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GENÉTICA Fernando Tavares Brasil Teixeira Genética é o estudo de todos os aspectos dos genes. Genes são definidos como as unidades fundamentais da informação biológica. Podem ser comparados a palavras na linguagem do processo da vida. É geralmente definido como um segmento de DNA que contém as instruções para produzir uma determinada proteína ou molécula de RNA. Controlam o fenótipo de um organismo. Íntrons: sequências intervenientes longas e não codificadoras Éxons: porções codificadoras dispersas Genoma é o conjunto de genes o elemento que contém a informação biológica nos cromossomos é a molécula de DNA. o DNA contém a informação escrita em um código genético. A sequência específica de nucleotídios constitui a linguagem do código. O DNA, como parte do cromossomo, é transmitido intacto de uma geração para a seguinte, de modo que todas as células em cada geração têm o mesmo conjunto de DNA com a mesma informação contida na sequência de nucleotídios. NUCLEOTÍDEOS Os nucleosídeos são compostos por um anel que tem nitrogênio (base) ligado a um açúcar de cinco carbonos, que pode ser tanto ribose ou desoxirribose. Os nucleotídeos são nucleosídeos que contêm um ou mais grupos fosfato ligados ao açúcar. Os que contêm ribose são denominados ribonucleotídeos, e os que contêm desoxirribose são denominados desoxirribonucleotídeos. Citosina (C), timina (T) e uracila (U) são denominadas pirimidinas, porque elas são derivadas de um anel de pirimidina com seis átomos. Guanina (G) e adenina (A) são chamadas de purinas, pois possuem um segundo anel de cinco átomos fusionado ao anel de seis átomos. DNA Estrutura Contém a informação hereditária das células. Longo polímero composto por apenas quatro tipos de subunidades nucleotídicas. Os nucleotídeos são unidos covalentemente em uma cadeia por meio dos açúcares e fosfatos, formando uma cadeia principal com açúcares e fosfatos alternados. Composto por duas fitas enroladas em uma hélice, cada cadeia ou fita é composta de quatro tipos de subunidades nucleotídicas. A forma pela qual as subunidades nucleotídicas são ligadas fornece à fita de DNA uma polaridade química (direção química). Essa polaridade da fita de DNA é indicada como extremidade 3’ e extremidade 5’. As fitas são unidas por ligações de hidrogênio entre as bases das diferentes fitas. A sempre pareia com T, e C sempre pareia com G. Em cada caso, uma base maior formada por dois anéis (uma purina) pareia com uma base de um único anel (uma pirimidina). Esses pares de purina-pirimidina são denominados pares de bases. O par G-C tem três pontes de hidrogênio, enquanto o par A-T só tem duas. (A + G) = (T + C) Complementaridade do pareamento de bases permite que esses pares de bases sejam compactados em um arranjo mais favorável energeticamente no interior da dupla-hélice. Nesse arranjo, cada par de bases possui uma largura semelhante, assim mantendo as cadeias principais de açúcar-fosfato a uma distância igual entre elas ao longo da molécula de DNA. Cada base está ligada ao átomo de carbono 1'. As duas hélices são antiparalelas, isto é, elas são orientadas com polaridades opostas. Cada dupla-hélice de DNA contém uma sequência de nucleotídeos que é exatamente complementar à sequência nucleotídica da fita antiparalela, os dois filamentos estão em orientação oposta, ou em polaridade inversa. As duas cadeias principais açúcar-fosfato antiparalelas se torcem ao redor uma da outra para formar uma dupla-hélice, contribuindo para a conformação energeticamente favorável da dupla-hélice de DNA, excluindo as moléculas de água dos espaços entre os pares de bases. A forma helicoidal do DNA depende totalmente do pareamento e do empilhamento das bases nos filamentos de polaridade inversa. A forma mais estável que resulta do empilhamento de bases é uma dupla hélice com dois tamanhos distintos de sulcos correndo em uma espiral: o sulco maior e o sulco menor. A maioria das associações DNA-proteína ocorre nos sulcos maiores. Função Cada base, A, C, T ou G, pode ser considerada como uma letra em um alfabeto de quatro letras que é usado para escrever as mensagens biológicas. Os organismos diferem uns dos outros porque as suas respectivas moléculas de DNA possuem diferentes sequências nucleotídicas e, consequentemente, diferentes mensagens biológicas. Os genes contêm as instruções para a produção de proteínas. A sequência linear de nucleotídeos em um gene deve, portanto, ser capaz de ditar a sequência de aminoácidos da proteína. As características estruturais do DNA precisam permitir uma replicação fiel. O material genético obrigatoriamente tem conteúdo informativo RNA Açúcar ribose. Os dois açúcares diferem na existência ou ausência apenas de um átomo de oxigênio. O grupo hidroxila no átomo de carbono 2' facilita a ação do RNA em muitos processos celulares importantes. Contém as bases A, G, C e U, sendo esta última capaz de parear com G e com A. As bases, formando pares de bases apenas durante o dobramento do RNA, e não durante a transcrição. Fita simples, sendo mais flexível e conseguindo formar uma variedade muito maior de formas moleculares tridimensionais complexas do que o DNA bifilamentar. Atua como carreador transitório de instruções moleculares. RNA mensageiro (mRNA): molécula de RNA traduzida no ribossomo, carrega o transcrito gênico. RNA transportador (tRNA): molécula de RNA que atua como adaptador entre aminoácido e o códon no mRNA durante a tradução. RNA ribossômico (rRNA): componente estrutural e catalítico dos ribossomos Pequeno RNA nuclear (snRNA): componente estrutural do espliceossomo, organela nuclear que excisa os íntrons dos transcritos gênicos. Pequenos RNA de interferência (siRNA) e RNA de interação piwi (piRNA): ajudam a proteger a integridade dos genomas. Os siRNA inibem a produção de vírus, enquanto eles e os piRNA impedem a dispersão de elementos de transposição para outros loci cromossômicos. Micro-RNA (miRNA): RNA unifilamentar curto que é clivado de pequenos precursores em formato de grampo e bloqueia a expressão de mRNA complementares ou parcialmente complementares, causando sua degradação ou reprimindo sua tradução. Papel na regulação da quantidade de proteínas produzidas por muitos genes eucarióticos. Transcrição constitutiva: sintetização contínua por toda a vida de tRNA, rRNA e snRNA. CROMOSSOMOS As moléculas de DNA são compactadas em cromossomos Cada cromossomo consiste em uma única e enorme molécula de DNA linear associada a proteínas que compactam e enovelam o cordão de DNA em uma estrutura mais compacta. A tarefa da compactação do DNA é realizada por proteínas especializadas que se ligam ao DNA e o dobram O complexo de DNA e proteínas é denominado cromatina. Cada célula humana contém duas cópias de cada cromossomo, uma herdada da mãe e a outra herdada do pai. Os cromossomos maternos e paternos de um par são denominados cromossomos homólogos (ou simplesmente homólogos). O único par de cromossomos não homólogos é o dos cromossomos sexuais nos homens. Cromossomo Y é herdado do pai e cromossomo X é herdado da mãe. Cariótipo: a apresentação organizada do conjunto completo dos 46 cromossomos humanos. Cromossomos contêm, além dos genes e das sequências nucleotídicas específicas necessárias para a expressão do gene normal, um grande excesso de DNA intercalante, o DNA ‘’lixo’’, atuando como material espaçador. Origem de replicação: sequência nucleotídica onde inicia a replicação do DNA Telômeros: contêm sequências repetidas de nucleotídeos que são necessárias para que as extremidades dos cromossomos sejam replicadas. Eles também protegem as extremidades da molécula de DNA, impedindo que sejam confundidas pela célula como uma quebra no DNA exigindo reparo. Centrômero: sequência especializada de DNA que permite que o cromossomo se ligue ao fusomitótico durante a fase M, de modo a deixar que uma cópia de cada cromossomo seja segregada para a célula-filha. Alguns cromossomos estão associados com determinados locais do envelope nuclear ou com a lâmina nuclear. Nucléolo: onde estão agrupadas as regiões contendo os genes que codificam os RNAs ribossômicos. Aqui, os RNAs ribossômicos são sintetizados e combinados com proteínas para formar os ribossomos. CONDENSAÇÃO DOS CROMOSSOMOS Os cromossomos devem condensar e descondensar de modo suficientemente flexível para permitir o rápido acesso de complexos proteicos a sequências especificas de DNA em diferentes regiões, para replicação, reparo ou expressão gênica. As histonas são proteínas que se ligam ao DNA e são responsáveis pelo primeiro nível fundamental de compactação da cromatina, o nucleossomo DNA de ligação: DNA exposto entre as partículas centrais Partícula central do nucleossomo individual: consiste em um complexo de oito proteínas histonas e um segmento de DNA de fita dupla, com 147 pares de nucleotídeos de comprimento, que se enrola ao redor desse octâmero de histonas. Cada uma das histonas do octâmero também possui uma cauda não estruturada de aminoácido que se projeta da partícula central do nucleossomo. Nucleossomos são adicionalmente empacotados em cima uns dos outros, formando uma estrutura mais compacta, a fibra de cromatina. Essa compactação adicional dos nucleossomos em uma fibra de cromatina depende de uma quinta histona, chamada de histona H1, que liga os nucleossomos adjacentes, formando um arranjo regular e repetitivo. A fibra de cromatina é enovelada em uma série de alças, e essas alças são adicionalmente condensadas para formar o cromossomo. Na interfase, a cromatina não está uniformemente compactada. Nas regiões que contêm os genes que estão sendo expressos, geralmente ela está mais relaxada, ao passo que nas regiões com genes silenciados ela está mais condensada. Heterocromatina: forma + altamente condensada da cromatina interfásica. Concentra-se ao redor da região dos centrômeros e nos telômeros. Eucromatina: estado mais descondensado da cromatina interfásica. Cada tipo de estrutura da cromatina é estabelecido e mantido por diferentes conjuntos de modificações nas caudas das histonas que atraem grupos distintos de proteínas não histônicas. As modificações que coordenam a formação do tipo mais comum de heterocromatina, por exemplo, incluem a metilação da lisina 9 na histona H3. Uma vez estabelecida, a heterocromatina pode se espalhar, porque essas modificações nas caudas das histonas atraem um conjunto de proteínas específicas da heterocromatina, incluindo enzimas modificadoras de histonas, que, em seguida, criam as mesmas modificações na cauda das histonas dos nucleossomos adjacentes. Essas modificações, por sua vez, recrutam mais proteínas específicas da heterocromatina, causando uma onda de propagação de cromatina condensada ao longo do cromossomo. Essa heterocromatina continuará a se espalhar, até encontrar uma barreira na sequência de DNA que impeça a propagação. Desse modo, podem formar-se extensas regiões de heterocromatina ao longo do DNA. Em razão do alto grau de compactação da heterocromatina, os genes que acidentalmente se tornam compactados na heterocromatina em geral não podem ser expressos. Essa compactação inadequada dos genes na heterocromatina pode causar doenças. Nos seres humanos, o gene que codifica a β- globina, que faz parte da hemoglobina que transporta a molécula de oxigênio, está situado próximo a uma região de heterocromatina. Se, em virtude de uma deleção hereditária do DNA, a heterocromatina se espalhar, o gene da β- globina se tornará pouco expresso, e o indivíduo desenvolve uma forma grave de anemia. O exemplo mais marcante do uso da heterocromatina para manter os genes inibidos ou silenciados seja encontrado no cromossomo X interfásico das fêmeas de mamíferos. Nos mamíferos, as células das fêmeas contêm dois cromossomos X, enquanto as células dos machos contêm um X e um Y. Uma vez que uma dose dupla de produtos do cromossomo X seria letal, as fêmeas de mamíferos desenvolveram um mecanismo para inativar permanentemente um dos dois cromossomos X em cada célula. Ao acaso, um ou outro cromossomo X em cada célula se torna altamente condensado em heterocromatina no início do desenvolvimento embrionário. REPLICAÇÃO DO DNA A deselicoidização dos dois filamentos expõe as bases em cada filamento. Cada base exposta tem o potencial para parear com nucleotídios livres na solução. Como a estrutura do DNA impõe requisitos rígidos de pareamento, cada base exposta pareia apenas com sua base complementar. Assim, cada um dos dois filamentos age como um molde para direcionar a montagem de bases complementares, de modo a reestruturar uma dupla hélice idêntica à original. O DNA é replicado pela deselicoidização dos dois filamentos da dupla hélice e pela construção de novos filamentos complementares em cada um dos filamentos separados da dupla hélice original. Cada molécula-filha deve conter uma cadeia parental de nucleotídios e uma recém-sintetizada. Esse estilo de replicação é semiconservativo. Iniciada por proteínas iniciadoras que se ligam às origens de replicação. Elas afastam as duas fitas de DNA, quebrando as ligações de hidrogênio entre as bases. Ainda que as ligações de hidrogênio coletivamente tornem a hélice de DNA muito estável, cada ligação de hidrogênio é individualmente fraca. Dessa forma, a separação de poucos pares de base por vez não requer uma grande quantidade de energia. Como o par de bases A-T só se pareia por meio de duas pontes de hidrogênio, é mais fácil quebra-lo que o de base G- T, que se pareia com três. Portanto, segmentos de DNA ricos em A-T costumam ser encontrados nas origens de replicação. Forquilha de replicação: local no qual a dupla hélice é desenrolada para produzir os dois filamentos únicos que servem como moldes para a cópia. A replicação do DNA é bidirecional, pois duas forquilhas de replicação são formadas em cada origem de replicação. Elas se afastam da origem em direções opostas DNA-polimerase III: catalisa a adição de nucleotídeos à extremidade 3’ de uma fita de DNA em crescimento, usando uma das fitas de DNA parentais como um molde, determinando qual dos quatro nucleotídeos (A, G, T ou C) será selecionado. Não se dissocia do DNA a cada vez que adiciona um novo nucleotídeo à fita em crescimento, continua se movendo ao longo da fita molde de modo gradual. A reação de polimerização envolve a formação de uma ligação fosfodiéster entre a extremidade 3’ de uma cadeia de DNA crescente e o grupo 5’-fosfato do nucleotídeo a ser incorporado, que entra na reação como um trifosfato de desoxirribonucleosídeo. Uma nova cadeia de DNA pode ser sintetizada somente na direção 5’-3’. A energia para a polimerização é fornecida pelo próprio trifosfato de desoxirribonucleosídeo: a hidrólise de uma de suas ligações de fosfato de alta energia abastece a reação que acopla os monômeros de nucleotídeos à cadeia, liberando pirofosfato. Em cada forquilha de replicação, uma nova fita de DNA está sendo produzida sobre um molde que segue em uma direção (3’ para 5’), enquanto a outra nova fita está sendo produzida em um molde que segue na direção oposta (5’ para 3’). A forquilha de replicação é, portanto, assimétrica. A fita de DNA que cresce na direção 3’-5’ é produzida descontinuamente, em pequenas porções, separadas e sucessivas – com a DNA-polimerase movendo-se para trás com respeito à direção do movimento da forquilha de replicação, de tal modo que cada novo fragmento de DNA possa ser polimerizado na direção 5’-3’. Fragmentos de Okazaki: pequenas porções de DNA resultantes, posteriormente unidas para formar uma nova fita contínua. A fita que é produzida descontinuamente é denominada fita retardada (lagging), porque o pesponto resultaem um pequeno atraso na sua síntese; a outra fita, que é sintetizada continuamente, é denominada fita líder (leading). A enzima monitora cuidadosamente o pareamento de bases entre o nucleotídeo a ser incorporado e a fita molde. Somente quando a correspondência for correta a DNA-polimerase irá catalisar a reação de adição do nucleotídeo. Quando a DNA-polimerase comete um engano e adiciona um nucleotídeo errado, ela pode corrigir o erro por meio da autocorreção (proofreading). Antes que a enzima adicione o nucleotídeo seguinte, ela confere se o nucleotídeo previamente adicionado pareia corretamente com a fita molde. Caso isso ocorra, a polimerase adiciona o nucleotídeo seguinte; caso contrário, a polimerase remove o nucleotídeo mal pareado e tenta novamente. Primase: inicia o processo, produzindo um pequeno fragmento de RNA (ácido ribonucleico) a partir da utilização da fita de DNA como um molde sem a exigência de uma extremidade com bases pareadas. Não sintetiza DNA. Esse pequeno fragmento de RNA fornece uma extremidade 3’ pareada como um sítio de início para a DNA-polimerase e atua como um iniciador (ou primer) para a síntese de DNA. Exemplo de uma RNA-polimerase. Não realiza autocorreção. Para a fita líder, um iniciador de RNA é necessário somente para iniciar a replicação na origem de replicação. Na fita retardada, novos iniciadores são necessários para que a polimerização seja mantida. O movimento da forquilha de replicação continuamente expõe bases não pareadas no molde da fita retardada, e novos iniciadores de RNA são adicionados, a intervalos, ao longo do segmento de fita simples recém-exposto. Polimerase de reparo: nuclease, ou uma DNA-polimerase, que degrada o iniciador de RNA, usando a extremidade do fragmento de Okazaki adjacente como um iniciador. Como a primase não se autocorrige, os iniciadores frequentemente contêm erros. No entanto, como esses iniciadores são feitos de RNA, em vez de DNA, eles se destacam como “cópias suspeitas”, para serem removidas automaticamente e substituídas por DNA pela polimerase de reparo. DNA-ligase: une a extremidade 5’-fosfato de um fragmento de DNA à extremidade 3’-hidroxila adjacente do seguinte Helicase: proteína de replicação que se acomoda na frente da máquina de replicação e usa a energia da hidrólise de ATP para impulsioná-la e separar a dupla-fita conforme se desloca. Proteínas ligadoras de DNA de fita simples (SSB): proteínas de replicação que se unem ao DNA fita-simples, impedindo-as transitoriamente de voltar a formar os pares de bases e mantendo-as em uma forma alongada. À medida que a helicase separa o DNA dentro da forquilha de replicação, o DNA no outro lado da forquilha fica mais firmemente enrolado. Esse excesso de voltas na frente da forquilha de replicação cria uma tensão no DNA que torna o desenrolamento da dupla-hélice crescentemente difícil e impede o movimento para frente da maquinaria de replicação. DNA-topoisomerases: As células usam essas proteínas para aliviar essa tensão. Essas enzimas produzem quebras de cadeia simples transitórias no DNA, que liberam temporariamente a tensão; a seguir, refazem essas ligações antes de se desligar do DNA. Grampo deslizante (sliding clamp): mantém a DNA-polimerase firmemente presa ao molde enquanto ela sintetiza novas fitas de DNA. Forma um anel ao redor da dupla-hélice de DNA recém-formada e, ao prender firmemente a polimerase, possibilita que a enzima se mova ao longo da fita molde sem se desprender dela, à medida que sintetiza uma nova fita de DNA. Carregador do grampo (clamp loader): desempenha a função de montar o grampo ao redor do DNA. Hidrolisa ATP a cada vez que prende um grampo deslizante ao redor de uma dupla-hélice de DNA recém-formada. Na fita líder, esse carregamento ocorre somente uma vez por ciclo de replicação. Na fita retardada, o grampo é removido e então reacoplado a cada vez que um novo fragmento de Okazaki é produzido. Primossomo: complexo proteico que contém DNA primase e DNA helicase. Replissomo: aparelho de replicação completo que se move ao longo da molécula de DNA em uma forquilha de replicação DNA polimerases não replicam o segmento de DNA terminal do filamento atrasado de um cromossomo linear. Na extremidade da molécula de DNA replicada de maneira descontínua, não haveria filamento de DNA para oferecer um grupo 3'-OH livre (iniciador) para polimerização dos desoxirribonucleotídios depois da excisão do iniciador de RNA do fragmento de Okazaki terminal. A estrutura especial dos telômeros garante um mecanismo perfeito para o acréscimo de telômeros por uma enzima que contém RNA, a telomerase. A característica específica da telomerase é o seu molde de RNA intrínseco. A telomerase reconhece a sequência de telômeros rica em G na extremidade 3' e estende-se no sentido 5'. Ela não preenche a lacuna oposta à extremidade 3' do filamento-molde; ela apenas estende a extremidade 3' dele. Depois do acrescentamento disso, a DNA polimerase catalisa a síntese do filamento complementar. Não fosse a atividade da telomerase, haveria encurtamento progressivo dos cromossomos lineares. Há correlação entre o comprimento do telômero e o número de divisões celulares antes da senescência e morte. Células com telômeros mais longos sobrevivem por mais tempo - dividem-se mais vezes - que as células com telômeros mais curtos. Às vezes, observam-se células somáticas que adquirem a capacidade de proliferar indefinidamente em cultura, e demonstrou-se que essas células imortais têm atividade de telomerase, ao contrário de suas progenitoras. Progérias, doenças hereditárias caracterizadas por envelhecimento prematuro. Na forma mais grave de progéria, síndrome de Hutchinson-Gilford (Figura 10.35), a senescência - surgimento de rugas, calvície e outros sintomas do envelhecimento - começa imediatamente após o nascimento, e geralmente há morte na adolescência. Essa síndrome é causada por uma mutação dominante no gene codificador da lamina A, proteína que participa do controle do formato dos núcleos nas células. Não se sabe por que essa mutação causa envelhecimento prematuro. Em uma forma menos grave de progéria, a síndrome de Werner, a senescência começa na adolescência, e a morte geralmente sobrevém na faixa de 40 anos. A síndrome de Werner é causada por uma mutação recessiva do gene WRN, que codifica uma proteína participante dos processos de reparo do DNA. Mais uma vez, ainda não sabemos como a perda dessa proteína causa envelhecimento prematuro. No entanto, as células somáticas de indivíduos com as duas formas de progéria têm telômeros curtos e apresentam menor capacidade proliferativa em cultura, o que é compatível com a hipótese de que o encurtamento do telômero contribui para o envelhecimento. SÍNTESE DE PROTEÍNAS Dogma central da biologia molecular: as informações genéticas geralmente fluem (1) de DNA para DNA durante sua transmissão de uma geração para outra e (2) do DNA para a proteína durante a expressão fenotípica em um organismo. Um filamento de DNA de um gene é usado como molde para sintetizar um filamento complementar de RNA, denominado transcrito gênico. A sequência de nucleotídios no transcrito gênico é convertida na sequência de aminoácidos no produto gênico polipeptídico Essa conversão é controlada pelo código genético. Código genético: especificação de aminoácidos por trinucleotídios, chamados códons, no transcrito gênico. TRANSCRIÇÃO É a transferência das informações genéticas do DNA para o RNA Pode ser reversível: vírus tumorais de RNA que utilizam conversão do genoma com a transcriptase-reversa A síntese de RNA ocorre por um mecanismo semelhante ao da síntese de DNA, à exceção de que: (1) Os precursores são trifosfatos de ribonucleosídios, em vez de trifosfatos de desoxirribonucleosídios; (2) Só um filamento de DNA é usado como molde para a síntese de uma cadeia de RNA complementar; (3) É possível iniciarnovas cadeias de RNA sem necessidade de um filamento iniciador preexistente. A molécula de RNA produzida será complementar (idêntica ao filamento não molde de DNA, exceto pela uracila em vez de timina) e antiparalela ao filamento-molde de DNA. Filamentos sense de RNA: filamentos de moléculas de mRNA codificadores. As sequências de nucleotídeos neles "fazem sentido", já que especificam sequências de aminoácidos das proteínas que são os produtos gênicos. RNA antisense: molécula de RNA complementar a um mRNA. O acréscimo de ribonucleotídios ocorre no grupo 3 '-hidroxila na extremidade da cadeia, na direção 5’-3’. Durante a síntese, o crescimento do RNA ocorre sempre no sentido 5' para 3'. Como os filamentos complementares de ácidos nucleicos são orientados em oposição, o fato de o RNA ser sintetizado de 5' para 3' significa que o filamento-molde tem de ser orientado de 3' para 5'. A reação compreende um ataque nucleofílico do grupo 3'-OH ao átomo de fósforo nucleotidil (interno) do trifosfato de ribonucleosídio precursor, com eliminação de pirofosfato. Essa reação é catalisada pelas RNA polimerases. As RNA polimerases ligam-se a sequências nucleotídicas específicas chamadas promotoras. Os promotores estão situados do lado 5' (antecedente) do ponto de início da transcrição. Unidade de transcrição: segmento de DNA transcrito para produzir uma molécula de RNA O processo de transcrição é dividido em três estágios (no núcleo): (1) Iniciação de uma nova cadeia de RNA; (2) Alongamento da cadeia e (3) Término da transcrição e liberação da molécula de RNA nascente Upstream: regiões situadas em direção à extremidade 5'. Downstream: regiões situadas em direção à extrem. 3'. RNA-polimerases I e III: transcrevem os genes que codificam os RNAs transportadores, os RNAs ribossômicos e vários outros RNAs RNA-polimerase II: transcreve os genes que codificam proteínas e miRNAs Fatores de transcrição: dão início à transcrição, associando-se a cada promotor, em conjunto com a polimerase. Separam a dupla-hélice do DNA para expor a fita molde. A montagem começa com a ligação do fator geral de transcrição TFIID a um segmento curto da dupla-hélice do DNA constituído principalmente por nucleotídeos T e A, chamado TATA box, provocando uma grande distorção local na dupla-hélice de DNA, a qual atua como uma marca sinalizadora para a subsequente montagem e agregação de outras proteínas sobre o promotor. Encontra-se localizado 30 nucleotídeos (-30 pb) antes do sítio de início da transcrição. A proteína de ligação a TATA (TBP), parte do complexo TFIID, um dos seis GTE (general transcription factor), quando ligada ao TATA boxe, atrai outros GTF e o cerne da RNA polimerase II, formando o complexo de iniciação de transcrição completo ou complexo de pré-iniciação (PIC). Depois, a RNA-polimerase é liberada do complexo para iniciar a transcrição. Essa liberação é iniciada pelo fator geral de transcrição TFIIH, que adiciona grupos fosfato à sua “cauda”, o domínio carboxila terminal (CTD). Apenas a forma desfosforilada da RNA-polimerase II é capaz de dar início à síntese de RNA. O CTD é composto de muitas repetições de uma sequência de sete aminoácidos, as quais repetições servem como sítios de ligação para algumas das enzimas e outras proteínas que são necessárias para o revestimento do RNA, a recomposição e a clivagem seguidos pela poliadenilação. Os fosfatos na sua cauda são removidos no final da transcrição por proteínas-fosfatase, e a polimerase está disponível para buscar um novo promotor. Antes que possa ser exportado para o citoplasma um RNA eucariótico deve passar por três etapas de processamento do RNA. As enzimas responsáveis pelo processamento são transportadas sobre a cauda fosforilada e processam o transcrito à medida que ele emerge da polimerase, tratando-se de um processamento cotranscricional. 1. Capeamento do RNA: modificação da extremidade 5’ do RNA pela adição de guanina contendo um grupo metila. 2. Poliadenilação: inserção de uma estrutura especial na extremidade 3’ do mRNA recentemente transcrito. A extremidade 3’ de um mRNA eucarioto é inicialmente clivada por uma enzima que corta a cadeia de RNA em uma sequência determinada de nucleotídeos. O transcrito é então modificado por uma segunda enzima que adiciona uma série de repetições de nucleotídeos adenina (A) à extremidade cortada. Essas duas modificações aumentam a estabilidade da molécula de mRNA, facilitando a sua exportação do núcleo para o citoplasma e identificam a molécula de RNA como um mRNA. Elas também são utilizadas pela maquinaria de síntese de proteínas, antes do início da síntese, como um indicador de que ambas as extremidades do mRNA estão presentes e, consequentemente, de que essa mensagem está completa. Alguns genes eucarióticos que codificam proteínas não possuem íntrons, e alguns têm apenas poucos íntrons; mas a maioria desses genes possui numerosos íntrons, aplicando-se tanto ao DNA quanto às sequências correspondentes no RNA. Os íntrons são removidos de pré-mRNAs pelo splicing (encadeamento) do RNA e seus éxons são unidos Cada íntron contém poucas sequências nucleotídicas curtas essenciais que direcionam sua remoção do pré-mRNA. Essas sequências especiais encontram-se nos limites do íntron ou próximas a eles, e são idênticas ou bastante similares entre todos os íntrons. Guiada por essas sequências, uma maquinaria de splicing (spliceossomo) remove o íntron sob a forma de uma estrutura em “laço”. O splicing do RNA é realizado em grande parte por moléculas de RNA, as snRNAs, que estão unidas a proteínas adicionais para formar pequenas ribonucleoproteínas nucleares (snRNPs), as quais reconhecem sequências de sítios de splicing pelo pareamento de bases complementares entre os seus componentes de RNA e as sequências no pré-mRNA. Splicing alternativo: processamento de transcritos realizados por splicing sob diferentes formas, cada uma delas levando à produção de uma proteína distinta, permitindo, portanto, que diferentes proteínas sejam produzidas a partir de um mesmo gene. Acredita-se que cerca de 95% dos genes humanos sofram splicing alternativo. Permite que os eucariotos elevem astronomicamente o potencial de codificação de seus genomas. TRADUÇÃO Transferência de informações do RNA para as proteínas. Sempre irreversível Ocorre nos ribossomos, constituídos de três a cinco moléculas de RNA e de 50 a 90 proteínas diferentes. Códon: Cada grupo de três nucleotídeos consecutivos sobre o RNA, e cada um especifica um aminoácido. Código genético: as regras pelas quais a sequência de nucleotídeos de um gene, passando por uma molécula intermediária de mRNA, é traduzida na sequência de aminoácidos de uma proteína. 1. Cada códons especifica um aminoácido. 2. Como existem 4 × 4 × 4 = 64 combinações possíveis de três nucleotídeos e só 20 aminoácidos encontrados em proteínas, o código é redundante ou degenerado. 3. O mesmo código genético é usado por quase todos os organismos da atualidade, sendo chamado de quase universal. As mitocôndrias têm as suas próprias maquinarias de replicação de DNA, de transcrição e de síntese proteica, que operam independentemente das maquinarias correspondentes do restante da célula, e essas organelas foram capazes de acomodar pequenas alterações àquele que é um código genético praticamente universal. No caso de fungos e protozoários, as similaridades do código são muito superiores às poucas diferenças. Os códons de uma molécula de mRNA não reconhecem diretamente os aminoácidos por eles codificados: o grupo de três nucleotídeos não se liga diretamente ao aminoácido, requerendo moléculas adaptadoras que podem reconhecer e ligar-se ao códon, por um sítio sobre sua superfície, e ao aminoácido, por um outro sítio, os tRNA. Os tRNAs dobram-se em uma estrutura tridimensional que se assemelha a uma folha de trevopor intermédio do pareamento de bases entre diferentes regiões da molécula. Uma dessas regiões forma o anticódon, um conjunto de três nucleotídeos consecutivos, que sofre pareamento com o códon complementar sobre a molécula de um mRNA. A outra é uma região curta, de fita simples, que se situa na extremidade 3’ da molécula; esse é o sítio onde o aminoácido que é codificado pelo códon se liga covalentemente ao tRNA. Aminoacil-tRNA-sintetases: enzimas que acoplam covalentemente cada aminoácido ao seu conjunto adequado de moléculas de tRNA, promovendo o reconhecimento e a ligação do aminoácido correto. Há uma enzima sintetase diferente para cada aminoácido. Isso significa que existem 20 sintetases ao todo. A reação catalisada pela sintetase que liga o aminoácido à extremidade 3’ do tRNA é uma acoplada à liberação de energia pela hidrólise de ATP e produz uma ligação de alta energia entre o tRNA carregado e o aminoácido, a qual é posteriormente usada para ligar o aminoácido covalentemente à cadeia polipeptídica em crescimento. Ribossomos Compostos por uma subunidade grande e uma subunidade pequena que se encaixam para a formação do ribossomo completo. As contrapartes eucarióticas são chamadas de 40S e 60S, e o ribossomo completo denomina-se 80S. A subunidade ribossômica pequena pareia os tRNAs aos códons do mRNA, ao passo que a subunidade grande catalisa a formação das ligações peptídicas que unem os aminoácidos uns aos outros, formando a cadeia polipeptídica. Essas duas subunidades se reúnem sobre uma molécula de mRNA, próximo de sua extremidade 5’, para iniciar a síntese de uma proteína. Quando a síntese é finalizada, as duas subunidades do ribossomo se separam. Contêm três sítios de ligação para moléculas de tRNA, denominados sítio A (de aminoacil), sítio P (de peptidil) e sítio E (de saída, exit). Cada tRNA ligado une as subunidades 30S e 50S, posicionado com seu anticódon na primeira e sua extremidade aminoacil (que leva o aminoácido) na última. Centro decodificador: região adicional a qual garante que apenas os tRNA que levam anticódons que se ajustam aos códons serão aceitos no sítio A. Centro peptidiltransferase: local no 50S onde a formação da ligação peptídica é catalisada. Ou seja, a subunidade maior funciona como uma ribozima para catalisar a formação da ligação peptídica. Na chegada ao citoplasma, o mRNA é geralmente coberto por proteínas, e algumas regiões podem ter dupla hélice devido ao pareamento de bases intramolecular, tendo de ser removidas para expor o códon iniciador AUG. Essa remoção é feita por fatores de iniciação da tradução chamados elF4A, B e G, que se associam à estrutura do cap, à subunidade 40S e ao tRNA iniciador para formar um complexo de iniciação. Uma vez no lugar, o complexo move-se no sentido 5'-3' e desenrola as regiões com pareamento de bases. Ao mesmo tempo, a sequência exposta é percorrida à procura de um códon AUG onde possa começar a tradução. Um tRNA iniciador, carregado com metionina, é inicialmente inserido no sítio P da subunidade ribossômica pequena. Apenas o tRNA iniciador carregado é capaz de se ligar firmemente a esse sítio na ausência da subunidade ribossômica grande. Em seguida, a subunidade pequena carregada com o tRNA iniciador liga-se à extremidade 5’ de uma molécula de mRNA. Todas as proteínas recentemente sintetizadas possuem uma metionina como o primeiro aminoácido, removido posteriormente, na sua extremidade N-terminal, a extremidade onde é iniciada a síntese de uma proteína. A subunidade ribossômica pequena então se move para frente (5’-3’) sobre o mRNA, à procura do primeiro códon AUG. Quando encontrado e reconhecido pelo tRNA iniciador, vários fatores de iniciação dissociam-se da subunidade ribossômica pequena abrindo caminho para a ligação da subunidade grande e para a montagem completa dele. Antes que os aminoacil-tRNA possam ser usados na síntese de proteínas, eles se associam ao fator EF-Tu para formar um complexo ternário composto de tRNA, aminoácido e EF-Tu. Quando há uma correspondência correta, o ribossomo muda de forma, EF-Tu deixa o complexo ternário e as duas extremidades aminoacil são justapostas. O fator EF-G ajusta-se ao sítio A. Sua entrada nesse sítio muda os tRNA nos sítios A e P para os sítios P e E, respectivamente, e o mRNA move-se pelo ribossomo, de modo que o códon seguinte é posicionado no sítio A. Quando EF-G deixa o ribossomo, o sítio A está aberto para aceitar o complexo ternário seguinte Códons de terminação: sinalizam o fim da tradução, sendo estes UAA, UAG e UGA. Não são reconhecidos por um tRNA e não especificam um aminoácido, mas sinalizam o término da tradução para o ribossomo. Fatores de liberação: proteínas que se ligam a qualquer códon de terminação que chegue a um sítio A do ribossomo, alterando a atividade da peptidil-transferase, fazendo com que seja catalisada a adição de uma molécula de água, em vez de um aminoácido ao peptidil-tRNA, o que libera a extremidade carboxila do ribossomo. Geral: o tRNA adequadamente carregado penetra no sítio A por pareamento de bases com o códon complementar que se encontra na molécula de mRNA. Seu aminoácido é, então, ligado à cadeia peptídica crescente, parte da qual entra em uma estrutura tipo túnel na subunidade 50S, mantida em posição pelo tRNA que se encontra no sítio P adjacente. Em seguida, a subunidade ribossômica grande desloca-se para frente, movendo o tRNA usado para o sítio E antes de ejetá-lo. Os macrolídios são uma fanu1ia de compostos estruturalmente similares que incluem os antibióticos populares eritromicina e azitromicina. Esses antibióticos inibem a síntese de proteínas parando o ribossomo no mRNA. Eles fazem isso ligando-se a uma região específica no RNA 23S na grande subunidade ribossômica e bloqueando o chamado túnel de saída por onde o polipeptídio nascente emerge dessa subunidade. As bactérias patogênicas que desenvolveram resistência a alguns desses antibióticos parecem ter mutações ribossômicas que tornam o túnel de saída maior. A modificação que marca uma proteína para ser degradada é o acréscimo de cadeias de múltiplas cópias de uma proteína chamada ubiquitina à e-amina dos resíduos lisina (processo conhecido como ubiquitinação), processo realizado pelo proteossomo, uma maquinaria protease.
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