AULA 5 Provas Bioquímicas e Enterobacterias

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TESTES BIOQUÍMICO
Prof. Antonio Carlos
 Identificação de microrganismos;
 Tratamento;
 Epidemiologia – fontes de infecção - rastreabilidade
 Desenvolvimento de produtos biotecnológicos;
 Capacidade de metabolização de substratos particulares;
 Presença de enzimas específicas;
 Indicadores para a identificação de uma bactéria.
IMPORTÂNCIA
 UM TESTE BIOQUÍMICO PODE DISTINGUIR GÊNEROS E ESPÉCIES
Provas rápidas – seg. a min.
Catalase
 É uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio (3%) em oxigênio e água;
 Indispensável na identificação de cocos Gram positivos;
 Estafilococos são catalase positivos;
 Estreptococos são catalase negativos;
 Exceto os estreptococos, a maioria das bactérias aeróbias e anaeróbias decompõe o peróxido de hidrogênio
Testes de Metabolismo
Prova da Catalase
Controle positivo: Staphylococcus aureus
Controle negativo: Streptococcus spp.
O teste da catalase não tem qualquer aplicação na distinção do grupo Enterobacter pois todos são catalase (+)s.
Coagulase
 Presença desta enzima indica patogenicidade
 Na presença de plasma, os produtores de coagulase, como o Staphylococcus aureus, vão desencadear os mecanismos da coagulação
 Proteína de composição química desconhecida, com atividade semelhante a protrombina, capaz de transformar o fibrinogênio em fibrina (coágulo)
 Diferenciar espécies de Staphylococcus (S. aureus e S. epidermidis)
Testes de Metabolismo
-
+
Coagulase
Oxidase
 Tetrametil-p-fenilenodiamina (1% segundo Kovacs)
 Citocromo oxidase do tipo AA3
 Diferenciar os gêneros Neisseria e Pseudomonas (oxidase positiva) de outros cocos Gram - ; 
 Distinguir a família Enterobacteriaceae (oxidase negativa) de outros bacilos Gram negativos (oxidase positiva);
Testes de Metabolismo
Prova da Oxidase
Interpretação do Teste
Azul (Púrpura): reação +
Rosa: reação – 
Provas lentas – 24 h ou mais
 Enterobacteriaceae (Gram –)
 A- Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella fermentam lactose 
 produzindo ácido e gás
 B- Shigella e Salmonella não utilizam lactose em seu metabolismo. 
 Degradam a peptona formando amônia.
Testes de Metabolismo
 Enterobacteriaceae (Gram –)
Testes de Metabolismo
A
B
A
Ágar MacConkey - contém bile que inibe o crescimento da maioria das bactérias Gram +, cristal violeta (inibe algumas bactérias Gram +) e vermelho neutro (indicador de pH), lactose e peptona.
 
 Diferenciação de Salmonella e Shigella
 
Testes de Metabolismo
Ágar XLD – Xilose, lisina e deoxicolato (ácido biliar). Meio seletivo usado para isolamento de Salmonella e Shigella a partir de amostras clínicas e alimentos. Contém phenol red como indicador de pH (ácido – amarelo; alcalino – rosa a vermelho). Salmonella metaboliza o tiosulfato produzindo H2S que reage com o ferro produzindo um composto escuro (centro da colônia negro). 
PROVAS IMViC
Indol , Vermelho de Metila, Voges-Proskauer, Citrato
 Esta série de quatro provas permite identificar um organismo do grupo coliforme.
IMViC - Enterobactérias
Teste de Indol (reativo de Kovacs)
Detecta a ação da enzima triptofanase, determinando a capacidade do microrganismo produzir Indol através da degradação do aminoácido L-triptofano. Após a incubação, adiciona-se o reativo de Kovacs (p-dimetil aminobenzaldeído). O indol se complexa ao reativo de Kovacs produzindo um anel rosa.
Reação positiva
Reação Negativa
IMViC - Enterobactérias
Teste de MR – Vermelho de metila
Reação negativa
Reação positiva
pH >6,2 – Amarelo (negativo)
pH< 4,4 – Vermelho (positivo)
- O Vermelho de Metila é o indicador de pH;
- O teste é utilizado na verificação da produção de grandes quantidades de ácidos, como o ácido pirúvico no metabolismo da glicose;
- As enterobactérias usam o ácido pirúvico para produzir outros ácidos como ác.lático, ác.acético e ác.fórmico.
IMViC - Enterobactérias
Teste de Voges-Proskauer (produção de acetoína)
Verifica a capacidade do microrganismo em produzir ácidos como o Acetilmetilcarbinol (acetoína) como um precursor da síntese de 2,3 butanediol. Adiciona-se NaOH que reage com a acetoína produzindo um composto vermelho.
Reação negativa
Reação positiva
IMViC - Enterobactérias
Teste de Citrato de Simmons
Diferencia os microrganismos pela capacidade de usarem o Citrato como única fonte de carbono. Azul de bromotimol como indicador de pH
Para que a bactéria possa utilizar o citrato é necessário que ela tenha a Citrato permease, que vai permitir a entrada desse composto no interior da célula;
Uma vez incorporado, o citrato será degradado pela enzima Citrase, produzindo compostos alcalinos.
Enterobactérias
Alguns testes bioquímicos para Enterobactérias
Bioquimismo - Salmonella spp.
Teste da Uréia:
Uréia alcalina:
PROF. ANTONIO CARLOS JÚNIOR
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Principais gêneros e espécies
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Enterobacteriaceae
A
B
C
A: Escherichia coli
B: Salmonella typhi
C: Proteus mirabilis
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E. coli
S. typhi
S. dysenteriae
P. mirabilis
K. pneumoniae
Y. pestis
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Escherichia coli
Theodor Escherich (1885) - Bacterium coli commune
Microbiota intestinal normal
1935 => Diarréias
Indicador de contaminação fecal (“coliformes fecais”)
E. coli diarreiogênicas: EPEC, EHEC, ETEC, 
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Cepas são classificadas em sorogrupos e sorotipos, de acordo com a presença dos antígenos O, K e H;
antígenos O - localizados na parede
antígenos K - localizados na cápsula
- antígenos H - localizados nos flagelos
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Grupos de E. coli virulentos
E. coli enteroagregativas (EAEC): adesão à mucosa; diarreia aquosa
E. coli enterohemorrágicas (EHEC): produtora de verotoxina, colite hemorrágica, síndrome hemolítico-urémico; col. sorbitolnegativas; testes serológicos específicos (carne mal cozinhada)
E. coli enteroinvasivas (EIEC): disenteria com sangue e leucócitos nas fezes;
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Grupos de E. coli virulentos
E. coli enteropatogênicas (EPEC): adesão mediada cromossómicamente perda das vilosidades, diarreia aquosa aguda/crónica do RN
E. coli enterotoxigênicas (ETEC): diarreia viajante e crianças países em desenvolvimento; exotoxinas promovem adesão e aumentam AMPc, com produção diarreia aquosa (idêntico V. cholerae)
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EPEC (Enteropatogênica): humanos
EHEC (Enterohemorrágica):
		humanos e animais (bovinos)
		carne moída mal passada
		águas, verduras, legumes, frutas
		sucos fermentados
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EPEC: Cultivo em meios seletivos (MacConkey)
	padrão de adesão, testes bioquímicos e 		moleculares
EHEC: MacConkey com sorbitol (sem lactose)
	PCR
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Klebsiella
Presente por vezes trato respiratório e nas fezes sem
causar problemas
Espécies mais frequentes: K. pneumoniae, K. oxytoca, K. planticola e K. terrigena
Por vezes têm cápsula bem desenvolvida.
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Citrobact
e
r
 
freundii*, divers
u
s*
 
Edwardsiella
 
tarda
 
Enterobacter
 
aerogenes*cloacae*
 
Escherichia
 
coli*, ferguson
i
i,
 
hermannii
 
Hafnia
 
alvei
 
Klebsie
l
la
 
pneumoniae*, oxytoca*
 
Morganella
 
morgan
i
i*
 
Proteus
 
mira
b
il
i
s*,
 
vulgaris*,
 
penneri*
 
Providencia
 
rett
g
e
ri*,
 
stuar
t
ii*,
 
alca
l
ifacie
n
s*
 
Salmone
l
la
 
enterica*, gomboni
 
Shigella
 
dysente
r
iae,
 
flexneri*,
 
boydii,
 
sonnei*
 
Serratia
 
marcescens*, liqu
e
faciens*
 
Yersinia
 
enteroco
l
i
t
ica*,
 
pseudotuberculo
s
i
s
,pestis
 
 
	Citrobacter
	freundii*, diversus*
	Edwardsiella
	tarda
	Enterobacter
	aerogenes*cloacae*
	Escherichia
	coli*, fergusonii, hermannii
	Hafnia
	alvei
	Klebsiella
	pneumoniae*, oxytoca*
	Morganella
	morganii*
	Proteus
	mirabilis*, vulgaris*, penneri*
	Providencia
	rettgeri*, stuartii*, alcalifaciens*
	Salmonella
	enterica*, gomboni
	Shigella
	dysenteriae, flexneri*, boydii, sonnei*
	Serratia
	marcescens*, liquefaciens*
	Yersinia
	enterocolitica*, pseudotuberculosis, pestis