Imunoensaios e suas aplicações

Prévia do material em texto

28/02
IMUNOENSAIOS 
IMUNOENSAIOS LÍTICOS
Marcados e não marcados
Presença ou ausência de hemólise
Complemento
Toxinas hemolíticas
Sistema Complemento
- Composto por proteínas solúveis que reagem entre si para opsonizar os patógenos e induzir uma série de respostas inflamatórias que auxiliam no combate à infecção
- Podem agir através de 3 vias: Via Clássica, via lectina e via alternativa
CH50
- Quantifica a atividade total do complemento sérico (via clássica)
- Aumentam em resposta a processos inflamatórios, infecciosos e autoimune.
- Diminuem ou estão ausentes no hipercatabolismo, deficiência hereditária ou consumo por formação de imunocomplexos.
- Avalia a atividade funcional desta via
- O termo CH50 se refere ao método clássico da hemólise em tubo.
- O resultado do CH50 é o recíproco da última diluição do soro do paciente capaz de promover a lise de 50% dos eritrócitos de carneiro sensibilizados com IgG de coelho.
- Hemolisina: soro do coelho com anticorpos anti-hemácias de carneiro
- Quanto mais titulação tiver e tiver muito hemólise, mais 
Reação de fixação do complemento (RFC)
1ª etapa: interação Ag-Ac na presença de complemento
2ª etapa: adição do sistema indicador (Hc+hemolisina)
Identificação de anticorpo ou antígeno
Difícil execução: reagentes padronizados
Uso: doença de Chagas, sífilis, neurocisticercose
- A hemólise significa que é negativo pois não tinha anticorpo.
Inibição da hemólise
Fundamento do teste baseia-se na inibição da hemólise produzida pela estreptolisina O quando esta entra em contato com seu anticorpo correspondente.
Ex: ASLO
CONJUGADOS
Conjugados – duas substâncias que unidas covalentemente e permanecem com as propriedades funcionantes
- Ligante
- Marcador
Sistema heterogêneo (fase sólida) ou homogêneo (meio liquido, CALDEIRÃO) 
Imunofluorescência
Antígenos ou anticorpos conjugados a mol. reveladoras chamadas fluorocromos
Visualização em microscópio de fluorescência
Subjetividade da leitura
Impossibilidade de automação
Tipos:
 Imunofluorescencia direta
Aplicações:
- Detecção direta de microrg. (secreções, urina, cortes de tecidos)
- Identificação de subpopulações de linfócitos;
- Fenotipagem de cél. tumorais
- Ex: sífilis
Imunofluorescencia indireta
Aplicações:
- Detecção de Ac específicos contra diversos microrg.
- Detecção de tipos diferentes de Ac.
- Diagnóstico de doenças auto-imunes
Fluorescência Polarizada – FTIA
Muito utilizada para detectar haptenos, como drogas
Ag ligados aos fluorocromo
Uma única etapa – sem lavagens
Maior intensidade da polarização
Menor a quantidade de Ag
O negativo vai ser polarizado
Citometria de fluxo
Aplicações:
- Caracterização de populações celulares.
- Contagem de microg.
- Separação de acordo com densidade, tamanho e granulosidade
- Análise de proliferação celular.
RADIOIMUNOENSAIOS
Anticorpo ou antígeno marcados com radioisótopos
Por muito tempo foi o mais sensível
Bom para detectar hormônios (quantidades muito pequenas)
Desvantagens: Gastos com biossegurança, meia-vida dos radioisótopos e necessidade de medidas especiais para descarte
Quantificação de antígenos:
- Método competitivo com Ag marcado
· Ac - Ag marcado + Não marcado (amostra) – Medir radiotividade
· Quanto maior a radioatividade, menos Ag o paciente tinha (amostra)
· Se o marcado “ganha”, o paciente tá perdendo
- Método competitivo com Ac marcado
· Ag na fase sólida – Ag marcado + Ag (amostra) – Medir radioatividade
· Negativa maior radioatividade
· Alta radioatividade, baixo Ag do paciente
- Método Sanduíche com Ac marcado (Captura do Ag)
 Também chamado de imunorradiométrico (IRMA)
· Ac – Ag (amostra) – Anti-Ag marcado – Medir radioatividade
· NÃO É COMPETITIVO
· Positivo maior radioatividade
IMUNOENZIMÁTICO (EIA)
Imunoenzimático homogêneo
· Meio líquido
· Uma fase
· Sem lavagens
· Detecção de haptenos
· A função da enzima deve ser modulada pela ligação ao anticorpo
Competitivo
Quanto mais cor eu tiver, mais enzima livre e mais Ag do paciente (+)
Imunoenzimático heterogêneo
· Fase sólida
· Necessário lavagens
· A enzima não muda após a ligação Ag-Ac
· Medição feita por densidade óptica da solução por espectrofotometria
· Enzimas mais utilizadas – peroxidase e fosfatase alcalina
· Ensaios conseguem quantificar Ag ou Ac
· O uso de anticorpos monoclonais resulta em maior especificidade
ELISA:
 Quantificação de Ag:
- Direto 
· Amostra do vírus na superfície – Ac com enzima conjugada é ligado ao Ag viral – Interação substrato e enzima criam mudança de cor para detecção
· Quanto mais cor, mais Ag tinha
- Método competitivo com Ag marcado
· Substrato tem mais cor na – pq o Ag tem mais marcados com enzima
· Quanto mais Ag no paciente, menos cor eu tenho
· Quanto mais cor menos Ag no paciente
- Método Captura do Ag (sanduiche)
· Ac adsorvido à placa – Adição de amostra com Ag fúngico – Adição de enzima conjugada ao Ac – Adição de substrato – COR
· Substrato oxida
Elisa 
Quantificação de ac: indireto (não competitivo) e captura de IgM
Western blot
1- extração e quantificação das proteínas
2- fracionamento das proteínas da amostra em um gel de poliacrilamida
3- transferências dessas proteínas para uma membrana
4- incubação da membrana com um ac para detectar a proteína específica a ser analisada 
5- revelação dessa membrana para análise dos dados
Quimioluminescencia 
Mais sensíveis que os imuno enzimáticos coloridos
Reagentes empregados com luminescentes, ex o substrato
Emitem luz a partir de uma reação química
Luminol e o peróxido de hidrogênio
Emitem luz entre 2seg a 20min
Facilidade de automação
Medida por um lumiometro, fotomultiplicador ou filme fotográfico
Pode detectar antígenos (em minhas quantidades) ou Ac
Muito utilizado para detecção de hormônio e marcadores tumorais