Cromatografia - exercício

Prévia do material em texto

Exercício de 
avaliação 
 
 
1. Em um estudo de uma amostra vegetal foi utilizado cromatografia 
em camada delgada com eluição em gradiente para tentar identificar 
a presença de uma determinada substância na amostra A, sendo que 
na amostra P é utilizado um composto conhecido puro. Cite exemplos 
de fase móvel que podem ter sido utilizados na ordem de eluição. 
Observando a imagem abaixo, o que você tem a dizer comparando A 
com P? Numere as substâncias como quiser e explique quem tem 
menor Rf e qual a mais lipofílica. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fase móvel: hexano ou ácido acético. 
 Os componentes que formam a amostra (A) eluem de forma 
ascendente em diferentes velocidades e se separam devido às interações com 
a fase móvel e com a fase estacionária. O padrão (P) corresponde a uma 
substância química pura vinculada a apenas uma mancha. A amostra é 
composta por, no mínimo, três substâncias, e uma delas possivelmente é a 
mesma substância do padrão utilizado, uma vez que a segunda mancha da 
amostra tem a mesma altura de eluição em relação a mancha do padrão. 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARAÍBA 
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE 
DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA 
COMPONENTE CURRICULAR: Fitoquímica 
PROFESSOR: Harley da Silva Alves 
ALUNO: Anna Júlia de Souza Freitas 
1 
2 
3 
 Tendo em vista que o fator de retenção (Rf) é definido como a razão 
entre a distância percorrida pela mancha do componente e a distância 
percorrida pelo eluente, a ordem de Rf é A3>A2>A1, sendo o P semelhante em 
Rf ao A2, então provavelmente são a mesma substância. 
 A A3 é a substância mais lipofílica. A fase móvel é composta por solventes 
apolares, portanto lipofílicos, e a substância A3 está sendo carregada devido a 
sua afinidade pela fase móvel apolar, apresentando, então, a mesma 
característica. 
 
2. Liste duas fases estacionárias comuns usadas em cromatografia 
em coluna. Qual(is) fase(s) móvel(is) pode(m) ser usada(s)? 
 Duas fases estacionárias comuns são a sílica e a alumina. Em relação à fase 
móvel, podem ser utilizados compostos em sua maioria orgânicos, como 
clorofórmio, éter de petróleo, hexano, etanol e acetona. Em alguns casos, a 
água também é utilizada. 
 
3. Qual o principal pré-requisito de uma amostra para uma análise em 
cromatografia líquida de alta eficiência? 
 A amostra deve ser solúvel na fase móvel. 
 
4. Explique o que é cromatografia de fase normal e de fase reversa. 
Qual a diferença na eluição dos componentes? 
 
 Cromatografia de fase normal: a fase estacionária está ligada a grupos 
polares, logo, é mais polar que a fase móvel. O solvente mais polar tem força 
eluente maior. 
 Cromatografia de fase reversa: a fase estacionária contém grupos apolares 
ligados, sendo menos polar que a fase móvel. O solvente menos polar tem 
força eluente menor. 
 
5. Quais as principais características da fase móvel em CLAE? 
 A fase móvel utilizada nesse tipo de cromatografia devem dissolver a 
amostra sem qualquer interação química entre ambas, possuir alto grau de 
pureza ou ser de fácil purificação, para que se possam fazer análises de alta 
sensibilidade, pois as impurezas podem interferir na detecção do analito por 
ultravioleta (UV). Além disso, a fase móvel deve ser compatível com o 
detector empregado e, também possuir polaridade adequada para permitir 
uma separação conveniente dos componentes da amostra. 
6. Explique a diferença de eluição isocrática e por gradiente de solvente 
em uma análise de CLAE. 
 A eluição isocrática é uma eluição com fase móvel formada por um único 
solvente ou por uma mistura de solventes de composição constante. Já a 
eluição por gradiente é uma eluição com fase móvel formada por uma mistura 
de solventes, com composição variável ao longo da separação. 
7. Na imagem abaixo existe uma representação de um cromatógrafo 
líquido de alta eficiência. Fale sobre os componentes e os principais 
cuidados que o analista deve ter para preservar a vida útil deste 
equipamento. 
 
 Reservatório de fase móvel: Recipiente contendo fase móvel que será 
bombeada dentro do sistema analítico. É imprescindível que a fase móvel possua alto grau 
de pureza ou seja de fácil purificação, para que não cause danos a bomba, ademais, deve 
haver filtração antes do armazenamento da fase móvel no reservatório, e a escolha do filtro 
se dá de acordo com a natureza na fase móvel, usualmente utiliza-se membranas de nylon 
(0,20 e 0,45 m), celulose (0,22 m) ou TEFLON (1 e 1,5 m). 
 Sistema de bombeamento de fase móvel: Sistema de bombeamento para que 
a fase móvel consiga migrar com vazão constante para a fase estacionária, uma vez 
que é fundamental que a vazão seja constante para separações por CLAE. A bomba 
não deve ser corroída pelas fases móveis empregadas, portanto, materiais nobres são 
utilizados para a construção da mesma, como sede de safira e esfera de rubi. 
Sistema de injeção: Realiza a injeção da amostra no sistema com precisão e 
exatidão adequada, devido a válvulas especiais que permitem introdução de volumes 
de maneira bastante precisa. 
Coluna cromatográfica: O equipamento usa colunas de aço de material 
polimérico, com um comprimento de 5 a 30 cm e um diâmetro interno de 1 a 5 mm. 
Essas colunas têm custo elevado e se degradam com facilidade pela ação de poeira 
ou de partículas sólidas presentes na amostra e no solvente e pela adsorção 
irreversível de impurezas, também provenientes da amostra ou do solvente. A 
entrada da coluna principal é protegida por uma pequena pré-coluna contendo a 
mesma fase estacionária presente na coluna principal. O dispositivo de alocação da 
coluna é termostatizado. 
Detector: O detector é um dispositivo conectado na saída da coluna que 
percebe a presença de componentes e emite um sinal elétrico a ser registrado na 
forma de um pico, gerando um cromatograma, cuja área é proporcional a quantidade 
do componente analisado. Há vários tipos de sistemas de detecção, como 
ultravioletas, índice de refração, eletroquímico, evaporativo com espalhamento de 
luz, espectrometria de massa, dentre outros. 
Sistema de aquisição e registro de dados: O sinal do detector é recebido e 
registrado por um computador que processa, armazena, e reproduz dados. 
Atualmente utilizam-se softwares que permitem, além do processamento dos dados 
de cromatograma, controlar a composição da fase móvel e a vazão da bomba, 
amostrador automático, temperatura da coluna, entre outras funcionalidades. 
 
 A fim de prolongar a vida útil do equipamento, deve-se ater ao uso de 
materiais e substâncias com as características adequadas, como já citado; evitar ação 
de impurezas ou partículas impróprias ao sistema; as manutenções devem ser 
frequentes e realizadas de maneira preventiva, e o analista deve estar qualificado a 
usar o equipamento. 
8. Por que a cromatografia gasosa é uma das técnicas analíticas mais 
utilizadas e qual sua principal limitação? 
 Por possuir alto poder de resolução, permitindo a análise de muitos 
componentes de uma única amostra, inclusive a partir de pequenas 
quantidades de amostra. Sua utilização, no entanto, é limitada a separação e 
análise de misturas cujos constituintes sejam substâncias voláteis e estáveis 
termicamente. 
9. Em cromatografia gasosa, explique a função do gás de arraste e 
quais as características desse gás para uma separação adequada. 
O gás de arraste é utilizado para transportar a amostra através da 
coluna da cromatografia gasosa. O gás deve ser inerte, para que não reaja 
com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento, sendo os 
gases mais utilizados o hélio, o nitrogênio, argônio e o hidrogênio. Ele 
também deve ser compatível com o detector e possuir alto grau de pureza. 
 
11. Cite as principais características das amostras utilizáveis em 
cromatografia gasosa e fale como ocorre a separação 
cromatográfica em um cromatógrafo a gás. 
 Geralmenteas amostras utilizáveis são gases e misturas cujos 
constituintes sejam volatilizáveis, ou seja, que não degradem em altas 
temperaturas. 
 A amostra, por injeção, é introduzida em uma coluna contendo a fase 
estacionária. A injeção pode ser feita com ou sem divisão da amostra que está 
sendo injetada. O uso de temperaturas no local da injeção da amostra e na 
coluna permite a vaporização dessas substâncias e, de acordo com suas 
propriedades físico-químicas e as propriedades da fase estacionária, são 
retidas em diferentes tempos, chegando ao final da coluna e atingindo o 
detector. A separação é feita em uma coluna, contendo a fase estacionária, que 
pode ser sólida ou líquida, e que por ela passa um fluxo contínuo de gás inerte 
(fase móvel) em um forno com temperatura controlada. Quando a amostra é 
inserida no injetor, cada componente da amostra presente na fase móvel e na 
estacionária é direcionado para o detector, pois estes são transportados por 
essa corrente de gás. As substâncias presentes na amostra são separadas e 
quando atingem o detector geram um sinal para um sistema de registro e 
tratamento de dados. 
12. Em uma análise de uma amostra por cromatografia gasosa foi 
observado a presença de cinco picos, como podemos observar no 
cromatograma abaixo: 
 
Explique como o ajuste da temperatura do forno pode melhorar a 
separação cromatográfica. 
 O tempo que o analito leva para percorrer a coluna depende da temperatura. 
O aumento de temperatura aumenta a pressão de vapor e a velocidade de 
migração das moléculas, e o analito passa a eluir mais rapidamente. Ao se 
aumentar a temperatura, os picos têm um tempo de retenção menor, devido a 
maior volatilização. Se o forno é configurado a uma temperatura muito alta, 
pode haver sobreposição dos picos, dificultando a identificação de cada 
amostra, pois o ideal para análise é que os picos estejam separados e bem 
definidos. A programação de temperatura do forno pode ser feita de maneira 
a variar linearmente, iniciando a baixas temperaturas (isotermicamente por 
determinado intervalo de tempo) e aumentar aos poucos, para que os 
compostos sejam volatilizados gradativamente, e dessa forma, os picos sejam 
organizados. 
 
12 - Durante a caracterização de compostos fenólicos presentes no pó da erva 
mate, um pesquisador obteve um cromatograma com sete compostos 
identificados (Tabela 2). O mesmo realizou as análises com Alíquotas (10 
μL/amostra), as quais foram injetadas em cromatógrafo líquido (Shimadzu LC- 
10), equipado com coluna de fase reversa (Shim-pack C18, 4,6 mm x 250 mm, 
5μm), termo-estabilizada a 40°C, detector UV-visível (Shimadzu SPD 10A, λ = 
280 nm) e sistema com processador de dados. Como fase móvel, uma solução 
de água:ácido acético:η-butanol (350:1:10, v/v/v) foi utilizada com fluxo de 0,8 
mL/min (VIEIRA et al., 2009). Diante da análise do método utilizado e 
correlacionando com os dados da tabela 2, indique quais os compostos com 
maior e menor polaridade (de acordo com o tempo de retenção)? E justifique o 
uso da coluna de fase reversa para tal análise. 
 
 
 
 
Componentes organizados dos mais polares aos menos polares: ácido gálico, 
ácido clorogênico, ácido p-cumárico, ácido siríngico, ácido caféico (3,4 
dihidroxicinâmico), ácido ferúlico, ácido 4,5 dicafeoilquínico. 
Utilizou-se a fase reversa por ser um método rápido, no qual há o equilíbrio do 
sistema e a eluição de diversos compostos (hidrossolúveis e/ou iônicas até substâncias 
lipofílicas). O tempo de retenção aumenta com a adição de solvente apolar à fase móvel 
e diminui com a introdução de solventes hidrofóbicos.