ELISA: Princípios, Metodologia e Aplicações

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CENTRO UNIVERSITÁRIO DO NORTE – UNINORTE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ELISA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Manaus – AM 
2020 
Veida Carolina Reis Azevedo – 03106207 
Kerciany Santiago de Souza – 03112045 
Raimunda Romana dos Reis Gonçalves – 03044852 
Lidiane Costa Bandeira – 03107265 
Nathalya Alves Barbosa – 03108275 
Rachel de Castro Macedo – 03112142 
Edmilson Mateus de Oliveira - 03116911 
Gabriel Silva – 03195971 
Daniele Vasconcelos Kenesse - 03054877 
Gabriela dos Santos Maciel - 03174566 
 
 
ELISA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Prof.ª: Alexander Leonardo 
 
Manaus – AM 
2020 
Trabalho apresentado ao curso 
de Biomedicina, na disciplina 
de Análises Clínicas 3, do 
Centro Universitário do Norte, 
para obtenção de nota na 2° 
ARE. 
SUMÁRIO 
 
1 ELISA ........................................................................................................ 
1.1 Princípios ................................................................................................ 
1.2 Metodologia............................................................................................. 
1.3 Aplicações .............................................................................................. 
1.4 Vantagens & Desvantagens .................................................................... 
1.5 Materiais ................................................................................................. 
1.6 Curiosidades ........................................................................................... 
2 Citometria de Fluxo ................................................................................. 
3 Quimioluminescência ............................................................................... 
4 Western Blotting ....................................................................................... 
5 Imunocromatografia ................................................................................ 
Bibliografia................................................................................................... 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. ELISA 
1.1 Princípios 
O teste de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ou ensaio de 
imunoabsorcão enzimática baseia-se em reações antígeno-anticorpo detectáveis por 
meio de reações enzimáticas (teste imunoenzimático); permite a detecção de 
anticorpos específico. A enzima mais comumente usada nesta prova á a peroxidasse, 
responsável por catalisar a reação de desdobramento da água oxigenada (H2O2) em 
H2O mais O2. 
 
1.2 Metodologia 
Método direto 
As placas são sensibilizadas com antígenos, que reagirão com os anticorpos da 
amostra, incubando-se em seguida com o antígeno específico marcado com a 
enzima. 
Método indireto 
As placas são sensibilizadas com o antígeno. Segue-se a incubação com a 
amostra teste. O conjugado empregado utilizado anti-imunoglobulina humana 
que reage com o anticorpo da amostra capturado pelo antígeno e a reação e 
revelada com a solução cromógena. O grau de degradação do substrato, indicado 
normalmente pela intensidade da cor da solução, é proporcional à concentração 
de anticorpo. 
Método para captura para anticorpos IgM 
A fase sólida é sensibilizada com anti-IgM específico para a região Fc. Os soros 
em teste são incubados, havendo a captura de qualquer IgM da amostra. A seguir 
incuba-se com antígeno marcado ou antígeno não marcado, seguindo de 
anticorpo específico marcado. 
 
1.3 Aplicações 
- Doenças infecciosas (HIV...); 
- Detectar alergias a alimentos; 
- Identificação de antígeno; 
- Doenças autoimunes. 
- Detectando vírus usando vírus 
- Dosagem de hormônios 
- Marcadores tumorais 
- Diagnósticos sorológicos 
As vantagens de usar ELISA para a detecção de vírus são que podem ser usadas nos 
países em vias de desenvolvimento onde as taxas de infecção são frequentemente 
muito altas, e podem alcançar os grupos os mais vulneráveis com as capacidades no 
local do teste e os resultados imediatos, permitindo o teste oportunista (por exemplo 
no departamento de emergência). 
- VIH 
ELISA era o primeiro jogo de teste universal para o VIH e emprega a detecção do 
cystatin humano C do soro para identificar os pacientes que são positivos. 
 
- Vírus de Nilo ocidental 
A detecção de vírus de Nilo ocidental é realizada por ELISA da anticorpo-captação 
de IgM o soro dos pacientes ou o líquido cerebrospinal, que foi tomado 8 a 21 dias 
que seguem a aparência dos sintomas. Este teste pode igualmente confirmar mesmo 
se a infecção progrediu ao sistema nervoso central do paciente. 
 
- Vírus da doença de Newcastle (NDV) 
NDV é um vírus aviário que possa ser passado aos seres humanos e segundo o 
presente da tensão, doença de NDV pode variar na severidade da deficiência 
orgânica respiratória moderado à diarreia e a outros sintomas risco de vida. Das 
tensões as mais letais de NDV (NDV velogenic) às tensões cada vez mais menos 
severas (NDV mesogenic e NDV lentogenic), ELISA é usado para monitorar sua 
presença dentro de uma população, ajudando à coordenação de programas de 
vacinação, assim como identificando todo o NDV contaminou rebanhos. 
 
 1.4 Vantagens & Desvantagens 
 Vantagens 
 
- Baixo e médio custo; 
- Menor risco de falso negativo; 
- Alto grau de especificidade e sensibilidade; 
- Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo; 
- Baixo limiar de detecção. 
 Desvantagens 
- Mão de obra específica; 
- Probabilidade de ocorrer erro de pipetagem, alterações de reagentes e modificação de 
tempo total do teste; 
- Alguns reagentes podem se degradar 
 
 1.5 Materiais 
- Suporte ( placa) 
- Pipetas 
- Amostra (soro, plasma,...) 
- Tampão de lavagem 
- Leitor (espectofotômetro) 
- Cromógeno (substrato) 
- Conjugado 
- Solução de Bloqueio 
- Ag purificado 
- Ac purificado 
- Solução Padrão (controle positivo e negativo) 
 
Os testes de Elisa podem utilizar amostras como: Sangue, soro, plasma e fluido 
crevicular gengival. 
 
1.6 Curiosidades 
Falso-Positivo 
Diante de respostas á vacina contra a Influenza A(H1N1) existem chances de serem 
obtidos falso-positivos para teste como: HIV1 (vírus da imunodeficiência humana), 
vírus da Hepatite C e HTLV-1. Esse resultado incorreto pode acontecer porque essa 
vacina proporciona aumento a produção de um anticorpo chamado IgM ( conhecido 
como primeiro batalhão de defesa do organismo), essa reação faz com que o organismo 
reproduza uma condição igual a de quem tem o HIV1 e acaba “enganado’ o teste Elisa. 
 
 2. CITOMETRIA DE FLUXO 
 Princípios 
A citometria de fluxo pode ser definida como uma tecnologia e/ou ferramenta 
direcionada ao estudo de células, e utilizada na identificação, avaliação, e diferenciação 
de diversas características celulares como conteúdo de DNA e RNA, receptores de 
superfície, atividade enzimática, produção de citocinas e de íons. Baseia-se na detecção 
de substâncias fluorescentes (fluorocromos) acoplados a anticorpos, capazes de se ligar 
a determinada molécula presente nas células - avaliadas uma a uma. 
 Metodologia 
Em citometria de fluxo, as células e partículas são examinadas enquanto fluem através 
de uma célula de fluxo muito estreita. Em primeiro lugar, a amostra de sangue é 
aspirada e proporcionada; a amostra é então diluída de acordo com um fator pré-
determinado e é marcada com um marcador fluorescente que se liga especificamente 
aos ácidos nucleicos. A amostra é seguidamente transportada para a célula de fluxo. A 
amostra é iluminada por um laser semicondutor, que consegue separar as células 
utilizando três sinais diretos: dispersão frontal de luz (forward scatter ou FSC), 
dispersão lateral de luz (side scatter ou SSC), fluorescência lateral (side fluorescence ou 
SFL). 
A intensidadeda dispersão frontal indica o volume celular. A dispersão lateral fornece 
informação sobre o conteúdo celular, como por exemplo, núcleos e grânulos. A 
fluorescência lateral indica a quantidade de ADN e ARN presente na célula. Células 
com propriedades físico-químicas similares constituem um grupo num gráfico 
denominado diagrama de dispersão. O princípio da citometria de fluxo com 
fluorescência é utilizado em diferentes analisadores para hematologia e análise urinária. 
Para as contagens de células sanguíneas utilizamos a citometria de fluxo com 
fluorescência, por exemplo, no caso da contagem diferencial de leucócitos e contagem 
de eritrócitos nucleados e reticulócitos. Nos analisadores de urina, a tecnologia de 
fluorescência é também usada para a contagem de bactérias, eritrócitos, leucócitos e 
outros elementos. 
 Aplicações 
-Fenotipagem dos leocócitos; 
-Fenotipagem de células tumoraes; 
-Diagnóstico e classificação das leucemias e dos linfomas; 
-Análise de DNA; 
-Análise da função dos neutrófilos; 
-Contagem de reticulócitos; 
 Vantagens & Desvantagens 
-Mede múltiplos parâmetros em células individuais; 
-Grande números de células analisadas com rapidez; 
-Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos específicos; 
-Análises de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intracelulares. 
E tem como desvantagem ter um equipamento de alto custo, ter uma baixa vazão 
celular, causar a morte de muitas células da amostra e também pela necessidade de 
células em suspensão, que em alguns materiais necessita de uma preparação mais difícil 
ou às vezes impossível. 
 Materiais 
Citômetro de fluxo mutiparamétrico, fluorocromos, anticorpos monoclonais. 
Os exames relacionados a Citometria de fluxo podem ser realizados em diversos 
materiais tais como: sangue periférico, medula óssea, líquor, linfonodo, derrames 
cavitários, humor vítreo e etc. 
 Curiosidades 
Importância da Imunofenotipagem por citometria de fluxo no diagnóstico da Leucemia 
Linfóide Aguda (2018). 
A leucemia linfóide aguda (LLA) é definida como uma neoplasia hematológica que 
surge devido a uma célula progenitora “modificada”. O crescimento desordenado e 
exagerado dessa célula tem como principal consequência, a supressão da hematopoiese 
normal, por causa do acúmulo de linfoblastos que substituem as células normais do 
sangue e levam a um comprometimento da medula óssea e do sangue periférico. No 
Brasil, esta neoplasia apresenta uma frequência de 17% de casos no primeiro ano de 
vida, tendo um pico de incidência entre 2 a 3 anos com 80 novos casos por milhão, 
sendo três vezes mais incidente na raça branca. Sendo assim, o diagnóstico através da 
imunofenotipagem por citometria de fluxo importante para investigação da presença ou 
ausência de antígenos encontrados na superfície ou no citoplasma das células, além de 
poder classificar o grau de diferenciação celular tornando o diagnóstico mais especifico. 
O presente estudo teve como objetivo realizar uma revisão de literatura sobre a 
importância da imounofenotipagem por citometria de fluxo no diagnóstico da leucemia 
linfóide aguda. É uma pesquisa do tipo exploratória e qualitativa. Sendo realizado um 
levantamento de publicações e artigos científicos, no período de agosto a setembro de 
2017, nas bases de dados: BVS, LILACS, Scielo e “Google Scholar”. A 
imunofenotipagem, realizada pela técnica de citometria de fluxo, tem contribuído na 
orientação terapêutica pois ela auxilia no diagnóstico, classificação, prognóstico, 
estadiamento e monitoramento das leucemias. A citometria de fluxo é uma técnica que 
utiliza anticorpos monoclonais marcados com fluorescência para avaliar qualitativa e 
quantitativamente padrões da expressão dos antígenos (CDs) nas células de interesse. O 
equipamento utilizado para a realização do exame é conhecido como citômetro de fluxo 
e apresenta três componentes principais: um laser que incide sobre as células, 
fotodetectores de sinais, e um computador ligado ao sistema, que vai juntos realizam a 
quantificação das suspensões celulares marcadas com os anticorpos fluorescentes. Além 
disso, a LLA podem ser do tipo B ou T, sendo as primeiras mais frequentes. Sendo 
assim, os antígenos citoplasmáticos são específicos e possibilitam classificar os tipos B 
e T. As células leucêmicas da linhagem B expressam os antígenos de membrana: CD10, 
CD19, CD22, CD24 e o antígeno citoplasmático CD79. Os antígenos de membrana de 
células T mais comuns são: CD2, CD3, CD5, CD7; e o citoplasmático: CD3. Portanto, a 
técnica apresenta uma sensibilidade, rapidez e precisão na análise das características 
celulares, além de analisar o conteúdo de DNA/RNA, detectar e quantificar os antígenos 
celulares e ainda analisar o conteúdo citoplasmático. Conclusão– Assim, a 
imunofenotipagem, realizada por citometria de fluxo é fundamental e útil, pois ela 
possui rapidez e especificidade, que facilita o diagnóstico da LLA, consequentemente 
proporcionando um tratamento direcionado, e diminuindo os índices de morbidade e 
mortalidade. 
 
3 QUIMIOLUMINESCÊNCIA 
 Princípios 
A quimioluminescência consiste na produção de luz a partir de uma reacção química. 
Dois produtos químicos reagem para formar um intermediário excitado (de alta 
energia), que se decompõe liberando parte da sua energia como fotões de luz para 
alcançar o seu estado fundamental. 
 Metodologia 
Durante uma reação química, os reagentes se transformam em estados intermediários 
eletronicamente excitados, e ao passarem para um estado de menos excitado, liberam a 
energia absorvida na forma de luz. O composto químico Luminol, é um dos 
representantes mais conhecidos da quimioluminescência. Quando em contato com o 
sangue, por exemplo, utiliza o ferro da hemoglobina como catalisador para a reação de 
liberação de luz. Esse composto é muito usado em perícia criminal, quando se quer 
investigar a presença de vestígios de sangue em uma cena de crime. Mesmo que o local 
tenha sido limpo, o luminol evidencia a presença do sangue. Laboratorialmente, 
hormônios, drogas e microorganismos podem ser identificados por testes 
colorimétricos. Tais métodos utilizam-se de anticorpos ligados a um marcador 
luminescente (cromógeno) que pode ser o próprio luminol ou mais modernamente 
derivados de acridina, sistema avidina-biotina, entre outros.Uma microesfera de 
poliestireno é revestida com anticorpo monoclonal contra antígeno analisado, adiciona 
se o soro do paciente, que é incubado com agitação intermitente, faz-se à lavagem para 
à retirada do antígeno não fixado, adiciona o anticorpo monoclonal específico, incuba e 
adicione o substrato da enzima, logo após adiciona se o substrato quimioluminescente 
que sofre hidrólise na presença da enzima, produzindo substâncias instáveis que geram 
emissões de fótons (luz). 
 Vantagens 
-Exame basicamente automatizado e rápido 
-Várias amostras podem ser analisadas e distintas moléculas podem ser 
quantificadas de uma só vez. 
-Opção de ensaio com elevada sensibilidade 
 Desvantagens 
- Reação lenta e gradual, dependente de pH; 
- Apresenta uma série de interferências de fundo ao emitir luz; 
A extrema sensibilidade das técnicas de quimioluminescência, impõem critérios 
apertados de limpeza e pureza dos reagentes. O limite de detecção dos métodos 
quimioluminescentes é geralmente restringida pela pureza dos reagentes e não por 
limitações instrumentais. 
 Materiais 
- Microesferas de poliestireno; 
- Substrato quimioluminescente; 
- Fotomultiplicador (FMT); 
- Enzima conjugada; 
Compostos quimioluminescentes usados: 
- Derivados de Luminol; 
- Catalisador. 
 Curiosidades 
Esse foi o primeiro método capaz de dosar hormônios que circulam no sangue em 
concentrações muito baixas e é mais utilizado atualmente, junto com o imunoensaio.” 
Eles são extremamente sensíveis e capazes de medir apenas o que estamos buscando, 
sem interferência de outras substâncias”, afirma à diretoramédica do Sérgio Franco. 
 
4 WESTERN BLOTTING 
 Princípios 
 Western blotting é uma técnica importante usada em biologia celular e molecular. 
Usando a técnica de western blot, pode-se identificar proteínas específicas em amostras 
complexas de lisados celulares e tecidos. A técnica usa três elementos para realizar esta 
tarefa: 
 Separação por tamanho 
 Transferência para um suporte sólido 
 Marcação da proteína alvo usando um anticorpo primário e secundário adequado 
para visualizar. 
 
 Metodologia 
 
 Nessa técnica, uma mistura de proteínas é separada com base no peso molecular e, 
portanto, por tipo, por meio da eletroforese em gel. Esses resultados são então 
transferidos para uma membrana que produz uma banda para cada proteína. A 
membrana é então incubada com marcadores de anticorpos específicos para a proteína 
de interesse. 
 O anticorpo não ligado é lavado, deixando apenas o anticorpo ligado à proteína de 
interesse. Os anticorpos ligados são então detectados revelando o filme. Como os 
anticorpos se ligam apenas à proteína de interesse, apenas uma banda deve ser visível. A 
espessura da banda corresponde à quantidade de proteína presente; assim, fazer um 
padrão pode indicar a quantidade de proteína presente. 
 
 
 Aplicação 
 
 Para determinar o tamanho e a quantidade de proteína em determinada amostra. 
 Detecta anticorpos contra vírus ou bactérias no soro. 
 Teste confirmatório para o HIV. 
 Útil para detectar proteínas defeituosas, como doença de Prions. 
 Teste definitivo para doença de Creutzfeldt-Jacob, doença de Lyme, hepatite B e 
herpes. 
 
 Vantagens e Desvantagens 
 
 O Western blot ou immunoblot é um teste mais sensível que Elisa, porém 
possui como desvantagem o fato de ser uma técnica laboriosa e demorada, que 
necessita da separação das proteínas por eletroforese antes que ocorra a 
transferência delas para a membrana de nitrocelulose. 
 
 Materiais necessários 
 
 Tiaras numeradas contendo os antígenos separados eletroforeticamente. 
 Mini-cubas plásticas para incubação das tiaras. 
 Tampão para diluição das amostras 
 Tampão para lavar as amostras 
 Pinças plásticas para manuseio das tiaras. 
 
 Curiosidade 
 Pesquisadores analisaram o método Western Blotting para diagnóstico 
de TC (toxoplasmose congênita). Uma doença que não demostra sinais ou 
sintomas no nascimento, onde o resultado mostrou que o método Western 
Blotting tem maior sensibilidade do que a detecção de IgM anti‐T. gondii. Pelos 
achados, os pesquisadores recomendam seu uso para o diagnóstico em 
associação com outros marcadores de infecção congênita. 
 
 
5 IMUNOCROMATOGRAFIA 
 
 Princípios 
O teste imunocromatográfico ou imunocromatografia é um teste bem simples, a única 
coisa difícil mesmo é o nome. É também popularmente conhecido como teste rápido. 
Testes rápidos são aqueles cuja execução, leitura e interpretação dos resultados são 
feitas em no máximo em 30 minutos, dispensando uso de reagente adicional, além de 
não necessitarem de estrutura laboratorial. 
Eles dispensam o uso de reagente adicional ou equipamentos. 
 
 Metodologia 
 
O método de imunocromatografia é o mais frequente e envolve a pesquisa de antígenos 
ou anticorpos. Para pesquisa de anticorpos, haverá antígenos na membrana de 
nitrocelulose para capturar os anticorpos presentes na amostra; para a pesquisa de 
antígenos, haverá anticorpos para capturar os antígenos presente na amostra, mais 
conhecido como reação antígeno-anticorpo. Essa pesquisa pode ser realizada em sangue 
total, soro ou urina. 
O antígeno ou o anticorpo é fixado na membrana na forma de linhas ou pontos e o 
restante da membrana é bloqueado com proteína inerte como nos testes 
imunoenzimáticos (ELISA). 
Para detecção de antígenos podem ser utilizados anticorpos fixados na linha de captura 
e como conjugado um segundo anticorpo conjugado ao corante. 
Um dos métodos imunológicos desses testes emprega corante insolúvel, como ouro 
coloidal (róseo) ou prata coloidal (azul marinho) como revelador da interação antígeno-
anticorpo. 
 
 Aplicações 
Alguns deles, como a determinação da glicemia (glicosímetros), usam métodos 
enzimáticos químicos, e outros são imunológicos como para o teste de gravidez. 
Os testes rápidos, que utilizam a imunocromatografia, estão ganhando espaço no 
diagnóstico de doenças infectocontagiosas como AIDS, Hepatites B e C, Dengue, 
Chikungunya e exames para identificação de sangue oculto. 
 
 As Vantagens 
- Rápido 
- Econômico . 
- Fácil interpretação. 
- Leitura feita de olho a nu. 
- Apresenta sensibilidade e especificidade. 
 
 As Desvantagens 
- Baixa sensibilidade. 
- Teste de Triagem 
 – Precisa de ensaio confirmatório. 
 
 Componentes do conjunto diagnóstico ou kit 
 
- Lancetas para a punção da polpa digital; 
- Dispositivos para coletar as amostras de sangue: tubos capilares, 
alças plásticas ou pipetas Pasteur; 
- Dispositivo ou cassete para a reação (podem ter diferentes formatos 
e apresentações, conforme o fabricante); 
- Reagentes necessários para a execução do teste; 
 
 Curiosidades 
Os testes rápidos para Dengue e Chikungunya foram incluídos na tabela do Sistema 
Único de Saúde (SUS) que considerou a necessidade de otimizar o diagnóstico 
laboratorial. Foram disponibilizados aos estados e municípios dois milhões de testes 
rápidos imunocromatografia qualitativa (IgM/IgG) para dengue e um milhão de testes 
rápidos imunocromatográficos IgM para chikungunya. O SUS também já oferece o teste 
rápido para o Zika Vírus. É feito em gestantes e nas crianças que têm até 1 ano de 
idade, com resultado em até 20 minutos. O objetivo é verificar a possível contaminação 
e possibilitar imediato acompanhamento do caso. São 2 testes em 1. O primeiro 
identifica se o cidadão está com o vírus, já o segundo observa se ele já foi portador. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
1- Aplicação da citometria de fluxo no diagnóstico oncohematogênico / Congresso 
Brasileiro de Patologia Clínica ; Medicina Laboratorial . Exposição Técnico-
científica 2007 > Dispoível em: 
http://www.sbpc.org.br/upload/congressos/2_Aplicacoes_da_citometria_de_fluxo_
no_diagnostico_onco-hematologico.pdf Acesso no dia 05 de novembro de 2020. 
2- Citometria de fluxo > Disponível em: https://pt.slideshare.net/labimuno/citometria-
de-fluxo Acesso no dia 5 de novembro de 2020. 
3- Citometria com fluorescência > Disponível em: https://www.sysmex.es/es-
pt/academia/knowledge-centre/tecnologia/citometria-de-fluxo-com-
fluorescencia.htm Acesso no dia 10 de novembro de 2020. 
4- Citometria de fluxo: aplicações, vantagens e desvantagens > Disponível em : 
https://ibapcursos.com.br/citometria-de-fluxo-aplicacoes-vantagens-e-
desvantagens/ Acesso no dia 10 de novembro de 2020. 
5- Citometria de fluxo > Disponível em: 
https://www.diagnosticosdobrasil.com.br/material-tecnico/citometria-de-fluxo 
Acesso no dia 10 de novembro de 2020. 
6- SANTOS, Katia Regina Crus et al. IMPORTÂNCIA DA IMUNOFENOTIPAGEM 
POR CITOMETRIA DE FLUXO NO DIAGNÓSTICO DA LEUCEMIA 
LINFÓIDE AGUDA. Semana de Pesquisa da Universidade Tiradentes-
SEMPESq, n. 19, 2018. 
7- Western blot imagem: 
https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/4108290/mod_resource/content/1/Aula%2
05%20-%20Profa.%20Carol%20e%20Prof.%20Labate.pdf 
8- Western blot: https://www.gvs.com.br/blog/life-sciences/o-que-e-western-blotting-
conheca-esta-tecnica-utilizada-na-biologia-molecular/ 
9- Western blot: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3456489/ 
10- https://pebmed.com.br/metodo-western-blotting-e-o-mais-indicado-para-
diagnostico-de-toxoplasmose-congenita/ 
11- http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/cd08_08.pdf 
 
12-