ANÁLISE DA CAPTAÇÃO E LIBERAÇÃO DE GLUTAMATO NO TECIDO RETINIANO EM DIFERENTES SOLUÇÕES POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOMEDICINA
ANÁLISE DA CAPTAÇÃO E LIBERAÇÃO DE GLUTAMATO NO TECIDO RETINIANO EM DIFERENTES SOLUÇÕES POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA.
ADRIELLE THAIS MONTEIRO DOS SANTOS
BÁRBARA VERENA DIAS GALVÃO
DANNIELE OZÓRIO VULCÃO
LAIANE NAZARÉ SILVA DO NASCIMENTO
LEONARDO ADSON OLIVEIRA FERREIRA 
RAFAEL RODRIGO LIEUTHIER DA SILVA
BELÉM-PARÁ
2014
ADRIELLE THAIS MONTEIRO DOS SANTOS
BÁRBARA VERENA DIAS GALVÃO
DANNIELE OZÓRIO VULCÃO
LAIANE NAZARÉ SILVA DO NASCIMENTO
LEONARDO ADSON OLIVEIRA FERREIRA 
RAFAEL RODRIGO LIEUTHIER DA SILVA
ANÁLISE DA CAPTAÇÃO E LIBERAÇÃO DE GLUTAMATO NO TECIDO RETINIANO EM DIFERENTES SOLUÇÕES POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA.
Relatório de aula prática apresentado na disciplina Biofísica do curso de Biomedicina da Universidade Federal do Pará como parte do procedimento didático.
Professor: Dr. Anderson Manoel Herculano Oliveira da Silva
BELÉM-PARÁ
2014
SUMÁRIO
1.	INTRODUÇÃO	4
1.1	Objetivo	4
2 MATERIAIS E MÉTODOS	5
2.1 Materiais utilizados	5
2.2 Preparo das soluções	5
2.3 Retirada do tecido retiniano por dissecação	6
2.4 Incubação da retina	7
3	RESULTADOS	8
4	DISCUSSÃO	9
5	CONCLUSÃO	10
BIBLIOGRAFIA	11
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1. INTRODUÇÃO
O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório do SNC, e é armazenado em vesículas nos neurônios pré-sinápticos. O glutamato é extremamente importante para o cérebro pois executa funções como aprendizagem e memória. Para que essa função seja executada com perfeição as células da glia mantem mecanismos que carregam o glutamato da fenda sináptica de volta para as vesículas do neurônio pré-sináptico. A liberação do glutamato é feita por exocitose da vesícula que contém o neurotransmissor e é induzida por um processo dependente de cálcio. Já a sua retirada da fenda sináptica é dada por transportadores de recaptação do glutamato que se localizam nas terminações nervosas das células pré-sinápticas e na membrana plasmática das células da glia. Esse processo é dependente de sódio e esses transportadores possuem alta afinidade pelo glutamato, nas células gliais enzimas degradam glutamato em glutamina que é reciclado em terminações nervosas próximas para sintetizar novas moléculas de glutamato para a utilização em novas sinapses. Nas células gliais o glutamato também pode entrar no ciclo de krebs e sofrer oxidação se transformando em alfa-cetoglutarato que é consumido para repor o alfa-cetoglutarato consumido na síntese intracelular do glutamato.
1.1 OBJETIVO
O objetivo da aula prática em questão foi analisar as variações na quantidade de glutamato liberada pelo tecido retiniano em diferentes soluções, que possuem componentes iônicos que alteram o funcionamento neuronal, relacionando este fenômeno com o conteúdo estudado nas aulas teóricas de fisiologia celular.
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 MATERIAIS UTILIZADOS
· Luvas descartáveis
· Agulha hipodérmica
· 2 seringas de 5ml 
· Papel de filtro 
· Tubo de Centrifugação Tipo Falcon 50ml
· Pipetas Pasteur Descartáveis 3ml
· Microtubo de Centrifugação Tipo Eppendorf
· Placa de cultura de 12 poços
· Bureta
· Erlenmeyer
· Lâminas de bisturi 
· Pinça anatômica
· Tesouras cirúrgicas
· Espátula
· Quetamina
· Xilazina
· NaCl 
· KCl
· MgCl2
· EDTA 
· Glicose
· HEPES 
· LiCl 
· Glutamato 
· Água destilada
· 2 ratos Wistar
· Balança analítica
· HLPC
2.2 PREPARO DAS SOLUÇÕES
Inicialmente, foram fornecidas quatro tabelas com a molaridade, a massa molar e o volume de solvente para cada Hank. Em seguida, foi feito o cálculo das massas de cada soluto necessárias no preparo das soluções, utilizando a fórmula da molaridade: M = m (g) / MM x V(L). Foi feita uma tabela com o resultado dos cálculos para facilitar no momento das pesagens.
	Reagentes
	Molaridade
	Massa para 50ml
	NaCl
	128 mM
	0,374g
	KCl
	4 mM
	0,014g
	MgCl2
	1 mM
	0,004g
	EDTA
	2 mM
	0,037g
	Glicose
	12 mM
	0,108g
	HEPES
	20 mM
	0,238g
	KCl
	60 mM
	0,223g
	CaCl2
	2 mM
	0,015g
	LiCl
	128 mM
	0,271g
Obtidos os valores, os reagentes a serem pesados foram separados e a balança foi ligada na voltagem correta e calibrada, começaram as pesagens.
Como uso de luvas, foi retirado um pedaço pequeno de papel filtro, para colocar na balança. A balança foi fechada e foi feita a taragem. O frasco do reagente foi aberto, retirou-se um pouco com a espátula e colocou-se cuidadosamente sobre o papel filtro. Repetiu-se o processo, acrescentando ou retirando o reagente até chegar-se à massa desejada.
Despejou-se os solutos pesados em um tubo de centrifugação tipo Falcon de 50ml para cada Hank, devidamente identificado, mediu-se o volume de solvente necessário com o auxílio da bureta e despejou-se no frasco com soluto, fechou-se o tubo para solubilizar a solução.
Repetiu-se os processos para cada Hank e depois os frascos foram devidamente armazenados.
2.3 RETIRADA DO TECIDO RETINIANO POR DISSECAÇÃO
Primeiramente, já de luvas, preparou-se uma dose de 5 µl de quetamina. Em seguida, imobilizou-se o rato, traçou-se uma linha imaginária em seu peritônio e aplicou-se o anestésico, com a seringa inclinada aproximadamente em 10°. Esperou-se de 5 a 10 minutos para fazer efeito. Em seguida animal foi morto por deslocamento cervical, segurando-o entre a cabeça e o ombro e puxando-o pela base do rabo.
Para a retirada da retina, imobilizou-se o olho do camundongo com a pinça anatômica, posteriormente fez-se um corte na direção da orelha para o focinho com a lâmina de bisturi e removeu-se o olho com a pinça. Separou-se o cristalino da retina, e colocou-se esta, no primeiro poço da placa de cultura.
Repetiu-se o processo neste e no segundo animal até obter-se 4 retinas, cada uma em um poço na placa devidamente enumerada em R1, R2, R3 e R4.
2.4 INCUBAÇÃO DA RETINA
 
Com a pipeta Pasteur, as retinas foram lavadas na placa de cultura com Hank Na+ por três vezes, cada lavagem com duração de cinco minutos. Incubou-se com glutamato por dez minutos. Repetiu-se a lavagem com Hank Na+. Cada retina foi incubada com uma das soluções preparadas (Hank Na+, Hank Li+, Hank EDTA e Hank KCl) por dez minutos. Por fim, a parte líquida de cada placa foi retirada, e estas foram colocadas em seus respectivos microtubos para passarem posteriormente pelo HLPC. 
3 RESULTADOS
4 DISCUSSÃO
O presente estudo descreve a captação e liberação do glutamato no tecido retiniano. Na literatura se evidenciam dois sistemas diferentes de transporte do glutamato, sendo um Na-dependente (PALACIN et al.,1998; YASUSHI et al., 2004) e outro dependente de cloreto e Na-independente (BANNAI,1986; SATO et al., 2002); analisando os resultados pode-se afirmar que o meio contendo KCl promoveu maior transporte do que os demais e quando comparado ao controle (EDTA) a quantidade de glutamato transportada foi maior no meio com KCl. No meio sem sódio foi onde ocorreu a menor liberação. A variação da quantidade liberada ocorre porque os íons Na+, K+, Cl- e Ca+2 alteram o comportamento da célula. Vale ressaltar que a amostra foi encubada com Hank EDTA, acarretando assim um bloqueio nos canais de cálcio, prejudicando a liberação de alguns neurotransmissores como a acetilcolina, já que esses dependem da sinalização a qual o influxo de cálcio faz parte.
5 CONCLUSÃO
Com base nos resultados obtidos nesse trabalho, pode-se concluir que a liberação quântica de glutamato no tecido retiniano é variável em cada HANK. Isto deve-se ao comportamento que os íons de cada solução determinam na célula, visto que estes interferem na fisiologia celular. Vale ressaltar que o meio com KCl foi o que alcançou o maior valor quanto a liberação.
BIBLIOGRAFIA
BERNE, R. M.; LEVY, M. N. Fisiologia. 6. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2009.
MORAES, E. R. S. Caracterização da cinética de captação do glutamato por cromatografia líquida de alta eficiência em tecido retiniano. 2011. 68 f. Tese (Mestrado). Programa de Pós-graduação em Neurociências e Biologia Celular, Universidade Federal do Pará. Belém, 2011.