cromatografia liquida de alta eficiencia(clae)

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Cromatografia 
Cromatografia é um método de separação que relaciona o tempo de 
migração de diferentes substâncias. Estas substâncias (presente na amostra) 
interagem com a substância presente na coluna. 
Este método é eficiente na separação de amostras complexas e pode ser 
acoplado a outros métodos de análise. 
Mas qual é o princípio da técnica? É uma técnica de separação de 
misturas por interação diferencial dos componentes entre uma fase 
estacionária e uma fase móvel. 
- fase estacionária: líquido ou sólido que está dentro da coluna (revestindo 
ou recheando a coluna), no geral tem uma característica mais polar; 
- fase móvel: líquido ou gás que se move na coluna (também chamada de 
eluente); 
Com relação à fase estacionária, ela tem, geralmente, uma característica 
mais polar do que a fase móvel. Quando a fase móvel é mais polar do que a fase 
estacionária, chamamos a fase estacionária de fase reversa. 
As substâncias que serão analisadas (soluto) são carregadas pela fase 
móvel, na medida em que elas percorrem a coluna (eluição), elas (as 
substâncias) interagem com a fase estacionária. Diferentes substâncias irão 
interagir de diferentes formas com a coluna (mais ou menos – interação 
diferencial), levando a substância a percorrer a coluna por um maior (maior 
interação) ou menor tempo (menor interação). 
No momento em que o analito (substância) sai da coluna, o detector faz 
uma medida de tempo e de quantidade (que está relacionada com o tamanho do 
pico). 
E como um cromatograma é construído? O cromatograma é apresentado 
como um gráfico que relaciona tempo e intensidade de sinal (que está 
relacionado com a quantidade de analito, picos mais intensos indicam maior 
quantidade de analito) (Figura 1). 
 
 
Figura 1. Cromatograma. 
 
Picos bem separados e bem definidos indicam maior seletividade e 
eficiência da coluna. 
Parâmetros importantes: 
tempo de retenção (tr) 
tempo que a amostra leva para sair da coluna: tr 
maior, afinidade com fase estacionária; tr menor, 
afinidade com fase móvel 
tempo morto (tm) 
tempo que a fase móvel leva para chegar ao final 
da coluna 
tempo de retenção 
corrigido (tr’) 
tempo que a amostra leva para sair da coluna a 
partir da saída da fase móvel 
Eficiência da coluna (N 
– número de pratos 
teóricos) 
N = 16 (tr/wb)², onde wb é a medida da largura da 
base do pico. Quanto maior N, maior a eficiência 
da coluna 
 
As análises por cromatografia podem ser classificadas por: 
1) Suporte: coluna, planar 
2) Método de separação das substâncias: adsorção, partição, troca iônica, 
exclusão por tamanho, afinidade (análise de enzimas e substratos) 
3) Natureza da fase móvel: gasosa, líquida, supercrítica 
4) Objetivo: analítica, preparativa (purificação e produção) 
 
Cromatografia Líquida 
 
O que é cromatografia líquida? É um método de separação de 
componentes químicos de uma amostra por uma fase líquida móvel e por uma 
fase estacionária que pode ser líquida ou sólida. Percebam então que o nome 
da técnica está relacionado com o estado da fase móvel. 
A cromatografia de alta eficiência (HPLC) pode ser classificada segundo 
seu mecanismo de separação: 
- partição (líquido – líquido) 
- adsorção (líquido – sólido) 
- troca iônica 
- por exclusão (tamanho de partículas) 
- por afinidade (enzima – substrato) 
Quais são as vantagens do método de análise? 
Vantagens Desvantagens 
Rapidez Alto custo 
Alta resolução 
necessidade de experiência no 
manuseio 
Análise quantitativa 
Sensibilidade (ppm – ppb) 
versátil 
automação 
 
Condições importantes de análise: 
- a amostra precisa ser solúvel na fase móvel; 
- quantidade mínima detectável: 10-9 g; 
- capacidade analítica de até 50 componentes. 
A fase móvel deve apresentar alto grau de pureza ou facilidade no 
processo de purificação, dissolver sem decompor a amostra, não pode 
decompor nem dissolver a fase estacionária, precisa ser compatível com o 
detector de análise. O sistema de eluição, que compõe a fase móvel, pode ser 
isócrito (constituição do solvente permanece constante) ou gradiente (a 
composição é alterada ao longo da análise). 
A coluna deve ser produzida a partir de material inerte (por ex., aço inox) 
e resistente à pressão de trabalho, além de ter diâmetro interno uniforme. As 
medidas típicas de uma coluna são: comprimento de 10 – 30 cm; diâmetro de 2 
– 5 mm e recheio com número de partículas de 3 – 10 µm. 
Os detectores devem identificar e quantificar o analito. Não existe detector 
universal, mas, sim, detectores aplicáveis a um tipo de analito e, desta forma, 
existem diferentes detectores que fazem a leitura a partir de diferentes princípios 
de análise (luz UV/VIS, fluorescência, espalhamento de luz, índice de refração, 
eletroquímico e espectrômetro de massas). Por outro lado, todo detector deve 
ter alta sensibilidade, ser de fácil operação, não pode destruir o soluto e precisa 
gerar uma resposta rápida e constante. 
 
Texto construído com base nos vídeos da disciplina de Análise instrumental, UNIVESP: 
https://www.youtube.com/watch?v=5HX901YGNNg, https://www.youtube.com/watch?v=NHjv8EsZxHQ