Meios de Cultivo e Efeito Citopático dos Vírus

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Maria Eduarda de Alencar - Odontologia 2019.2 
Meios de Cultivo e Efeito Citopático dos Vírus 
Histórico 
→ Início da Virologia 
- Teste em animais: Era feita a coleta do material 
do indivíduo ou do animal doente e, 
posteriormente, a inoculação desse material em 
uma pessoa ou um animal saudável. Era então 
observado se a pessoa ou o animal que 
receberam esse material apresentava os sinais e 
sintomas da doença. Esses testes já não são mais 
utilizados atualmente, pois já existem outras 
formas; 
OBS.: No caso dos vírus, por serem parasitas 
intracelulares obrigatórios, para que se possa 
cultivar/isolar um vírus é precisa-se de uma célula, 
pois só assim ele pode se replicar. 
→ 1940-1950 
- Descoberta dos antibióticos; 
- Descoberta da tripsina – uma enzima que 
possui a capacidade de separar uma célula da 
outra sem que elas percam sua estrutura e 
viabilidade; 
Tornaram possível o cultivo de células 
isoladas. A partir de fragmentos de órgãos, 
tratados com tripsina, tornou-se possível 
conseguir células isoladas e passar a cultivá-las 
em um ambiente controlado – laboratório – sem 
existir a chance de contaminação bacteriana, 
graças aos antibióticos; 
- Essas pesquisas realizadas para se fazer cultura 
de células em laboratório foram amplificadas 
exatamente devido a necessidade de produção 
de vírus em massa, para produzir vacinas que 
prevenissem as doenças virais; 
OBS.: O cultivo in vitro surgiu como substituto para 
a inoculação feita em pessoas e animais – muito 
limitada, não sendo possível produzir vacinas em 
larga escala por esse método. 
Cultura de Células 
→ O que é? 
- Células que foram retiradas de um órgão – 
fragmento – e que passam a ser cultivadas em 
condições laboratoriais – temperatura, pH, 
nutrientes controladas; 
Para que as células permaneçam vivas e se 
multiplicando, é necessário que seja oferecido a 
elas os nutrientes que elas teriam se estivessem 
num organismo vivo – meio de cultura; 
→ O que é um Meio de Cultura? 
- Insumos preparados em laboratórios que 
fornecem os nutrientes para o crescimento e 
desenvolvimento de microrganismos fora do seu 
habitat natural; 
- Esses meios normalmente são comprados em 
pó, contendo sais inorgânicos – cálcio, ferro, 
magnésio, fósforo – aminoácidos essenciais e não 
essenciais, vitaminas, antibióticos, fonte de 
energia – glicose, indicador de pH. Esse pó após 
diluído em água destilada pode ser utilizado como 
uma forma de manter a cultura de células viva; 
OBS.: Indicador de pH – a modificação da cor – 
de rosado para amarelado – serve para indicar 
quando os nutrientes foram metabolizados (torna 
o pH do meio ácido) e a troca de meio de cultura 
precisa ser feita para manter a integridade das 
células. 
 
→ Forma de Cultivo das Células 
- Células Aderidas: Células que crescem 
aderidas a superfícies, formando um tapete de 
células. Ex.: Células epiteliais; 
- Células Suspensa: Células que crescem sem se 
aderir a superfícies, “soltas” junto com o meio de 
cultura. Ex.: Células hematopoiéticas; 
Tipos de Cultura de Células 
- Não se pode deixar as células crescerem tanto 
ao ponto de ficar uma sobre a outra, sem espaço, 
pois, o tapete de células pode ficar tão pesado que 
elas perdem a aderência com a superfície e se 
acumulam no fundo, possibilitando a perda celular 
quando for realizada a troca do meio de cultura; 
- Nesses casos de grande proliferação, é realizado 
o repique celular – retira-se o meio de cultura e 
adiciona-se a tripsina, que vai agir “descolando” as 
células da superfície, as células descoladas vão 
ser retiradas daquele local (garrafa, placa de Petri) 
com o auxílio de uma pipeta. As células que 
restarem vão aderir à superfície novamente, será 
adicionado um novo meio de cultura e elas 
voltarão a se proliferar, agora com o espaço 
necessário. 
→ Cultura Celular Primária 
- São as células obtidas através de uma amostra 
de tecido, retirado de um animal, cultivadas em 
ambiente laboratorial. Essas células após serem 
colocadas no recipiente – placa de Petri, por 
exemplo – irão se multiplicar até cobrir a totalidade 
do substrato (até não existir mais espaço); 
→ Cultura Celular Finita (Secundária) 
- São as células que permanecem após o repique. 
As células são também chamadas de finitas pois a 
partir de um determinado momento, mesmo com o 
ambiente favorável para sua replicação e 
vitalidade, elas irão morrer (processo natural); 
OBS.: A desvantagem de se trabalhar com células 
de cultura primária e secundária é que não é 
possível mantê-las vivas para sempre. A 
vantagem é que por serem células provenientes 
de tecidos animais, tudo que ocorrer com essas 
células que estão sendo cultivadas em laboratório, 
irá imitar o que aconteceria com as células que 
estão dentro do organismo do animal – processo 
fidedigno. 
→ Cultura Celular Contínua 
- Células que, em teoria, já estão no seu limite, 
mas continuam sobrevivendo e suportando outros 
repiques por tempo indeterminado. Ao serem 
estudadas, percebeu-se então que essas células 
adquirem essas características devido a mutações 
naturais ou induzidas (o que inicialmente ocorria 
ao acaso passou a ser feita de forma artificial); 
OBS.: A vantagem desse tipo celular é a 
possibilidade de manutenção delas por tempo 
indeterminado. A desvantagem é que a partir do 
momento que essa célula sofreu mutação, ela já 
não é mais exatamente igual a célula presente no 
organismo vivo, por isso, a fidedignidade do 
processo – numa infecção viral, por exemplo – não 
é mantida. 
Aplicações das Culturas de Células 
- Isolamento viral para auxiliar no diagnóstico de 
determinada doença – observar as modificações 
que esse microrganismo causa nas células; 
- Amplificação viral – armazenamento, produção 
de vacinas, antígenos para diagnóstico, 
inoculação em animais; 
- Estudo da patogênese viral – observar o 
processo de replicação viral e os impactos que ele 
gera na célula; 
- Verificação do efeito de medicamentos, 
toxinas, hormônios, entre outras substâncias – 
insere-se a substância que se deseja estudar na 
cultura de células, podendo então observar como 
essas células reagirão. 
Cuidados Necessários 
→ Esterilidade 
Para trabalhar com cultura de células é necessário 
ter: 
- Ambiente estéril; 
- Materiais estéreis, ou os mais descontaminados 
possíveis; 
- Enzimas estéreis – tripsina 
OBS.: Multiplicação de bactérias – 30min – 
Multiplicação de células animais – 18 a 24h. Se o 
recipiente que for adicionado as células estiver 
contaminado por bactérias, esses microrganismos 
se desenvolverão muito mais rápido e colonizarão 
o local, tornando inviável a cultura de células. 
→ Autoclaves 
- São utilizadas, em laboratório, para realizar a 
esterilização dos equipamentos por meio do calor 
úmido sob pressão; 
→ Capela ou Fluxo Laminar 
- Realiza a descontaminação dos equipamentos 
através de uma fonte de luz ultravioleta. 
Cultivo Viral e Efeito Citopático 
- Os vírus são microrganismos muito pequenos, 
não sendo possível visualizá-los no microscópio. 
Uma forma de estudá-los é fazendo o cultivo viral 
em um meio de cultura e observando o efeito 
citopático, ou seja, o efeito que o vírus causa na 
célula – estrutura possível de ser visualizada 
através de um microscópio; 
→ Cultivo Viral 
- Sistemas: Inoculação em animais de 
laboratório – atualmente é feita em cobaias 
(ratos) – inoculação em ovos embrionados – 
muito utilizada na produção de algumas vacinas – 
e inoculação em culturas celulares; 
 
→ Inoculação em Animais de Laboratório 
- Início da virologia: A inoculação em animais foi 
uma das primeiras maneiras que os cientistas 
utilizaram para se fazer diagnóstico de doenças 
virais; 
- Desuso: Questões éticas – por essas questões 
esse tipo de inoculação está entrando em desuso, 
mas em alguns casos ainda é necessária (ex.: 
vírus da raiva) – e operacionais – a manutenção 
desses animais em laboratório não é muito fácil; 
→ Inoculação em Ovos Embrionados 
- O meio é nutritivo e estéril;- Meios de inoculação: A escolha do local a ser 
feita a inoculação vai depender da quantidade de 
vírus que se quer produzir e dos nutrientes que 
são necessários para manter a proliferação dele 
viável. Pode ser feita: na cavidade amniótica, na 
cavidade alantólica e no saco vitelínico; 
OBS.: Independente do meio, é necessário deixar 
o ovo em uma temperatura ideal para que o vírus 
consiga infectar as células e se proliferar. 
- O ovo é colocado contra a luz, permitindo 
observar as estruturas internas e a inoculação é 
feita utilizando uma agulha muito fina, para evitar 
a fratura da casca. O ovo é colocado em uma 
estufa – controle de temperatura – e diariamente 
ele será observado contra a luz a procura de 
alterações; 
- Alterações: Morte do embrião, hemorragias, 
inibição do crescimento do embrião, edema e 
necrose tecidual; 
OBS.: Pessoas com alergia ao ovo, ou a algum 
dos componentes dele, podem apresentar 
reações ao receber vacinas que foram produzidas 
por esse tipo de inoculação. 
→ Inoculação em Cultura de Células 
- São colocadas células de linhagem primária, 
secundária ou contínua em um meio de cultura, e 
é oferecido todos os recursos necessários para 
elas se proliferarem; 
- A partir de tecidos, secreções, sangue, soro ou 
fezes são extraídas amostras que se deseja 
investigar – observar se há a presença de vírus ou 
não – e realiza-se a inoculação delas no cultivo 
celular. Se houver vírus nessas amostras, 
passados alguns dias, com as condições ideais, 
eles irão se proliferar, gerando destruição celular 
ou efeitos citopáticos; 
- Além de ser possível a observação do efeito 
citopático, através de algumas técnicas de 
diagnóstico, é possível tentar detectar o material 
genético dos vírus está presente nas amostras 
inoculadas, se encontrando esse material genético 
é feita então a confirmação da presença viral nas 
amostras; 
→ Tipos de Efeito Citopático 
- Lise Celular: A morte das células, devido ao 
“consumo” que os vírus fazem de toda maquinaria 
delas para que eles possam se replicar, isso faz 
com que a célula entre em colapso e morra, visto 
que ela não tem como produzir suas proteínas – 
paralisação da síntese de proteínas; 
OBS.: A morte celular também pode ser gerada 
pela ruptura de membrana celular durante a saída 
dos vírus. Essa ruptura gera a entrada e saída de 
substâncias descontroladamente. 
- Uma forma de observar essa modificação é 
através de corantes. Ao serem colocados, o que 
se observa no local onde tem células intactas é 
uma impregnação completa – as células vão 
colorir por completo – enquanto que no local com 
células mortas é observada a formação de pontos 
transparentes; 
 
- Formação dos Corpúsculos de Inclusão: 
Restos virais que permanecem na célula – 
proteínas virais. Esses corpúsculos podem ser 
encontrados no núcleo ou no citoplasma das 
células. Alguns corpúsculos de inclusão são 
considerados patognomônicos, ou seja, 
específicos de uma doença; 
 
- É possível observar a formação do corpúsculo no 
citoplasma da célula. O local vai depender do 
comportamento biológico dos vírus; 
- Formação de Células Gigantes ou Sincícios: 
Em algumas situações, a célula infectada funde 
sua membrana com a membrana das células ao 
redor, além de estimulá-las a fazer o mesmo. No 
final desse processo, o que se tem é uma célula 
gigante com vários núcleos. 
 
Vantagens e Desvantagens 
→ Vantagens 
- A partir do momento que é feita a inoculação viral 
em cultura de células, torna-se possível manter 
as partículas virais viáveis por tempo 
indeterminado, desde que sejam mantidas as 
condições ideais para isso; 
- Essa técnica de isolamento viral em cultura de 
células possui uma boa sensibilidade, ou seja, 
até mesmo um número pequeno de partículas 
virais é detectado; 
- A grande maioria dos vírus produzem efeito 
citopático; 
- Técnica barata; 
→ Desvantagens 
- Técnica demorada – por isso, atualmente essa 
técnica tem sido mais usada para estudo, 
existindo outras mais rápidas para diagnóstico – e 
que requer mão de obra especializada; 
- Só detecta partículas virais viáveis, ou seja, 
vírus com a estrutura intacta, que seja capaz de se 
reproduzir; 
- Qualidade do material, o material precisa ser 
bem coletado e armazenado para manter as 
partículas virais viáveis.