Seminário UHPLC

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UHPLC
U N I V E R S I D A D E F E D E R A L D E A L A G O A S
I N S T I T U T O D E Q U Í M I C A E B I O T E C N O L O G I A
Q U Í M I C A T E C N O L Ó G I C A E I N D U S T R I A L
Q U Í M I C A A N A L Í T I C A I N S T R U M E N TA L I I
José Jorge Araújo e Silva
Professor: Dra. Janaína Heberle Bertoluzzi
O que é UHPLC
A cromatografia líquida de ultra eficiência (UHPLC – ultra-high
pressure liquid chromatography ou ultra-high performance
liquid chromatography) desenvolveu-se a partir da introdução
das partículas de FE porosas ≤ 2 µm, em resposta à busca
contínua por análises mais rápidas e eficientes.
A UHPLC fundamenta-se nos mesmos princípios de separação
da HPLC, tendo como principais diferenças as colunas
cromatográficas empregadas que são de dimensões reduzidas
(5-10 cm de comprimento e diâmetros internos de 1-2,1 mm),
recheadas com partículas de FE ≤ 2 µm, as quais,
juntamente com as altas velocidades lineares de fase móvel (FM) aumentam a resolução e a
detectabilidade, diminuem o tempo das análises, porém geram um aumento significativo na pressão
cromatográfica.
Em vista disso, um equipamento adequado, capaz de operar a altas pressões, acima de 1000 bar
(∼15000 psi), é empregado para extrair um desempenho cromatográfico máximo dessa técnica.
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Qual é a diferença entre HPLC e UHPLC?
 Técnica HUPLC é uma versão
desenvolvida do HPLC
 HUPLC é mais eficiente em
comparação com o HPLC
 Usa bomba de alta pressão; HPLC
40 Mpa, UHPLC 100 Mpa
 HPLC utiliza partículas FE > 2 µm
 HUPLC utiliza partículas FE ≤ 2 µm
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Equipamento
O equipamento para a realização desse tipo de cromatografia é denominado de cromatógrafo
líquido que é constituído por vários sistemas, sendo eles:
Sistema de reservatório de fase móvel;
Sistema de bombeamento de fase móvel;
Sistema de injeção;
Sistema analítico que é constituído pela coluna cromatográfica;
Sistema de detecção (existe detecção por UV, fluorescência, espectrofotometria de massas, 
etc.);
Sistema de aquisição e registro de dados.
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Aplicação
É uma técnica utilizada em análises de
compostos não voláteis ou instáveis
termicamente onde a cromatografia gasosa não
pode ser utilizada.
O campo de aplicação é extremamente vasto,
principalmente para as análises realizadas nas
Indústrias Farmacêuticas, com a quantificação
dos insumos farmacêuticos e medicamentos,
bem como o doseamento de impurezas e
produtos de degradação em matérias-primas e
produtos acabados.
é um método de separação de compostos
químicos em solução, onde o sucesso da
separação só é possível se for aplicada uma fase
móvel (FM) correta a uma fase estacionária (FE)
conveniente.
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Artigo 1
Dentre as técnicas analíticas disponíveis, a cromatografia líquida de ultra-alta
eficiência (UHPLC, ultra high-performance liquid chromatography) combinada
com a espectrometria de massas em série (MS, mass spectrometry) apresenta o
maior nível de detectabilidade para um grande número de moléculas, bem como
a possibilidade de confirmação de suas identidades, sendo considerada a
ferramenta ideal para determinação de contaminantes em alimentos.
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Artigo 1
Método
Diversos métodos de preparação têm sido explorados para a extração seletiva e eficiente de
contaminantes orgânicos em alimentos, porém o método QuEChERS tem se apresentado
como o mais adequado para diversas matrizes.
Método QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Rugged, Effective, and safe) que traduzindo é rápido,
fácil, barato, robusto, eficaz e seguro.
O método QuEChERS foi originalmente desenvolvido para a extração de resíduos de
agrotóxicos em frutas e vegetais e modificado para atender às mais diversas características
das diferentes matrizes de alimentos.
Objetivo
Diante desse contexto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um método analítico de alta 
detectabilidade para a determinação de resíduos de agrotóxicos em méis produzidos na 
região do Triângulo Mineiro, empregando o método QuEChERS e a técnica UHPLC-MS/MS.
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Artigo 1
Materiais
 Todos os solventes empregados no trabalho foram de grau LC-MS
 Todos os reagentes foram de grau analítico
 Água ultrapura foi produzida por um ultrapurificador Millipore Milli-Q 8
 Os solventes e água ultrapura foram filtrados individualmente em membranas de
 poli(tetrafluoretileno) de 0,22 μm de poros da Millipore
 Padrões analíticos de alta pureza, > 99%, dos princípios ativos acefato, acetamipride, 
carbendazim, diflubenzuron, imidaclopride, metomil e tiametoxam foram adquiridos da Dr. 
Ehrenstofer (Augsburg, Alemanha) e Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA).
 Soluções padrão estoque de 100 mg L-1 da mistura dos agrotóxicos foram preparadas em 
acetonitrila e metanol. Soluções padrão de trabalho em diferentes concentrações foram 
preparadas a partir da diluição da solução estoque para realização dos estudos de 
otimização e validação do método.
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Artigo 1
Análises cromatográficas
 Análises cromatográficas (UHPLC) acoplado a um espectrômetro MS/MS, com fonte de ionização electrospray (ESI);
 Analisador de massas triplo quadrupolo (QqQ) da Waters modelo Xevo TQ-s Micro (Mildford, MA, EUA);
 Software Mass Lynx utilizado p/ aquisição e processamento dos cromatogramas e espectros de massas;
 Coluna analítica HSS T3 da Waters, com 100 mm × 2,1 mm d.i. e com partículas de 1,8 μm.
Espectrômetro MS/MS Xevo® TQ-S
coluna analítica HSS T3 da Waters
A fase móvel foi composta de:
 0,1% de solução aquosa de ácido acético
 Acetonitrila contendo 0,1% de ácido acético
 Cada composto gerou um único íon [M+H]+ no sistema UHPLC-
MS/MS. 
Outras Informação:
 A fonte de ionização otimizados foram a temperatura da fonte 
de 150 °C; 
 voltagem do capilar em 1 kV para todos compostos;
 vazão e temperatura do gás nebulizador (N2) de 900 L h-1 e 450 
°C, respectivamente.
 O gás de colisão foi o argônio com pressão de 2,5 mTorr.
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Artigo 1
Validação do método analítico
O método proposto foi validado de acordo com o documento
SANTE/11813/2017 proposto pela Comunidade Europeia que estabelece
procedimentos para validação de metodologias de análise e determinação de
resíduos de agrotóxicos em alimentos.
Conclusão
Foi desenvolvido um método para a determinação de resíduos de
agrotóxicos em amostras de mel ( com método de extração QuEChERS
e a UHPLC-MS/MS). Um dos objetivos era a busca por uma
metodologia de alta detectabilidade, capaz de quantificar baixos teores
de resíduos de agrotóxicos em amostras de mel, e resultados com alta
exatidão e precisão para possibilitar a avaliação da contaminação
deste produto apícola.
Podemos concluir que as regiões que as amostras foram extraídas
estão sob incidência dos agrotóxicos empregados nas culturas de
grãos e cana-de-açúcar e que os produtos apícolas obtidos das
colmeias nessas regiões estão sob risco real de contaminação por
esses agrotóxicos.
Cromatogramas de íons totais para os extratos das amostras de mel com a fortificação de
soluções padrão a 2,5 μg L-1 dos agrotóxicos (1) diflubenzurom, (2) acetamipride, (3)
imidaclopride, (4) tiametoxam, (5) metomil, (6) carbendazim e 7 (acefato), obtidos por UHPLC-
MS/MS.10
Artigo 2
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Artigo 2
Objetivo
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo
de análise utilizando a cromatografia líquida de ultra
alta eficiência acoplada à espectrometria de massas
tandem (UHPLC-MS/MS) para a separação simultânea
de dez principais padrões de fito-hormônios descritos
na literatura.
Interesse
A crescente exploração do potencial fisiológico das
plantas, através do aumento da produção de biomassa,
sem a utilização de agrotóxicos prejudiciais a saúde tem
impulsionado os estudos em direção a buscar fontes
alternativas na natureza. O uso de substâncias
bioestimuladoras do crescimento de plantas tem se
mostrado promissor na melhoria de todas as fases:
germinação, estabelecimentos, desenvolvimento, e
resistências a pragas e doenças.
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Materiais e Métodos
O espectrômetro de massas (MS) utilizado possui fonte de ionização electrospray (ESI)
e analisador tipo triplo quadrupolo(QqQ) (TQD, Waters). 
Os parâmetros instrumentais utilizados foram:
 tensão capilar 3500 V,
 temperatura de desolvatação: 350 °C,
 temperatura da fonte: 150 °C,
 fluxo de gás do cone: 20 L/h
 fluxo de desolvatação: 700 L/h.
Na separação dos compostos foi utilizado cromatografo UHPLC Acquity, Waters.
 Coluna cromatográfica utilizada: BEH C18 (2,1 x 50 mm, 1,7 μm) Waters.
 Temperatura do forno de coluna 40 °C.
Fase móvel: modo gradiente
 A: H2O + 0,1% ácido fórmico + 10 mM de Formiato de amônio.
 B:MeOH + 0,1% ácido fórmico + 10 mM de Formiato de amônio.
Espectrômetro de quadrupolo Xevo® TQD
Waters Ges.m.b.H EUA - Massachusetts
Cromatógrafo em fase líquida de ultra-alta
performance ACQUITY UPLC 2D 
ACQUITY Premier BEH C18 
Column, 1.7 µm, 2.1 x 50 mm
Artigo 2
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Artigo 2
Quantificação dos padrões de
fito-hormônios
Soluções padrões individuais (SI) dos
compostos a uma concentração de 1
mg/mL. Em seguida, foram utilizadas
diluições das SI para o preparo de
soluções intermediárias dos 10 padrões
de fito-hormônios em estudo (ácido
jasmônico, ácido índole-3-acético, ácido
índole-3-propionico, ácido
índole-3-butírico, ácido giberélico, ácido
absícico, ácido salicílico, trans-zeatina,
trans-zeatina ribosídeo e giberelina A4) a
concentração de 100 μg/mL.
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Artigo 2
Cromatogramas
(A) Cromatograma de 6 canais de MRM 
(trans-zeatina, trans-zeatina ribosídeo, 
ácido indol-3-acético, ácido 
indol-3-propiônico, ácido indol-3-butírico e 
ácido jasmônico) obtidos na análise da 
mistura contendo 10 padrões de 
fito-hormônios por UHPLC-ESI(+)-MS);
(B) Cromatograma de 4 canais de MRM 
(ácido acetil salicílico, ácido giberélico, 
ácido abscísico e giberelina A4) obtidos na 
análise da mistura contendo 10 padrões de 
fito-hormônios por UHPLC-ESI(-)-MS. 
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Artigo 2
Conclusões 
O método analítico desenvolvido e otimizado por UHPLC-MS/MS foi capaz
de identificar e quantificar, de forma rápida, sensível e seletiva dez
compostos padrões de fito-hormônios. Este método será aplicado na
quantificação de compostos fito-hormônios em amostras com matrizes
complexas. A utilização deste protocolo de análise em amostra de algas
será uma ferramenta auxiliar poderosa no desenvolvimento de processos
de produção destes compostos por via biotecnológica.
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Referências
https://pt.strephonsays.com/hplc-and-vs-uplc-11599
https://planetabiologia.com/fitormonios-hormonios-vegetais-resumo/
https://cromvallab.com/2020/03/11/vale-a-pena-migrar-de-hplc-para-
uplc/
https://www.embrapa.br/agroenergia/busca-de-publicacoes/-
/publicacao/1127677/desenvolvimento-de-metodo-para-identificacao-e-
quantificacao-de-fito-hormonios-produzidos-por-macro-e-microalgas-
utilizando-uhplc-msms
https://www.scielo.br/j/qn/a/NRWJyyqWksP3vMMPLgYm3vd/?lang=pt
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Obrigado!