das condições in vivo. No ambiente in vitro a adesão célula-célula e 
célula-matriz é reduzida. As células são cultivadas em um ambiente que mimetiza as 
condições necessárias às células, mas que não apresentam as mesmas características 
 
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nutricionais e hormonais de um tecido in vivo, tampouco a heterogeneidade e 
arquitetura tridimensional. 
 A técnica deve ser executada com cautela e qualidade, pois existe a possibilidade 
de contaminação cruzada por outros tipos celulares, contaminação microbiana, fúngica e 
por vírus durante a manipulação. 
 O local de trabalho deve conter uma infraestrutura apropriada. De maneira geral, 
o laboratório necessita dos seguintes espaços: área para lavagem e esterilização de 
materiais; área para preparo de meios de cultivo; área para incubação e observação das 
culturas; área para manipulação asséptica das culturas. Deve ainda obedecer 
rigorosamente às normas de biossegurança estabelecidas para cada classe de agentes 
biológicos, como será visto mais adiante. 
 
 
Normas Básicas para se Trabalhar com Culturas Celulares 
 
 O sucesso no cultivo celular depende de uma série de cuidados para que os riscos 
de contaminação sejam os mínimos possíveis. A contaminação,além da perda de material 
biológico, leva à perda de tempo no prosseguimento dos experimentos, perda de reagentes 
e materiais e pode ainda expor o manipulador a riscos de contaminação com cepas de 
microrganismos patogênicos. Portanto, a BIOSSEGURANÇA é primordial e 
indispensável! 
 
Atente-se para as dicas e instruções: 
 
1- Toda vez em que se for manipular as células em cultivo, observe-as previamente 
sob o microscópio, a fim de observar qualquer indício de contaminação e se o 
crescimento está dentro da normalidade. 
2- As garrafas de meio de cultura não devem ser emprestadas e/ou compartilhadas 
com outras pessoas. 
3- A limpeza da sala de cultivo deve ser feita pelo menos uma vez por semana. Fluxo, 
estufas, microscópio, bancadas, banho-maria e o chão. Cada laboratório deve 
estabelecer os protocolos que melhor atendem às necessidades de trabalho. 
 
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4- A porta da sala de cultivo deve ser mantida sempre fechada. É proibido 
fumar ou comer na sala. A permanência de pessoas que não estejam trabalhando 
deve ser evitada. 
5- Use sempre jalecos limpos e exclusivos para o trabalho na sala de cultivo. 
6- O uso de luvas é indispensável. 
7- Utilize o álcool 70% nas luvas sempre antes de iniciar e/ou voltar a trabalhar na 
câmara de fluxo laminar. 
8- Limpe a câmara de fluxo laminar com álcool 70% sempre antes e depois dos 
experimentos. 
9- TODO o material a ser utilizado na câmara de fluxo laminar deve ser previamente 
limpo com álcool 70%. 
10- Evite falar enquanto está trabalhando na câmara de fluxo laminar. 
11- Antes de descartar o material biológico na pia, adicione hipoclorito de sódio 2% 
(concentração final de 0,1- 0,2%) por pelo menos 30 min. 
12- Em caso de derramamento de material biológico, neutralizar a solução derramada 
com hipoclorito 2% e deixar agir por 30 minutos. 
 
Classe de Risco e Nível de Biossegurança (NB) 
 
 Os agentes biológicos que afetam o homem, os animais e as plantas são 
distribuídos em classes de risco: I, II, III e IV. Quanto maior a classe (Ex: classe IV), 
maior é o grau de risco e, portanto, maiores são os cuidados de biossegurança exigidos 
para sua manipulação. 
 
▪ Classe I: baixo risco individual e para a coletividade. Exemplo: Lactobacillus sp., 
E. coli. 
▪ Classe II: moderado risco individual e limitado risco para a comunidade. 
Exemplo: bactérias - Clostridium tetani, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus 
aureus; vírus-Epstein-Barr (EBV), herpes; fungos - Candida albicans; parasitos - 
Plasmodium, Schistosoma. 
▪ Classe III: alto risco individual e moderado risco para a comunidade. Exemplo: 
Bacillus anthracis; Mycobacterium tuberculosis; vírus – hepatites B e C. 
 
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▪ Classe IV: alto risco individual e para a comunidade. Exemplo: vírus 
Ebola. 
 Existem quatro níveis de biossegurança (NB): NB-1, NB-2, NB-3 e NB-4, 
crescentes no maior grau de contenção e complexidade do nível de proteção, que 
consistem de combinações de práticas e técnicas de laboratório e barreiras primárias e 
secundárias de um laboratório. O responsável técnico pelo laboratório é o responsável 
pela avaliação dos riscos e pela aplicação adequada dos níveis de biossegurança, em 
função dos tipos de agentes e das atividades a serem realizadas. 
 
▪ NB1: laboratórios de ensino básico, onde são manipulados os microrganismos 
pertencentes à classe de risco I. Não é requerida nenhuma característica de 
desenho, além de um bom planejamento espacial e funcional e a adoção de boas 
práticas laboratoriais. 
▪ NB2: manipulação de microrganismos da classe de risco II. Laboratórios clínicos 
ou hospitalares de níveis primários de diagnóstico, sendo necessário, além da 
adoção das boas práticas, o uso de barreiras físicas primárias (cabine de segurança 
biológica e equipamentos de proteção individual) e secundárias (desenho e 
organização do laboratório). 
▪ NB3: microrganismos da classe de risco III ou para manipulação de grandes 
volumes e altas concentrações de microrganismos da classe de risco II. Para este 
nível de contenção são requeridos além dos itens referidos no nível 2, desenho e 
construções laboratoriais especiais. Deve ser mantido controle rígido quanto à 
operação, inspeção e manutenção das instalações e equipamentos e o pessoal 
técnico deve receber treinamento específico sobre procedimentos de segurança 
para a manipulação. 
▪ NB4: ou laboratório de contenção máxima, destina-se a manipulação de 
microrganismos da classe de risco IV, onde há o mais alto nível de contenção, 
além de representar uma unidade geográfica e funcionalmente independente de 
outras áreas. Esses laboratórios requerem, além dos requisitos físicos e 
operacionais dos níveis de contenção 1, 2 e 3, barreiras de contenção (instalações, 
desenho equipamentos de proteção) e procedimentos especiais de segurança. 
 
 
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Cultura de Células: o que é? 
 
 A cultura de células consiste na retirada de células de um animal ou um vegetal 
com seu subsequente crescimento em um ambiente artificial. As células podem ser 
removidas diretamente do tecido ou desagregadas por meio mecânico ou enzimático antes 
do cultivo celular. Em outro caso, podem ser derivadas de uma linguagem celular 
previamente estabelecida. 
 O crescimento de células provenientes de um fragmento de tecido obtido por 
desagregação mecânica ou enzimática se refere à cultura primária. As células que 
sobrevivem ao processo de desagregação e conseguem se aderir à garrafa formam a 
primeira monocamada de células daquele tecido. Essas células possuem as características 
genotípicas e fenotípicas do tecido de origem, são capazes de crescer em cultura por um 
determinado período de tempo e são denominadas células primárias. 
 À medida que as células em cultura são repicadas, as que possuem maior 
capacidade proliferativa predominam na garrafa em detrimento das células que menos se 
adaptam às condições de cultivo in vitro, ou que não possuem uma taxa normal de 
proliferação devido a traumas decorrentes do processo de desagregação. Após o primeiro 
subcultivo (repique), a cultura primária é chamada de linhagem celular. Essas células 
ainda possuem as características do tecido de origem e alta proliferação. A linhagem 
celular pode ser do tipo finita ou contínua. 
 
▪ Linhagem celular finita: as células se dividem por período limitado de tempo 
antes de perderem sua capacidade proliferativa (senescência). 
▪ Linhagem celular contínua: após processo de transformação, as células se 
tornam imortais com capacidade proliferativa indefinida. As células 
transformadas também podem ser obtidas diretamente de tecidos já mutados, 
como é o caso de tecidos tumorais. O exemplo mais conhecido desse tipo de célula 
são as células HeLa. 
 
 
 
Subcultivo = Passagem (repique) 
Deve ser sempre escrita no frasco/placa como P# 
 
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Confluência Celular e Inibição por Contato 
 
 Quando as células em cultura proliferam até ocuparem todo o substrato disponível, 
dizemos que elas alcançaram a confluência celular. Nesse estágio, as células têm que ser 
subcultivadas, transferindo-as para um novo recipiente com as condições apropriadas ao 
seu crescimento. A confluência ótima para transferir as células para um novo frasco ou 
placa é de 70 a 80%. A confluência muito baixa significa que as células ainda estão em 
fase lag (fase de adaptação) e, portanto, não conseguirão proliferar-se. Já em confluência 
elevada, as células podem ter sofrido alterações desfavoráveis para seu subcultivo 
podendo ainda ser difícil sua remoção do frasco ou placa. 
 O crescimento celular in vitro pode ser inibido por contato de uma célula com 
outra. Quando as células fazem contato entre si, elas cessam seu crescimento, entram na 
fase G0 do ciclo celular. Células transformadas, como as células Hela, podem continuar 
a multiplicar e empilhar umas sobre as outras.Linhagens Celulares e Manutenção 
É importante salientar que as células em cultivo apresentam, inicialmente, 
características dos seus tecidos de origem. Desta forma, células epiteliais terão uma maior 
dependência do contato célula-célula, enquanto as células hematopoiéticas não 
necessitarão de nenhum contato. 
Células em cultivo podem ser classificadas quanto a dois aspectos distintos: 
podem ser aderentes ou não aderentes, ou seja, algumas podem se aderir ao fundo da 
garrafa de cultivo ou ficarem suspensas no meio de cultura, respectivamente (Figura 1). 
 
 
 
 
 
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As células aderentes são originadas a partir de um tecido com parênquima 
estrutural definido (exemplo: tecido epitelial, muscular). Para que ocorra seu crescimento 
em meio de cultura é preciso uma superfície de contato para adesão. Para o cultivo de 
células aderentes, é necessário o uso de garrafas que contentam uma carga negativa. Esta 
carga irá estimular a produção de proteínas de adesão e proteoglicanos, que permitirão o 
início do processo de adesão da célula a superfície de contato. A matriz extracelular, que 
circunda as células, interage com a carga negativa da garrafa e com as células, através de 
receptores específicos (Figura 2). Quando em cultura, as células aderentes se espalham 
pelo fundo da garrafa formando uma monocamada celular. 
 
Fig. 2: Processo de adesão celular mediado por proteínas de adesão. Fonte: ALVES, E.M.; GUIMARÃES, 
A.C.R, in Cultivo Celular. 
 
Fig. 1: A) Linhagem aderente (Linhagem MA 104); B) Linhagem não aderente (protozoários 
Leishmania sp.). 
 
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As células não aderentes são cultivadas em suspensão no meio e são oriundas de 
tecidos que não necessitam de ancoragem para a proliferação e sobrevivência. São 
exemplos de células não aderentes: células hematopoiéticas, linhagens transformadas, 
parasitos Leishmania sp. 
A manutenção das células aderentes em cultivo é feita quando há confluência em 
torno de 70 – 90% ou quando o meio está 
metabolizado. Para fazer o repique celular, serão 
necessários aparatos que possam descolar as células 
do fundo da garrafa. Este “descolamento” pode ser 
feito por meio proteolítico, com o auxílio de solução 
de Tripsina-EDTA (ácido etilenodiamino tetra-
acético), ou por meios mecânicos, como o auxílio de 
um espalhador de células (Figura 3). 
A Tripsina-EDTA é uma solução balanceada 
com tripsina sem íons e com um agente quelante, o EDTA. Ela age permitindo o 
"descolamento" das células de frascos de cultivo e/ou desagregando células entre si 
através de sua propriedade proteolítica sobre proteínas intercelulares, e ainda alterando a 
estabilidade das membranas ao quelar o íon cálcio. Como o processo de descolamento e 
separação de células pode ser acompanhado ao microscópio, pode-se interromper a sua 
ação quando desejado, pela simples adição de meio contendo soro animal ou humano. 
Esta solução não dever ficar em contato com a cultura por longos períodos, devido ao 
risco de reduzir a viabilidade celular (lise celular). 
O movimento de vai- e- vem do espalhador de células sobre a monocamada celular 
cria um atrito mecânico que permite o descolamento das células do fundo da garrafa de 
cultura. A desvantagem desta técnica é que ela pode ser muito danosa para a célula, 
devido a sua agressividade. 
Em ambos os casos, o resultado será uma suspensão de células. A partir desta 
suspensão é possível retirar uma alíquota e transferi-la para outra garrafa de cultura com 
acréscimo de meio específico, formando uma nova garrafa de cultura, ou apenas retirar o 
volume de célula e acrescentar novo meio, mantendo-se assim a cultura na mesma garrafa. 
Fig. 3: Espalhador de células, também conhecido 
como “rodinho”. 
 
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Curva de Crescimento Celular 
Células em cultura possuem um padrão de crescimento representado por uma 
curva sigmóide (Figura 4), chamada curva de crescimento. Essa curva reflete as fases 
de adaptação das células às condições ambientais, à disponibilidade de nutrientes e ao 
suporte de ancoragem necessários a proliferação celular. 
A determinação da curva de crescimento é importante para a caracterização de 
uma cultura celular. Cada fase da curva é acompanhada por modificações na biologia das 
células. Através dessa curva, é possível prever qual a melhor época para o repique celular 
ou quando novos nutrientes devem ser acrescentados ao meio. 
 
 Fig. 4: Curva de crescimento celular padrão. 
 A curva de crescimento é dividida nas seguintes fases: 
• Fase Lag: corresponde ao período de adaptação. Nesta fase não ocorre 
proliferação celular. É um período caracterizado por intensa atividade metabólica. 
• Fase Log: fase exponencial ou logarítmica, caracterizada por uma intensa 
proliferação celular, com crescimento constante. É o período de maior viabilidade 
celular, sendo por isso ideal para experimentos e estudos. 
• Fase estacionária ou plateau: caracterizado por redução da atividade metabólica. 
O número de células que morrem é equivalente ao número de células novas. 
 
 
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• Fase de declínio ou morte celular: Caracterizada por uma redução 
drástica do número celular, onde o número de células mortas excede o número de 
células novas. 
 
Quantificação Celular 
Para a realização de experimentos é essencial a quantificação celular, ou seja, 
dizer quantas células existem em uma garrafa de cultura. A quantificação pode ser feita 
de forma direta, através da contagem de células, ou de forma indireta, através da 
dosagem indireta de determinadas estruturas celulares, como proteínas, ou pela medição 
do metabolismo celular. 
Para quantificação direta, o método mais utilizado é a contagem em Câmara de 
Neubauer, onde as células devem estar totalmente individualizadas. 
A câmara de Neubauer é uma lâmina de vidro com divisões que auxiliam na 
contagem. Possui 9 quadrados que medem 1 mm2 de área (Figura 5). Somente os quatro 
quadrados externos são utilizados na contagem de células animais. Cada quadrado 
externo é composto por mais 16 quadrados menores. 
 
 
Fig. 5: A) Câmara de Neubauer; B) Esquema da Câmara de Neubauer 
 Para a contagem, é preciso colocar uma lamínula de vidro sobre a câmara. Isto irá 
conter a suspensão de células. O espaço formado entre a lamínula e a câmara corresponde 
A) B) 
 
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a 0,1 mm. Sendo assim, o volume determinado em cada quadrante é de 0,1mm3. As 
células contadas em um quadrante contidas em 1mL correspondem ao valor de células 
contadas multiplicadas por 104 (fator de correção da câmara). 
O número de células contadas por mL na câmara de Neubauer pode ser obtido 
através da seguinte equação: 
 
 
Para a análise de viabilidade celular, utiliza-se o corante vital azul de Trypan. 
Em células com membranas comprometidas, ocorre um fluxo de corante para o interior 
da célula, que adquire a coloração azulada. 
Em células com grande motilidade, como é o caso de Leishmania sp., utiliza-se 
solução de formalina a 4%, que mata a célula sem alterar sua estrutura. Desta forma, é 
possível fazer a contagem sem que elas se movam de um lado para o outro, correndo o 
risco de se contar a mesma célula mais de uma vez. 
 
Meios de Cultivo Celular 
Os meios nutritivos (ou meios de cultivo) são essenciais para o crescimento 
celular, pois fornecem às células carbono, energia e elementos essenciais para o seu 
crescimento in vitro. 
As mesmas vias metabólicas básicas nos organismos são consideradas nas células 
em cultivo. Para complementar as várias substancias sintetizadas pelas células, vários 
compostos são adicionados para suprir as necessidades metabólicas e energéticas das 
células. Desta forma, os meios de cultivo devem apresentar em sua composição sais 
minerais, carboidratos, vitaminas, aminoácidos e ácidos graxos (Tabela 1). Em alguns 
casos também são adicionadostambém soro, tampões, antibióticos e indicadores de pH. 
Tudo vai depender do tipo de célula que está em cultivo e qual o seu propósito com este 
Nº de células/mL = Nº total de células contadas x fator de diluição x 10
4
 
4 
 
 
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cultivo. De uma maneira geral, quanto maior a complexidade da célula em questão, maior 
será a sua exigência nutricional. 
Para definir qual melhor meio para seu cultivo é necessário consultar a literatura 
e as referências dos bancos oficiais. 
 
Tabela 1: Tabelas de componentes básicos de um meio típico 
Aminoácidos Vitaminas 
Sais 
Minerais 
Outros Proteínas 
•Arginina 
•Cistina 
•Glutamina 
•Histidina 
•Isoleucina 
•Leucina 
•Lisina 
•Metionina 
•Fenilalanina 
•Treonina 
•Triptofano 
•Tirosina 
•Valina 
•Biotina 
•Colina 
•Folato 
•Nicotinamida 
•Pantotenato 
•Piridoxal 
•Tiamina 
•Riboflavina 
•NaCl 
•KCl 
•NaH2 
•PO4 
•NaHCO3 
•CaCl2 
•MgCl2 
•Glicose 
•Penicilina 
•Estreptomicina 
•Vermelho de 
fenol 
•Soro 
• Hemina 
• Urina humana 
• Adenina 
 
•Insulina 
•Transferrina 
•Fatores 
específicos 
de 
crescimento 
Adaptado de ALVES, E.M.; GUIMARÃES, A.C.R, in Cultivo Celular. 
 
 
Cuidados no Preparo do Meio de Cultivo 
 
Para meios que apresentam em sua composição substâncias orgânicas que não 
resistem a altas temperaturas e pressão das autoclaves, convém dispor de um dispositivo 
de filtração por membrana. Para isso utiliza-se um filtro especial de acetato de celulose 
com porosidade inferior de 0,22 µm. 
 
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O processo de filtração consiste na passagem do líquido por uma 
membrana filtrante com pequenos poros que impedem a passagem de 
microrganismos. Filtros reutilizáveis podem ser esterilizados por meio da autoclavação, 
sendo os descartáveis também muito utilizados e, apesar de mais caros, o processo é mais 
rápido e mais seguro. 
A maioria dos meios de cultivo são esterilizados por meio da filtração. Contudo, 
algumas soluções podem ser esterilizadas por autoclavação a 121ºC por 15 minutos. 
Vale ressaltar que todo o processo de filtração deve ser realizado em câmara de 
fluxo laminar e após o processo de filtração deve-se testar o material filtrado para verificar 
a eficiência do procedimento. Neste caso, o meio pode ser incubado junto a outro meio 
de crescimento próprio de microrganismos ou simplesmente pode-se incubar uma 
alíquota do meio por 48h a 37ºC em estufa contendo 5% de CO2. 
 
Criopreservação 
A manutenção de linhagens celulares no laboratório requer uma série de cuidados 
e normas que devem ser seguidos minunciosamente, como mostrado anteriormente. E 
mesmo quando todos os protocolos são seguidos, ainda assim a cultura celular pode sofrer 
contaminação microbiana. Quando isso acontece, o reestabelecimento da linhagem 
celular perdida pode demandar muito tempo e pode ter alto custo, sendo ambos os fatores 
limitantes para o sucesso e continuidade da pesquisa. Dessa forma, faz-se necessária a 
existência de um banco de células, o qual será composto por congelamentos dos diferentes 
tipos celulares utilizados no laboratório de cultivo celular, devendo estes serem 
armazenados em nitrogênio líquido. 
Para a realização do congelamento celular alguns passos devem ser seguidos, 
como descrito a seguir: 
1) Escolha do agente crioprotetor. Exemplo: dimetilsulfóxido (DMSO) ou 
glicerol, que diminuem o ponto de congelamento do meio e permitem um 
congelamento lento, reduzindo o risco de formação de cristais de gelo que 
podem danificar as células e levá-las à morte. 
2) Número de células: pelo menos 90% das células a serem congeladas devem 
estar vivas a fim de que quando forem descongeladas, possam se recuperar e 
isso ocorra em um menor tempo. 
 
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3) Passagem celular: dê preferência às passagens mais baixas para o 
congelamento. 
4) Escolha do meio de congelamento: o meio de congelamento pode ser feito 
pelo próprio meio cultivo em que as células são cultivadas juntamente com o 
agente crioprotetor ou ser feito pelo soro fetal bovino junto ao agente 
crioprotetor. Observação: cada laboratório e/ou pesquisador pode estabelecer 
a % de crioprotetor a ser utilizada para cada tipo celular no meio de 
congelamento, ou esta % pode ser recomendada pela empresa de onde as 
células foram compradas. Exemplo: Macrófagos Raw 264.7 (5% DMSO); 
Leishmania braziliensis (6,5% DMSO). 
5) Temperatura: Como mencionado, o congelamento deve ser lento. Assim, é 
necessário estabelecer o tempo para que a amostra passe desde a geladeira, 
freezer, - 80ºC até o nitrogênio líquido, onde ela deverá permanecer. 
6) Criotubos: devem ser estéreis, assim como todos os materiais a serem 
utilizados para o congelamento celular. Geralmente, adiciona-se 1mL de 
cultura a ser congelada (meio de congelamento juntamente com as células). 
7) Identificação dos criotubos: cada critotubo deve ser identificado com o nome 
da linhagem congelada; qual passagem; número de células congeladas; data 
do congelamento; nome de quem congelou. 
Ao contrário do congelamento, o descongelamento celular deve ser rápido, uma 
vez que é um procedimento estressante para as células. Ao retirar o criotubo do nitrogênio 
líquido, deixe-o à temperatura ambiente ou descongele em banho-maria a 37ºC (variável 
segundo o tipo celular). Tão logo isso ocorra, transfira a cultura presente no criotubo para 
uma garrafa de cultivo, adicione o meio de cultivo e incube adequadamente. 
Observação: os procedimentos de congelamento e descongelamento são os 
mesmos para as células aderentes e para aquelas que crescem em suspensão. 
 
 
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Contaminação no Cultivo Celular 
 
A contaminação da cultura de células é um dos problemas mais comuns 
enfrentados em um laboratório de cultivo celular. Assim, como já mencionado 
anteriormente, regras e cuidados devem ser seguidos para que essa contaminação seja 
mínima e que de forma alguma se torne algo recorrente, caso contrário, haverá perda não 
só da cultura, como também de tempo e de materiais, que em geral, são caros. 
As contaminações na cultura celular podem ser químicas, como detergentes e 
impurezas presentes no meio de cultivo, no soro e na água, e contaminações biológicas, 
como bactérias, leveduras e fungos filamentosos, vírus e micoplasma. A contaminação 
cruzada por outras linhagens celulares também pode ocorrer. Essas contaminações podem 
ser introduzidas pelo próprio pesquisador, como também podem ser oriundas do ar, 
bancadas, soluções, vidrarias e outros materiais. 
Na Figura 6, observe a contaminação por fungos filamentosos de uma cultura de 
células HEK 293. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 6: Contaminação por fungos filamentosos de uma cultura de células HEK 293. 
No caso de contaminação por micoplasma, esta é de difícil detecção na rotina do 
laboratório, uma vez que essas bactérias podem sobreviver na cultura celular sem 
ocasionar a morte das outras células ali presentes e não serem visualizadas ao 
microscópio. Entretanto, alguns indícios de contaminação por micoplasma podem ser 
observados, como diminuição da proliferação das células na cultura, aglutinação celular 
no caso de células em suspensão, e ativação de macrófagos. Além disso, o meio de cultivo 
pode ficar turvo e ter o seu pH alterado repentinamente. A identificação de contaminação 
da cultura por micoplasma pode ser feita por kits, por testes enzimáticos (ELISA) e testes 
 
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moleculares (PCR). Porém, por serem métodos caros, geralmente não são 
empregados na rotina. 
 
Esterilização de Materiais para a Cultura de Células e Câmara de Fluxo 
Laminar 
 
Trabalhar com cultura de células deve ser sinônimo de ambiente estéril. Os meios 
de cultura são ricos em nutrientes que facilitam o crescimento de microrganismos 
contaminantes. Assim, TODOS os materiais utilizados no cultivo celular devem ser 
esterilizados,como pipetas, garrafas para meio de cultivo, ponteiras, água, DMSO, entre 
outros. A esterilização garante a destruição de todas as formas de vida microbiana, 
inclusive, de esporos, que são mais resistentes. Agentes físicos utilizados normalmente 
para esterilização são: autoclave, radiação ultravioleta, radiação gama e filtração. 
Autoclave: emprega o calor úmido, e geralmente, a temperatura de 121ºC por 15 
a 30 minutos garante a esterilidade dos materiais. 
Radiação UV: utiliza-se o intervalo entre 200 e 300 nm, pois tem conhecida ação 
bactericida ao causar danos no DNA. O seu uso na esterilização não é aceito por todos os 
pesquisadores, uma vez que a sua aplicação direta na superfície possui baixo poder de 
penetração. 
Radiação Gama: utilização mais comum é do 60Co ou o 137Cs. A sua eficiência 
depende de diversos fatores, entre eles, a fase de crescimento em que os microrganismos 
se encontram. Possui alto poder de penetração. 
Filtração: utilização de membranas filtrantes de 0,22 µm. Pode ser a vácuo 
(pressão negativa), que é empregada para filtragem de volumes maiores, ou por seringa 
(pressão positiva), utilizada para volumes menores. 
Em relação à utilização do álcool a 70%, este é utilizado na desinfecção de 
materiais e na assepsia das mãos e/ou braços, não garantindo, portanto, a esterilidade. É 
eficaz contra bactérias na forma vegetativa, vírus envelopados, como vírus das hepatites 
B e C, micobactérias e fungos. Não apresenta ação contra esporos e vírus não-
envelopados, como vírus da hepatite A. desnaturação proteica é a hipótese mais aceita 
para o efeito bactericida do álcool a 70%. 
 
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A manipulação das células e dos materiais para o cultivo celular é feita em câmara 
de fluxo de laminar (cabines de segurança biológica), um ambiente estéril cujo objetivo 
é proteger o operador, o meio ambiente e as amostras manipuladas. Há três tipos de 
câmara de fluxo laminar, designadas como classes I, II e III. 
▪ Classe I: entrada frontal de ar que circula dentro da área de trabalho e é aspirado 
por filtro HEPA; proteção pessoal e do ambiente. Não protege a cultura de 
contaminação. 
▪ Classe II: abertura frontal, fonte de ar e exaustão com filtro HEPA. Principal tipo 
encontrado nos laboratórios de cultivo celular e garante proteção ao operador e à 
cultura. As câmaras de fluxo laminar de classe II são projetadas para o manuseio 
de agentes pertencentes aos níveis de biossegurança (NB) NB 1 (sem risco 
conhecido de contaminação), NB 2 (risco moderado) e NB 3 (infecções sérias e 
letais). 
Classe III: câmara de contenção máxima. O sistema é totalmente fechado, com 
ventilação própria, construído em aço inox à prova de escape de ar, operando com 
pressão negativa. Utilizada para o manuseio de agentes pertencentes ao NB 4 (alto 
risco de contaminação individual). Protege o operador, a cultura e o ambiente. 
 
Análise de Viabilidade Celular e Citotoxicidade 
A detecção da viabilidade celular e a avaliação da citotoxicidade são 
frequentemente empregadas no cultivo celular quando o objetivo é a triagem de 
compostos com possível efeito sobre determinado tipo celular, como por exemplo, 
triagem de compostos com potencial efeito antiparasitário e/ou anticâncer. Ensaios 
colorimétricos in vitro como 3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio (MTT) e 
aqueles que empregam a resazurina, como o Alamar blue, são bastante utilizados para 
este fim, visto serem simples, eficientes, sensíveis e de baixo custo. 
MTT: Baseado na redução do MTT (um sal de coloração amarela e solúvel em 
água) a formazan (sal de coloração arroxeada e insolúvel em água) por desidrogenases 
mitocondriais. A redução do MTT a formazan (Figura 7) será diretamente proporcional 
à atividade mitocondrial e à viabilidade celular. A detecção é feita a 540 nm. 
 
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. 
 
 
Fig. 7: Redução do MTT a Formazan. 
Resazurina: Em sua forma oxidada, a resazurina é um corante azul. Na presença 
de atividade metabólica celular, ela é reduzida a resorufina (Figura 8), de coloração rosa, 
que pode ser medida por leitura colorimétrica a 570/600 nm ou fluorimétrica 575/585 nm. 
 
 
 
Fig. 8: Redução da Resazurina a Resofurina. 
Os ensaios de viabilidade celular e citotoxicidade empregados na triagem de 
compostos requerem alguns parâmetros de controle que garantem a funcionalidade do 
experimento. Assim, faz-se necessária a presença de um controle positivo, um controle 
negativo, células sem tratamento e meio de cultivo. O controle positivo é um composto 
conhecido capaz de matar as células de interesse; o controle negativo, que pode ser o 
DMSO (diluente dos compostos em teste), não é capaz de matar as células de interesse; 
as células sem tratamento refletem o comportamento normal destas sem a ação de 
qualquer composto e o meio de cultivo é o branco na leitura espectrofotométrica. É 
importante ressaltar, que cada composto de interesse na triagem deve ser testado em cada 
experimento, pelo menos em triplicata, a fim de garantia de reprodutibilidade, e pelo 
menos dois experimentos independentes devem ser realizados. Na Figura 9 está 
representado um experimento de toxicidade para Macrófagos RAW 264.7 feito em placa 
de 96 poços, indicando quadruplicata para os controles positivo (Anfotericina B), 
negativo (DMSO), células sem tratamento, meio de cultivo (branco) e compostos 1 e 2. 
 
 
 
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Fig. 9: Experimento de toxicidade para Macrófagos RAW 264.7 
 
CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA DE 50% (IC50) e ÍNDICE DE SELETIVIDADE 
(IS) 
 
A concentração inibitória de 50% é a medida da efetividade de um composto em 
inibir o crescimento celular em 50%. Geralmente, é determinado a partir de diversas 
concentrações, partindo-se de uma concentração mais alta, que seja capaz de matar 
totalidade das células de interesse, até uma concentração mais baixa, em que as células 
permanecem todas vivas. O IC50 reflete a eficácia de determinado composto, quanto 
maior o valor do IC50, menos eficaz é o composto; quanto menor o valor, maior a eficácia. 
O IC50 pode ser determinado após uma triagem inicial dos compostos com uma 
concentração fixa, a partir da qual ele somente será calculado para os melhores 
compostos, ou o próprio IC50 pode ser a triagem, já que várias concentrações são testadas 
ao mesmo tempo. O GraphPad Prism é um programa que pode ser utilizado na 
determinação do IC50 e requer pelo menos seis concentrações do composto teste para 
este fim. 
O Índice de Seletividade (IS) é utilizado em ensaios de citotoxicidade para avaliar 
o quanto um composto é mais eficaz contra determinado parasito sem causar danos à 
viabilidade de células mamíferos. Quanto maior o IS, mais seletivo é o composto sobre o 
parasito e menos efeito ele tem sobre as células de mamíferos. Segundo a Drugs for 
Neglected Diseases initiative (DNDi), que é uma organização sem fins lucrativos que visa 
 
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IS = IC50 células de mamíferos 
IC50 composto 
 
o desenvolvimento de novas drogas para doenças negligenciadas, incluindo as 
leishmanioses, um IS > 10 em um ensaio de infecção com Leishmania, valida 
determinado composto para testes in vivo. O IS é calculado dividindo-se o IC50 do 
composto para células de mamíferos pelo IC50 do composto para o protozoário parasito: 
 
 
 
 
 
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ANEXO 1: Protocolo de citotoxicidade em Macrófagos Raw 264.7 pelo método da 
resazurina 
Procedimentos: 
1- Preparar suspensões celulares nas concentrações de 1 x 105 células/mL, 5 x 
104 células/mL e 2,5 x 104 células/mL. Levar em consideração o número de 
poços a serem utilizados para a triagem dos compostos e o fato de que em cada 
poço, devem ser adicionados 200 µL dessas suspensões celulares. O número 
de células seguirá o tempo de avaliação da ação do composto, 24, 48 e 72 
horas, respectivamente. Quanto maior o tempo,menos células deverão estar 
em cada poço. 
2- Adicionar em cada poço, 200 µL da suspensão celular. 
3- Incubar a placa na estufa de CO2 a 37ºC por 24 horas. 
4- Retirar o meio de cultura metabolizado. 
5- Adicionar 200 µL de meio de cultivo novo. 
6 – Adicionar os compostos previamente diluídos a serem testados, bem como os 
controles. 
7- Incubar a placa na estufa de CO2 a 37ºC pelo tempo que se deseja avaliar a ação 
dos compostos: 24 horas, 48 horas, 72 horas, por exemplo. 
8- Retirar a placa da estufa e adicionar em cada poço 20 µL de resazurina. Se o 
tempo de ação do composto for 24 horas, a resazurina deverá ser adicionada na 
23ª hora; se 48 horas, a adição da resazurina deverá ser na 47ª hora; se 72 horas, 
na 71ª hora e assim por diante. O importante é adicionar a resazurina 1 hora antes 
do tempo determinado para a avaliação da ação do composto, para que ela seja 
metabolizada e seja possível fazer a leitura no tempo preestabelecido. 
9- Incubar a placa na estufa de CO2 a 37ºC por 1 hora. 
10 – Retirar a placa da estufa e proceder à leitura na leitora de microplacas. A 
leitura poderá ser colorimétrica a 570/600 nm ou fluorimétrica 575/585 nm. 
Observação: Deverão ser feitas três leituras, 1 a cada hora. 
 
A porcentagem de redução da resazurina, em cada tempo avaliado, será calculada 
segundo a fórmula a seguir para a leitura colorimétrica: 
 
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Redução da resazurina = [A570 – (A600 X R0)] 
 
 
Nessa fórmula, A570 significa a absorbância da resazurina a 570 nm, A600 equivale à 
absorbância da resazurina a 600 nm, e R0 é um fator de correção (branco), representado 
pela média das absorbâncias do controle negativo contendo somente meio de cultivo com 
resazurina. A porcentagem de células viáveis será calculada segundo a seguinte fórmula: 
 
% Células viáveis = [A570 – (A600 X R0)Tratado] x 100/ Média[A570 –(A600 X R0)]Não 
tratado 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Referências Bibliográficas: 
▪ PERES, C.M; CURI, R. Como cultivar células. Gunabara Koogan S.A., Rio de 
Janeiro, 2005. 
▪ ALVES, E.M.; GUIMARÃES, A.C.R. Cultivo Celular. Disponível em: 
<http://www.epsjv.fiocruz.br/sites/default/files/capitulo_5_vol 2.pdf> 
▪ INVITROGEN. Cell culture basics. Disponível em: 
<https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/promotions/global
/images/aai-2015/aai-pdfs/GibcoCellCultureBasicsHandbook.pdf> 
▪ Vareschini, D.T. Cultivo celular. Disponível em: <www.lance-
ufrj.org/uploads/3/2/2/5/.../aula_cultivo_celular_daniel_tait_2011_2.pdf> 
▪ Rodríguez-Hernández, C.O. et al. Cell Culture: History, Development and 
Prospects. Int.J.Curr.Res.Aca.Rev, 2014. 
▪ FIOCRUZ. Níveis de biossegurança. Disponível em: 
<http://www.fiocruz.br/biosseguranca/Bis/lab_virtual/niveis_de_bioseguranca.ht
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