Antihypertensive effect of carvacrol is improved after incorporation in β‐cyclodextrin as a drug delivery system-1-16 - Traduzido

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10.1111 / 1440-1681.13364
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DR. DARÍZY FLÁVIA SILVA (ID Orcid: 0000-0002-8746-6449)
Tipo de artigo: Artigo Original
O efeito anti-hipertensivo do carvacrol é melhorado após incorporação em
β-ciclodextrina como sistema de distribuição de drogas
Barreto, Liliane 1 , Camargo, Samuel Barbosa 1 , Moraes, Raiana dos Anjos 1 , Medeiros,
Carla Fiama 1 , Jesus, Anderson de Melo 1 , Evangelista, Afrânio 2 , Villarreal, Cristiane
Flora 2 , Quintans-Júnior, Lucindo José 3 , Silva, Darízy Flávia 1 *
Afiliação
1 Laboratório de Fisiologia e Farmacologia Cardiovascular, Universidade Federal da Bahia,
Salvador, Bahia, Brasil.
2 Faculdade de Farmácia, Universidade Federal da Bahia, Salvador, BA, Brasil.
3 Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Universidade Federal de Sergipe, Aracaju, Sergipe, Brasil.
Efeito anti-hipertensivo da β-ciclodextrina do CARV.
Artigo Aceito
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*Autor correspondente:
Darizy Flávia Silva, PhD
Laboratório de Fisiologia e Farmacologia Cardiovascular, Universidade Federal da Bahia, Avenida
Reitor Miguel Calmon, Vale do Canela, CEP: 40110-902 Salvador, Bahia, Brasil.
Endereço de e-mail: darizy@gmail.com e darizy.silva@ufba
Resumo:
Carvacrol (CARV), demonstrou possuir várias propriedades farmacológicas,
especialmente no tratamento de doenças cardiovasculares. Nós avaliamos oArtigo Aceito
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efeito anti-hipertensivo do CARV livre e encapsulamento do CARV em β-ciclodextrina
(CARV / β-CD), e se o CARV / β-CD é capaz de melhorar os efeitos anti-hipertensivos de
CARV livre em ratos espontaneamente hipertensos (SHR). Os ratos foram divididos aleatoriamente
em 4 grupos, cada um tratado diariamente por 21 dias e a pressão arterial média e o coração
a taxa foi medida a cada 5 dias: grupo 1 (solução veículo Wistar); grupo 2 (SHR-
veículo); grupo 3 (SHR-CARV 50 mg / kg / dia) e grupo 4 (CARV / β-CD 50 mg / kg / dia).
Após 21 dias de tratamento, a artéria mesentérica dos animais tratados foi testada para
sensibilidade à fenilefrina (Phe) e ao nitroprussiato de sódio (SNP). Além,
a administração de CARV / β-CD induziu importante atividade anti-hipertensiva quando comparada
com a forma não complexada, reduzindo a progressão da hipertensão arterial em SHR.
Além disso, a potência farmacológica para Phe nos grupos SHR-CARV e CARV / β-CD
foi aumentado, aproximando-se dos valores expressos no veículo wistar. Além disso,
CARV / β-CD reduziu a produção do mediador pró-inflamatório, IL-1β, e
citocina antiinflamatória aumentada, IL-10. Juntos, esses resultados produziram evidências
que o encapsulamento de CARV em β-CD pode melhorar a atividade cardiovascular, mostrando
potenciais efeitos antiinflamatórios e anti-hipertensivos.
Palavras-chave: Anti-hipertensivo, Carvacrol, β-ciclodextrinas, Reatividade vascular;
ratos espontaneamente hipertensos .
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1. Introdução
A hipertensão é um grande problema de saúde pública em todo o mundo [1] e um fator de risco
para doenças cardiovasculares (DCV). O número de adultos hipertensos aumentou
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de 594 milhões em 1975 para 1,13 bilhão em 2015, principalmente nas áreas de baixa e média
países de renda [2]. Além disso, no Brasil, cerca de um quarto da população adulta
população é relatada como tendo hipertensão [3]. Globalmente, a CVD foi responsável
por aproximadamente 17,5 milhões de mortes em 2012. Se as tendências atuais continuarem, o
o número de mortes aumentará para 22,2 milhões até 2030 [4]. Freqüentemente, hipertensão
está associada a distúrbios metabólicos, alterações funcionais ou estruturais do alvo
órgãos, que são agravados por fatores de risco comportamentais, como tabagismo, obesidade,
ingestão excessiva de sal e envelhecimento. A forma mais comum de hipertensão é
“Hipertensão essencial”, porém as causas permanecem desconhecidas [5, 6].
O tratamento da hipertensão inclui algumas classes de medicamentos, incluindo:
beta-bloqueadores, diuréticos, inibidores da enzima de conversão da angiotensina, angiotensina II
bloqueadores do receptor, bloqueadores dos canais de cálcio, inibidores da renina, alfa-adrenérgicos
bloqueadores de receptores, agentes de ação central e vasodilatadores de ação direta [7]. Apesar de
a grande variedade de opções de tratamento disponíveis para hipertensão, pressão arterial
o controle de muitos hipertensos está longe de ser adequado [8]. Infelizmente,
10,3% dos hipertensos que se tratam têm hipertensão resistente,
onde esses indivíduos correm um risco maior de danos aos órgãos-alvo, incluindo o coração
insuficiência, acidente vascular cerebral, função renal prejudicada e morte [9]. Para ampliar o tratamento
opções que podem melhorar os resultados gerais, as plantas medicinais foram investigadas
como uma nova fonte de medicamento, que normalmente provoca menos efeitos colaterais no tratamento
hipertensão [10].
As plantas medicinais têm sido usadas há séculos para tratar vários seres humanos
doenças, e suas propriedades farmacológicas estão associadas às doenças físicas
características químicas dos óleos essenciais (OE) [11]. Além disso, fenólico
monoterpenos, como carvacrol (CARV), quimicamente conhecido como 2-metil-5- (1-
metiletil) fenol, e seu isômero timol (Figura 1) são constituintes comuns de
muitos EOs. CARV é o principal composto encontrado em óleos essenciais e é produzido por
numerosas plantas aromáticas da família Lamiaceae, que inclui os gêneros
Origanum e Thymus [12, 13] . Além disso, é comumente usado pela alimentação eArtigo Aceito
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indústrias cosméticas como conservante e antioxidante. Geralmente, é reconhecido como
seguro (GRAS) para consumo e foi aprovado pelo US Food and Drug
Administração para consumo alimentar, além de ser contemplada pelo Conselho de
Europa na lista de aromatizantes químicos [14].
O CARV possui diversas ações biológicas, que incluem antinociceptiva
[15], atividades antibacteriana [16] antiinflamatória [17], antitumoral e antioxidante
[18]. Além disso, a atividade protetora e antioxidante do CARV e do timol em
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vasos sanguíneos são promovidos pela redução dos níveis de peroxidação lipídica e reativa
espécies de oxigênio, que estão associadas à redução de pró-inflamatórias
citocinas e níveis de caspase-3 em tecidos cardíacos [19]. Além disso, nossa pesquisa
grupo demonstrou que independente do endotélio induzido por CARV
vasorrelaxamento em anéis isolados da artéria mesentérica superior de rato e dose provocada
hipotensão dependente e bradicardia em ratos normotensos não anestesiados
[20].
Apesar dessas descobertas, os componentes do óleo essencial têm água limitada
solubilidade, baixa biodisponibilidade, alta volatilidade e reatividade com vários componentes
como oxigênio [21,22]. Neste contexto, as ciclodextrinas são compostos de interesse
porque eles têm a capacidade de aumentar a solubilidade e proteger encapsulado
convidados de uma condição ambiental prejudicial (temperatura, pH e luz) [23, 24].
Além disso, as ciclodextrinas podem formar complexos de inclusão solúveis em água com
compostos lipofílicos solúveis e compostos com baixa solubilidade em água, como
monoterpenóides, prolongando e aumentando a duração e a intensidade de um medicamento
efeitos [25,26,27,28].
As ciclodextrinas (CDs) são uma classe de oligossacarídeos cíclicos na forma de
cones truncados, compostos por monômeros de α-D-glucopiranose ligados por ligações α-1,4.
CDs naturais são classificados como α-ciclodextrina, β-ciclodextrina, γ-ciclodextrina que
contêm seis, sete ou oito monômeros, respectivamente. β-CD é um dos mais amplamente
CDs usados devido à formação de complexos mais eficiente e eficaz, cavidade adequada
dimensão, e são mais econômicos do que outros compostos. [29,30,28].
Portanto, com base na grande necessidade de alternativas inovadoras para tratar
hipertensão e as atividades promissoras do CARV no sistema cardiovascular, nós
teve como objetivo avaliar o efeito anti-hipertensivo do CARV complexado em β-Artigo Aceito
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ciclodextrina e estudar se a formulação complexa com β-CD melhora a
atividade farmacológica deste composto terpeno.
2. Resultados
2.1. Efeito do tratamento subcrônico com CARV e CARV / β-CD no índice de massa corporal,
ingestão de água e comida de ratos.
A influência do CARV e do tratamento com CARV / β-CD na ingestão de alimentos, água
consumo e peso corporal foram investigados. Conforme mostrado na Tabela 1, o Wistar-
os grupos de veículos e ratos espontaneamente hipertensos (SHR) não demonstraram
diferenças no ganho de peso corporal. No entanto, o consumo de água e ingestão de alimentos
os níveis foram reduzidos no grupo SHR-veículo em comparação com ratos normotensos. Dentro
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Além disso, ratos SHR tratados com CARV ou CARV / β-CD foram semelhantes quando comparados
aos grupos de veículos SHR em relação à ingestão de alimentos, consumo de água e corpo
ganho de peso.
2.2. O encapsulamento de CARV em β-ciclodextrina melhorou o anti-hipertensivo
resposta do monoterpeno
Durante o tratamento de 21 dias (1, 5, 10, 15 e 20 dias), ratos normotensos
mostrou uma redução significativa na pressão arterial sistólica e diastólica (PAS = 113,9
± 7,4; 136,9 ± 9,2; 139,7 ± 7,1; 150,3 ± 3,9; 137,22 ± 11,0 mmHg; PAD = 83,8 ± 4,6;
100,8 ± 11,1; 94,9 ± 7,4 mmHg; 110,7 ± 2,6; 102,2 ± 10,7, respectivamente, n = 9), quando
em comparação com o SHR tratado com veículo (SBP = 178,1 ± 8,0; 183,0 ± 4,6; 191,7
± 5,2; 215,6 ± 8,7; 212,4 ± 6,0 mmHg; DBP = 139,4 ± 9,8; 145,6 ± 7,1; 151,3 ± 4,7
mmHg; 175,3 ± 8,5; 167,7 ± 6,3, respectivamente, n = 7). O SHR tratado com CARV (50
mg / Kg) não demonstrou redução significativa no sangue sistólico e diastólico
pressão (PAS = 181,0 ± 4,3; 177,0 ± 4,2; 189,3 ± 7,6; 190,6 ± 6,7; 191,0 ± 5,3
mmHg; DBP = 140,3 ± 3,7; 138,5 ± 5,6; 144,5 ± 9,5; 153,1 ± 8,8; 145,6 ± 5,6 mmHg,
respectivamente n = 8), quando comparado ao grupo SHR-veículo. No entanto, o SHR
grupo tratado com a mesma dose de CARV, mas na forma complexada (CARV / β-CD
- 50mg / kg), reduziu significativamente a pressão arterial sistólica e diastólica quando
em comparação com o veículo SHR, nos dias 15 e 20 (PAS = 175,5 ± 9,5; 176,5 ±Artigo Aceito
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11,9 mmHg; DBP = 134,0 ± 10,5; 138,4 ± 10,6 mmHg, n = 8), evitando o
progressão da hipertensão em animais SHR (Figura 2A e 2B).
Além disso, nenhuma mudança significativa na frequência cardíaca (FC) foi observada entre
os grupos experimentais por 21 dias (1, 5, 10, 15 e 20 dias), veículo Wistar (HR =
285,0 ± 14,6; 310,8 ± 17,3; 293,0 ± 19,3; 302,7 ± 8,4; 277,3 ± 23,3 bpm,
respectivamente n = 9), veículo SHR (HR = 302,6 ± 12,8; 305,0 ± 18,7; 298,3 ± 15,9;
283,9 ± 18,8; 317,5 ± 14,9 bpm, respectivamente n = 5), SHR-CARV (HR = 320,4 ± 15,7;
290,7 ± 23,7; 281,3 ± 24,5; 283,1 ± 21,2; 328,6 ± 18,7 bpm, respectivamente, n = 8) e
SHR-CARV / β-CD (HR = 301,6 ± 17,24; 268,8 ± 19,2; 304,6 ± 18,5; 251,3 ± 15,7;
312,6 ± 25,5 bpm, respectivamente, n = 8) (Figura 2C).
2.3. Efeitos do tratamento subcrônico com CARV e CARV / β-CD na mesentérica
reatividade vascular da artéria
Para avaliar se o tratamento subcrônico resultou em mudanças benéficas para o
tecido vascular, experimentos foram realizados para estudar a reatividade vascular no
artéria mesentérica superior isolada de wistar e SHR, tratada com veículo, CARV
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ou CARV / β-CD. A curva de resposta à concentração de fenilefrina (10 −10 –10 −5 M) em
os anéis da artéria mesentérica de ratos wistar, tratados com veículo, mostraram um
aumento significativo na potência farmacológica de Phe (Emax = 117,5 ± 18,5 e pD 2 =
6,92 ± 0,07, n = 6), conforme demonstrado na curva de resposta à concentração que mudou
à esquerda quando comparado a SHR tratado com CARV, CARV / β-CD ou veículo
(Figura 3A). Da mesma forma, o grupo SHR tratado com CARV ou CARV / β-CD mostrou um
aumento significativo na potência farmacológica (Emax = 151,0 ± 6,0 e pD2 = 6,59
± 0,09, n = 8; Emáx = 142,3 ± 5,3 e pD2 = 6,39 ± 0,04, respectivamente, n = 5), quando
em comparação com SHR tratado apenas com veículo (Emax = 144,5 ± 9,0 e pD2 = 5,94 ±
0,04, n = 6) (Figura 3B e 3C). Ratos wistar normotensos tratados com veículo apresentaram uma
aumento significativo na potência farmacológica do SNP (pD 2 = 10,89 ± 0,40, n = 4),
quando comparado com SHR tratado com veículo, conforme observado pelo veículo SHR (pD2 =
7,68 ± 0,14, n = 7). O tratamento de SHR com CARV ou CARV / β-CD não mudou
a potência farmacológica do SNP em comparação com SHR tratado com veículo (Figura
3D, 3E e 3F). No entanto, apenas SHR tratados com CARV apresentaram redução na
eficácia farmacológica do SNP em comparação com o veículo SHR.Artigo Aceito
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2.4. O tratamento subcrônico com CARV / β-CD reduziu a IL-1β pró-inflamatória
níveis no baço de SHR.
O pré-tratamento com CARV / β-CD (50 mg / kg) induziu um efeito estatisticamente significativo
redução dos níveis de IL-1β pró-inflamatórios (3,26 ± 0,39 pg / mg, n = 7) quando comparados
para veículo SHR (8,75 ± 2,85 pg / mg, n = 5). No entanto, nenhuma mudança significativa foi
observado no CARV (3,66 ± 0,86 pg / mg, n = 5) em comparação com o veículo SHR (Figura 4).
2,5. O tratamento subcrônico com CARV / β-CD aumentou a IL-10 anti-inflamatória
níveis na aorta de SHR.
Os níveis de IL-10 foram reduzidos na aorta do veículo SHR (53,05 ± 11,5
pg / mg, n = 5) em comparação com veículo wistar(183,93 ± 19,0 pg / mg, n = 4). Pré-tratamento
com CARV / β-CD (50 mg / kg) aumentou significativamente o anti-inflamatório IL-10
níveis na aorta (178,9 ± 61,2 pg / mg, n = 6) quando comparados ao veículo SHR. Contudo,
nenhuma mudança significativa foi observada em SHR-CARV (61,97 ± 2,9 pg / mg, n = 5)
em comparação com o veículo SHR (Figura 5A). Além disso, os níveis de IL-10 foram reduzidos em
o baço SHR-veículo (46,33 ± 19,9 pg / mg, n = 4) em comparação com wistar tratado com
veículo (174,46 ± 21,1 pg / mg, n = 4). Sem mudanças significativas nos níveis de IL-10 (baço)
foram observados em SHR tratados com CARV ou CARV / β-CD (17,49 ± 3,1 pg / mg, n = 5;
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27,0 ± 5,8 pg / mg, n = 7, respectivamente) (Figura 5B).
3. Discussão
A diversidade de produtos naturais fornece uma abundância de moléculas exclusivas
com diferentes ações biológicas que podem servir para tratar uma variedade de doenças. CARV, a
monoterpeno de origem natural, apresenta atividades cardiovasculares promissoras, como
vasorrelaxamento, ações hipotensoras e antiinflamatórias [20,33,34,35,17].
No entanto, possui baixa polaridade e baixa solubilidade em água, o que restringe seu uso farmacológico
usa. Assim, a inclusão do CARV no β-CD poderia melhorar o desempenho farmacológico
atividade deste monoterpeno. Os resultados deste estudo revelaram que o CARV / β-CD
complexo teve atividades anti-hipertensivas eficazes em experimentos usando um
modelo animal de hipertensão e, mais interessante, os efeitos farmacológicos
induzido pelo monoterpeno complexado com β-CD aumentou o anti-hipertensivoArtigo Aceito
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efeitos quando comparado ao CARV não complexado, que parece estar relacionado ao
estabilidade e biodisponibilidade aumentadas fornecidas por β-CD.
CARV foi anteriormente descrito como um composto com baixa toxicidade, onde
a dose letal em ratos foi determinada como sendo 710-920 mg / kg de peso corporal
quando administrado por gavagem oral [31]. A dose letal mediana de CARV
administrado por via intravenosa ou intraperitoneal a camundongos foi estimado em 80,00
e 73,30 mg / kg de peso corporal, respectivamente. Camundongos recebendo 33,3 mg / kg de CARV
(intraperitoneal) não apresentou efeitos adversos e na dose de 50 mg / kg, inespecífico
efeitos foram exibidos, no entanto, em camundongos com doses mais altas (110-233,3 mg / kg CARV)
experimentou ataxia, diminuição da atividade motora espontânea e sonolência antes de
morte [32]. Além disso, as ações vasorrelaxantes induzidas pelo CARV não estavam relacionadas
efeitos tóxicos putativos [20].
Estudos desenvolvidos por nosso grupo de pesquisa relataram que o CARV induziu
vasorrelaxamento em anéis isolados da artéria mesentérica superior de ratos, principalmente através do
inibição do influxo de cálcio através dos canais Cav e TRP [20]. Além disso, CARV
demonstrou induzir relaxamento independente do endotélio em aorta isolada de rato
reduzindo o influxo de Ca 2+ através da membrana e a participação da voltagem
canais de potássio operados [33, 34]. Além disso, Aydin e colegas
demonstraram que o CARV promoveu hipotensão dependente da dose e bradicardia em
ratos normotensos anestesiados [35]. No entanto, devido à sua baixa polaridade e água
solubilidade, sua eficácia terapêutica é limitada. Assim, vários relatórios indicam que os CDs
pode melhorar as propriedades químicas e farmacológicas de produtos naturais derivados
drogas [36,23]. Outro monoterpeno, o linalol, complexado com β-CD apresentou uma maior
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perfil anti-hipertensivo quando comparado à forma não complicada [25]. Assim, nós
avaliado se CARV complexado em β-CD melhoraria a eficácia farmacológica
resposta quando comparada ao CARV não complexado. Os experimentos foram
realizado com ratos espontaneamente hipertensos (SHR), um modelo genético comumente
usado em pesquisas de hipertensão para representar hipertensão humana estabelecida,
permitindo assim a exploração dos mecanismos subjacentes e patologia de
hipertensão [37,38], possibilitando o estudo de novas intervenções terapêuticas.
Relatamos no presente estudo que o pré-tratamento subcrônico com
CARV não complexado (50 mg / Kg), em SHR, não resultou em uma redução significativa naArtigo Aceito
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pressão arterial média, quando comparada ao grupo controle SHR. No entanto, SHR
tratado por via oral com CARV complexado em β-CD (50 mg / Kg) diminuição da pressão arterial
e CARV / β-CD preveniu o desenvolvimento de hipertensão nestes animais quando
em comparação com SHR tratado com veículo, começando no dia 15 e permaneceu até o
conclusão do tratamento (20º dia). Ciclodextrinas (CD) são utilizadas como carreadores de drogas
para aumentar a solubilidade, estabilidade e biodisponibilidade de moléculas bioativas [22, 21].
Esses resultados sugerem que o uso de CDs de composição, como β-CD, significativamente
aumentam os efeitos farmacológicos de compostos lipofílicos, como o CARV. Dentro
desta forma, a mesma dose de CARV nas formas complexada e não complexada promoveu
resultados diferentes quando comparados ao controle SHR, portanto, especulamos que β-CD
aumentou a biodisponibilidade deste monoterpeno.
Além disso, ao longo do tratamento, mudanças significativas foram observadas em
ingestão de alimentos e água quando comparados ratos Wistar e SHR. Estudos anteriores
demonstraram que, em SHR, o sistema central da melanocortina desempenha um papel importante
nos mecanismos envolvidos nos efeitos da leptina no sistema nervoso simpático
e atividade cardiovascular, estimulando neurônios de proopiomelanocortina (POMC)
e receptor de melanocortina tipos 3 e 4 (MC3 / 4-R). Receptores MC3 e MC4 são
expresso no cérebro e ambos estão envolvidos na regulação do metabolismo energético.
O antagonismo crônico desses receptores aumenta o apetite e a ingestão de alimentos em SHR por
90% e em wistar por 125%, demonstrou que o menor ganho de peso observado em
SHR, durante o tratamento subcrônico está associado à atividade do
receptor de melanocortina [39,40]. Portanto, um ganho de peso menor não é indicativo de
efeitos adversos da administração de medicamentos, mas é característico do modelo animal
usava.
Está bem estabelecido na literatura que a hipertensão está ligada a doenças vasculares
alterações, como disfunção endotelial, aumento da contração vascular e
remodelação arterial [41]. Mudanças na reatividade vascular foram extensivamente
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descrito no estado hipertensivo [42,43]. Essas mudanças são importantes no
mecanismos que determinam a pressão arterial e sua regressão é geralmente
considerada uma meta crítica da terapia anti-hipertensiva [44]. Alguns dos alterados
fatores vasculares na hipertensão incluem: a capacidade de resposta à norepinefrina,
acetilcolina e outros neurotransmissores, bem como hiperatividade simpática.Artigo Aceito
Página 11
Apesar da hiperatividade vasomotora simpática em ratos SHR controle [45, 46],
A contração induzida por Phe foi atenuada quando comparada com wistar, como
demonstrado pelos valores de pD2, sugerindo um aumento da sensibilidade a esta contração
agente. Vale ressaltar que, conforme demonstrado em nosso estudo, o deficiente
a reatividade vascular a Phe emSHR também foi observada em outros estudos [47, 48, 49].
Kojima e colegas (1989) [50] também relataram uma diminuição no adrenoceptor α1 em
Artéria mesentérica SHR em comparação com WKY, que pode ser responsável pela
redução nas contrações induzidas por Phe. Este efeito pode ser devido a uma compensação
resposta à hiperatividade simpática direcionada aos vasos na hipertensão. Dentro
Além disso, nossos resultados demonstraram que a potência farmacológica para Phe no
SHR, tratado com CARV puro ou complexado em β-CD foi aumentado, se aproximando
valores expressos em animais normotensos. Este resultado sugere que o SHR
artérias mesentéricas superiores, tratadas com CARV ou CARV-β-CD, parecem ser
recuperando sua força contrátil e, potencialmente, reduzindo a jusante
respostas vasculares compensatórias, intrínsecas ao estado hipertensivo. Além disso, o
a potência farmacológica do SNP (agente vasodilatador, doador de óxido nítrico) não foi
significativamente alterado nos grupos SHR (tratados ou não tratados com CARV / CARV / β-
CD), sugerindo que não houve alterações na via doadora de óxido nítrico devido
ao tratamento com CARV.
A inflamação crônica da parede vascular e em outros órgãos é um importante
contribuidor para a hipertensão [51]. Além disso, o estresse oxidativo e endotelial
disfunções estão envolvidas na cascata inflamatória que contribuem para alterações de
a resposta imune, bem como um aumento na expressão da molécula de adesão,
ativação e infiltração de células imunes, liberação de citocinas e estresse oxidativo
formação. Várias citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α, IL-1β, IL-18 induzem
inflamação e outros efeitos pró-hipertensivos, contribuem para o aumento
atividade contrátil e resistência vascular periférica total, que afetam diretamente
pressão sanguínea [52, 51,53,54]. Considerando o importante papel da IL-1β durante o
resposta inflamatória na hipertensão, avaliamos o efeito do CARV e
Tratamento de CARV / β-CD nos níveis de citocinas inflamatórias. Os níveis de IL-1β em SHR eram
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reduzido por apenas tratamento CARV / β-CD, sugerindo que o complexo de inclusão
melhorou os efeitos antiinflamatórios do CARV, atenuando esse nível de citocinas.
Artigo Aceito
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Além disso, as citocinas anti-inflamatórias podem efetivamente diminuir o
geração das citocinas pró-inflamatórias [54]. IL-10 é um potente antiinflamatório
citocina e reduz a produção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-1β, TNF-α,
e IL-6 [55]. Além disso, a IL-10 endógena e exógena neutraliza a resistência vascular
disfunção e atividade da angiotensina II em camundongos hipertensos, parcialmente através da
modulação da via da cinase RhoA-Rho [56]. Desta forma, IL-10 desempenha um
papel importante na modulação da hipertensão, e formulamos a hipótese de que IL-10 poderia ser
alterado em animais submetidos ao tratamento subcrônico com CARV ou CARV / β-CD.
Assim, avaliamos os níveis de citocinas em baços macerados e aortas de wistar e
SHR, tratado por 21 dias. Os níveis de IL-10 do baço não foram alterados em SHR tratados com
CARV ou CARV / β-CD, quando comparado ao grupo SHR-veículo. No entanto, o IL-
10 níveis de aorta de SHR tratados com a forma complexada com CARV / β-CD foram
significativamente maior em comparação com o grupo de veículo SHR, sugerindo que o anti-
efeito hipertensivo induzido por CARV / β-CD pode ser devido a um aumento de IL-10
níveis de vasculatura. Uma vez que CARV / β-CD possui propriedades anti-hipertensivas e antiinflamatórias
efeitos, consequentemente essas ações podem funcionar sinergicamente para o tratamento de
hipertensão. Além disso, estudo recente sugere que β-CD aumentou a dose oral
biodisponibilidade de compostos não polares do trato gastrointestinal devido ao
aumento na solubilidade, taxa de dissolução mais rápida e estabilidade gastrointestinal [56, 57,
58]. Em nosso estudo, parece que a biodisponibilidade do CARV foi aumentada por β-CD
e os efeitos melhorados do CARV observados na pressão arterial e na vasculatura
seria devido à proteção do monoterpeno no trato gastrointestinal.
Nossos resultados demonstram que o tratamento subcrônico com CARV / β-CD reduziu
a progressão da hipertensão em SHR, produzindo um maior efeito anti-hipertensivo
quando comparado com a forma não complexa. Além disso, CARV / β-CD diminuiu IL-
Os níveis de citocinas pró-inflamatórias 1β no baço e aumentaram os níveis anti-IL-10
níveis de citocinas inflamatórias na aorta. O encapsulamento de CARV em β-CD
demonstrou um efeito anti-hipertensivo intensificado e reduziu o efeito inflamatório
efeito em comparação com CARV livre, sugerindo que é um agente potencial para o
desenvolvimento de estratégias futuras no tratamento da hipertensão.
4. Materiais e métodosArtigo Aceito
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4.1. Animais
Ratos espontaneamente hipertensos (SHR) com idades entre 8-12 semanas foram usados
ao longo deste estudo. Os ratos são do biotério da Neurociência
Laboratório, no Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia e
mantido sob temperatura controlada (21 ± 1 ° C) um ciclo claro-escuro de 12 horas (6h
às 18h), com acesso gratuito a alimentos e água. Os testes foram aprovados para uso por
o Comitê de Ética no Uso de Animais do Instituto de Ciências da Saúde, Federal
Universidade da Bahia, no âmbito do protocolo CEUA-ICS / UFBA N ° 085/2015 e o estudo
foi conduzida de acordo com o Código de Prática Australiano para Cuidados e
Uso de animais para fins científicos [ 59].
4.2. Drogas e solução
Todos os medicamentos usados nestes experimentos foram adquiridos da Sigma (Sigma-
Aldrich, St. Louis, EUA) e incluídos: nitroprussiato de sódio, (-) - fenilefrina,
cremophor, 20KI aprotinina A, EDTA, β-ciclodextrina e CARV (CARV). O PMSF
foi adquirido da thermo-Fisher scientific (Thermo-Fisher scientific Fremont,
Califórnia, EUA). Kits de ELISA de interleucina-1β (IL-1β) da R&D System (R&D System
Minneapolis, Minnesota, EUA). Para soluções de veículo, cremophor (0,003 g / ml de
solução) foi solubilizado em NaCl 0,9% (experimentos in vivo). O monoterpeno
CARV ≥ 98,0% foi solubilizado em cremophor na proporção de 2: 1 (CARV / cremophor).
Preparação e caracterização físico-química do CARV / β-CD
complexos foram preparados por três procedimentos diferentes. Uma mistura física (PM) foi
preparada pela adição de CARV (150 mg) a um almofariz de ágata contendo pó
β-CD (1.135 mg) sob agitação manual. A razão molar CARV / β-CD era
mantido conforme descrito para a preparação do complexo de inclusão (1: 1) e o
a mistura foi armazenada em recipientes de vidro herméticos. A complexação de pasta (PC) era
realizada através da homogeneização de β-CD (1.135 mg) e CARV (150 mg) emArtigo Aceito
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água (2 mL) (1,2: 4 p / v), diretamente em almofariz de ágata. O material foi então seco na sala
temperatura(em um dessecador), até a formação de um filme de vidro, que foi removido por
trituração manual e armazenada em recipientes de vidro herméticos.
A complexação da pasta (SC) foi realizada pela adição de água (20 ml) a um
copo contendo CARV (150 mg) e β-CD (1.135 mg 3: 4, v / p), que foi
equivalente à proporção de aproximadamente 1: 1 M convidado: hospedeiro, então adicionado à pasta e
agitado por 36 h. O material foi então seco e removido por trituração manual como
descrito em um estudo anterior [30].
A solução fisiológica de Tyrode foi usada em todos os experimentos, com o
seguintes composições (mM): NaCl, 158,3; KCl, 4,0; CaCl 2 , 2,0; MgCl 2 , 1,05;
NaH 2 PO 4 , 0,42; NaHCO 3 , 10,0 e glicose, 5,6, onde todos os componentes eram
adquirida da Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA).
4.3. Protocolos experimentais
4.3.1. Efeitos do CARV e do CARV / β-CD no índice de massa corporal, ingestão de água e alimentos
Ratos normotensos e hipertensos foram divididos aleatoriamente para tratamento via
administração oral, no volume correspondente de 0,1 ml / 100g de peso corporal. Durante
no tratamento de 21 dias, os ratos foram observados diariamente, e o peso corporal, água e comida
a ingestão foi medida a cada 5 dias.
4.3.2. Efeitos do CARV e do CARV / β-CD na pressão arterial e na frequência cardíaca
Ratos Wistar e SHR foram separados aleatoriamente em quatro grupos: grupo 1:
Veículo Wistar (solução salina e cremóforo); grupo 2: veículo SHR (solução salina e
solução de cremóforo); grupo 3: SHR-CARV (SHR-CARV 50 mg / Kg / dia); grupo 4:
SHR-CARV / β-CD (CARV / β-CD 50 mg / Kg / dia). Veículo, CARV ou CARV / β-CD foram
administrado por via oral. Todos os grupos receberam administração oral no
volume correspondente de 0,1 ml / 100g de peso corporal. Tratamento e pressão arterial
as medidas foram realizadas sempre pela manhã. Aproximadamente 30 min após
administração de medicamentos, pressão arterial de rato e frequência cardíaca foram indiretamente determinados por
pletismografia do punho da cauda (Insight® V2.11, São Paulo, Brasil) a cada 5 dias,
ao longo do tratamento (21 dias). Pressão arterial (sangue sistólica e diastólica
pressão) as medições foram realizadas em triplicado repetitivo e a média foiArtigo Aceito
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apresentados em figuras e resultados. Após 21 dias de tratamento, os animais estavam
sacrificados em uma câmara de CO 2 e a artéria mesentérica superior foi removida por
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estudos de reatividade vascular.
4.3.3. Efeitos do CARV e do CARV / β-CD na reatividade vascular
As artérias mesentéricas superiores foram rapidamente removidas de Wistar e SHR
(200-250 g) conforme descrito por Silva et al., 2011 [60]. Resumidamente, o mesentérico superior
a artéria foi removida e limpa de tecido conjuntivo e gordura. Anéis (2 mm) eram
obtido e colocado em solução fisiológica de Tyrode, mantida a 37 ° C, e
gaseificada com uma mistura carbogênica (95% O 2 e 5% CO 2 ). Os anéis foram estabilizados com
uma tensão ótima de repouso de 0,75 g, que havia sido determinada anteriormente.
A contração isométrica foi registrada por um transdutor de força (FORT-10; WPI, Sarasota,
EUA) acoplado a um gravador amplificador (Miobath-4, WPI, Sarasota, EUA) e a um
computador pessoal equipado com placa conversora analógica para digital. Endotelial
a remoção foi avaliada qualitativamente pela falha em relaxar à acetilcolina (1 μM)
após o tônus contrátil ser induzido por Phe (1 μM). Anéis que relaxaram menos de 10%
foram considerados endotélio desnudado, e o relaxamento de mais de 60% foi
considerado endotélio intacto. Após o washout, os anéis foram pré-contraídos
novamente com Phe (1 μM) para produzir um nível semelhante de pré-contração. Os anéis eram
submetido a uma solução de despolarização com níveis elevados de KCl 60mM antes de iniciar
os protocolos de reatividade. As curvas de concentração-resposta para Phe (10 −10 - 10 −5 M)
foram expressos como uma porcentagem da contração produzida por 60 mM KCl para cada
anel. No entanto, as respostas de relaxamento induzidas pelo nitroprussiato de sódio (SNP 10 −13
- 10 −5 M) foram expressos como a porcentagem de relaxamento em relação ao máximo
resposta contrátil induzida por Phe (10 −6 M).
4.3.4. Medições de citocinas por ELISA
Para avaliar os níveis de citocinas, o baço e a aorta foram coletados 21 dias após
tratamento e homogeneizado em solução tampão de fosfato gelado (PBS; 100 mgArtigo Aceito
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tecido / mL) com NaCl 0,4 M e inibidores de protease com PMSF 0,1 mM, 0,1 mM
cloreto de benzetônio, EDTA 10 mM e aprotinina A 20KI / 100 ml. As amostras
foram centrifugados (Hetich - Zentrifugen - Rotanta 460 R - Sigma-Aldrich, St.Louis,
EUA) por 10 min (3000g a 4 ° C) e o sobrenadante foi coletado. Interleucina-1β
(IL-1β) e os níveis de interleucina-10 (IL-10) foram estimados usando
kits de ELISA de imunoensaio para ratos (R&D System, Minneapolis, Minnesota, EUA),
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de acordo com as instruções do fabricante. O método de Bradford foi usado para
determinar a proteína total e os resultados foram expressos como pictogramas de citocinas por
miligrama de proteína.
4,4. análise estatística
Os valores foram expressos como média ± SEM Quando apropriado, estatísticas
significância foi determinada pelo teste t de Student ou ANOVA de uma via após
Pós-teste de Bonferroni, usando o software GraphPad Prism ©, versão 5.0 (GraphPad
Software Inc., La Jolla, CA, EUA). P <0,05 bilateral foi considerado estatisticamente
significativo. Os valores de efeito máximo (Emax) foram expressos como média ± SEM e
EC 50 (concentração de um agonista que produz 50% do efeito máximo possível
daquele agonista) os valores foram expressos com um intervalo de confiança. Individual
as curvas concentração-resposta foram ajustadas com a equação logística de Hill. EC 50
os valores foram obtidos como a concentração na qual uma redução pela metade do máximo no tom
ocorreu e o pD 2 foi calculado como −log EC 50 .
Agradecimentos
Este estudo foi financiado por bolsas do National Council for Scientific and
Desenvolvimento Tecnológico (CNPq, bolsa nº 454992 / 2014-9) e Coordenação
de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Código Financeiro 001.
Contribuições do autor
Conceptualização, Darizy Flavia Silva; Curadoria de dados, Liliane Barreto, Raiana dos
Anjos Moraes e Carla Fiama; Análise formal, Liliane Barreto, Samuel Camargo,
Raiana dos Anjos Moraes, Darizy Flavia Silva; Aquisição de fundos, Darizy FlaviaArtigo Aceito