Doença de Huntingtina

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UFRJ
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
CIÊNCIAS BIOLÓGICAS-MODALIDADE MÉDICA
DISCENTES:
ANA CAROLINA DIAS DE LIMA DOS SANTOS
JULIA MARTINS WAGNER RODRIGUES TRAJANO
DANOS OXIDATIVOS NO METABOLISMO ENERGÉTICO ATRAVÉS DE VIAS
PROTEICAS NA DOENÇA DE HUNTINGTON
Resumo: A Doença de Huntington (DH) pode ser considerada de caráter
neurodegenerativo e está associada a manifestações psicomotoras consequentes da
alteração da proteína huntingtina, que leva a danos em diferentes regiões do cérebro, tais
como o córtex, o hipotálamo e o corpo estriado. Contudo, literaturas anteriores já
comprovaram que a DH ocorre a partir da desregulação do metabolismo energético, que
causa danos oxidativos aos tecidos neurais.
No entanto, ainda é debatido quais proteínas ou outras espécies químicas, além da
huntingtina (HTT), estariam envolvidas no desbalanço metabólico. Este estudo visa avaliar o
efeito de diferentes agentes químicos previamente associados a esta doença. Em linhas
gerais, os resultados deste estudo explicitam que as vias metabólicas em evidência
contribuem para a progressão da DH, através de danos oxidativos e disfunções metabólicas
de um modo geral.
Introdução: A DH se trata de uma doença neurodegenerativa de caráter autossômico
dominante, com penetrância completa, consequência de uma mutação no gene responsável
pela codificação de uma proteína chamada “Huntingtina” (HTT).
A patologia da doença se desenvolve graças à essa mutação, que se dá pela expansão
no gene codificador da HTT, essa expansão resulta numa consequente expansão de
resíduos de glutamina localizados no terminal amínico da proteína huntingtina, fazendo com
que a proteína se acumule no citoplasma e no núcleo neuronal, a qual, ao causar a
repetição da sequência CAG (trinca que codifica a glutamina) no gene, culmina no
desenvolvimento da doença por meios ainda não totalmente compreendidos pela ciência.
A faixa etária mais acometida pelos sintomas da doença de Huntington se encontra entre
os 30 e os 50 anos, entretanto, estes podem se manifestar em qualquer idade, ademais, a
Doença de Huntington Juvenil acomete pacientes entre 0 e 20 anos corresponde a 1/10 dos
diagnósticos totais da DH. Os portadores da DH possuem uma certa uniformidade na forma
como o quadro sintomático progride, porém variações individuais podem ocorrer. Com a
evolução da doença, os sintomas mais leves – alterações sutis de humor e déficit das
funções cognitivas – avançam rumo a uma maior problemática, caracterizada por
movimentos involuntários e abruptos além do incremento na deficiência das competências
comportamentais e mentais durante o estágio intermediário.
A fase avançada da doença conta com grande dificuldade para a realização de
movimento e com a queda das capacidades mentais até um quadro de demência. É
relevante abordar que o metabolismo energético tem grande impacto na patologia da DH.
Estudos prévios apontam que a fosforilação oxidativa, importante processo da respiração
celular que, entre outras funções, oxida moléculas intermediárias, as quais irão participar do
processo de síntese da molécula de ATP em etapas posteriores, além de grande
importância para o ciclo do ácido cítrico, ambos tendo como objetivo o fornecimento
energético para o funcionamento pleno do sistema.
De modo geral, os estudos post-mortem dos tecidos fornecem resultados mais claros, e
demonstram os mesmos defeitos supracitados. Contudo, durante as análises, pode-se
observar que os músculos, plaquetas e linfoblastos mostraram resultados alterados em
relação à fosforilação oxidativa mitocondrial, levando a deficiência energética. Segundo
literaturas já publicadas e revisadas, essas alterações estão associadas a defeitos
mitocondriais ligados às atividades dos complexos mitocondriais II e III, diretamente
relacionados ao fluxo de elétrons e consequentemente ao gradiente de prótons de modo
geral, mas a via metabólica por qual a patologia se desenvolve não é consenso entre os
estudiosos da área.
Os possíveis mecanismos avaliados neste estudo apontam para um efeito patológico do
mRNA da HTT, além de outros processos que envolvem esta mesma proteína, como a
desregulação do processo de transcrição, defeitos no transporte, disfunção mitocondrial,
levando a alterações no consumo de oxigênio, transporte de elétrons ou falhas no
metabolismo energético de modo geral, a serem explicados ao longo deste estudo.
Resultados:
Primeiramente, visando testar a hipótese de que a presença da HTT exerceria influência
sobre a atividade de enzimas envolvidas no metabolismo energético de células nervosas, o
conteúdo de Aconitase e Enolase foi medido, em unidades arbitrárias, nas áreas do córtex e
corpo estriado tanto para camundongos selvagens quanto para os animais mutantes para a
huntingtina humana (Figura 1).
A análise acerca dos dados que medem a concentração de Enolase – presentes no
gráfico A - no córtex cerebral e nas células do núcleo estriado mostra que os camundongos
mutantes para a huntingtina humana apresentaram, em ambas as áreas, quantidades
menores de Enolase sendo expressa quando comparadas às taxas de concentração
enzimática dos camundongos selvagens. De forma semelhante, os dados explicitados no
gráfico B acerca do conteúdo da enzima Aconitase no córtex e no núcleo estriado mostram
um déficit na concentração da enzima nessas regiões, apresentado pelos camundongos
R6/2 mutantes, mediante às taxas expostas pelos animais wild type.
Supõe-se que o prejuízo manifestado pelos animais mutantes se dê em razão do
comportamento da HTT mutante no ambiente celular e a sua relação com o aumento do
estresse oxidativo. A presença da forma mutante da proteína a nível citoplasmático vêm
sido relacionada a fenômenos de inativação e comprometimento funcional de algumas
proteínas essenciais para a função mitocondrial, em especial enzimas envolvidas no
metabolismo da glicose – como a enolase e aconitase -.
Uma análise acerca da atividade da enzima succinato desidrogenase após uma hora na
presença de concentrações gradativamente maiores de 3-NP em porções do corpo estriado
de camundongos selvagens foi conduzida (Figura 2) objetivando confirmar a influência do
ácido 3-nitropropiônico (3-NP) sobre o ciclo do ácido cítrico.
O gráfico mostra a existência de uma relação inversamente proporcional entre a
quantidade de succinato desidrogenase e de 3-NP, na qual quanto maior a concentração do
3-NP, menores serão os números da enzima nos núcleos estriados de camundongos wild
type. Essa relação se dá graças ao comportamento neurotóxico característico da atividade
do 3-NP, responsável pela degeneração neural e por inativar de forma irreversível a enzima
succinato desidrogenase (SDH).
O ácido 3-nitropropiônico ao ser oxidado se liga a resíduos presentes no sítio ativo da
enzima de forma covalente, bloqueando o ciclo do ácido cítrico, paralisando assim a
respiração celular e prejudicando a produção de energia. Dessa forma, o 3-NP realiza o
controle negativo da expressão da succinato desidrogenase, fazendo com que as taxas
relacionadas à sua concentração decresçam conforme a presença deste em meio celular
aumente.
O gráfico apresenta dados que comparam o efeito do ácido 3-NP sobre a despolarização
da membrana plasmática de neurônios estriatais de animais selvagens – representados
pelas barras brancas – e camundongos R6/2 – representados pelas barras pretas - (Figura
3). Ambos os tipos de animais estudados – animais WT e camundongos R6/2 –
apresentaram aumento nos níveis de despolarização da membrana plasmática induzida por
3-NP, entretanto, os camundongos mutantes para a huntingtina humana apresentaram
valores maiores para a despolarização quando comparados aos valores indicados para os
WT, revelando assim uma relação entre a expressão da HTT mutante e uma maior
disposição à despolarização de membrana induzida pelo 3-NP.
Tendo como objetivo a compreensão da relação existente entre a presença do ácido
3-nitropropiônico e os níveis deATP, um experimento que demonstra o efeito do ácido 3-NP
sobre as concentrações de ATP em neurônios estriatais provenientes de camundongos WT
quando comparados aos níveis de células de controle não exposta foi conduzido (Figura 4) .
Os dados obtidos revelam que o aumento nos níveis de de 3-NP têm como consequência
a redução na concentração de ATP nas células do núcleo estriado e, mais precisamente,
uma redução percentual média de 50% sobre a concentração do ATP foi apresentada –
quando comparada às células controle -. Acredita-se que a justificativa para a ocorrência do
déficit energético apresentado pelos neurônios estriatais esteja baseada na capacidade de
inibição do complexo II da cadeia transportadora de elétrons pela ação do ácido
3-nitropropiônico. Este, ao bloquear o ciclo de Krebs, prejudica a produção de NADH
destinado ao complexo I, que por sua vez, resultará na inibição do complexo II em virtude
da interrupção do transporte de elétrons que, consequentemente, culminará na queda das
taxas de síntese de ATP.
Visando elucidar a associação entre as taxas de consumo de oxigênio e a presença da
forma mutante da HTT, mitocôndrias isoladas tiveram seus números - relacionados ao uso
de oxigênio - medidos para diferentes concentrações de substratos indutores da respiração
celular: succinato ou uma mistura de glutamato e malato.
As taxas de consumo apresentadas pelos animais selvagens - representadas barras
pretas- e as taxas dos camundongos mutantes R6/2 - barras cinzas - referem-se à
atividade de mitocôndrias provenientes de neurônios estriatais. Para as diferentes
concentrações das substâncias utilizadas para estimular a respiração celular, os animais do
tipo WT mostraram taxas de consumo mitocondrial de oxigênio maiores quando
comparadas às taxas apresentadas pelos camundongos R6/2.
Para tal cenário, pressupõe-se que o estresse oxidativo e o desbalanço mitocondrial -
característicos do quadro sintomático da DH - causados pela presença da HTT mutante,
sejam os responsáveis pela discrepância no consumo de oxigênio entre os dois organismos
analisados, uma vez que a função mitocondrial é comprometida mediante ao aumento dos
níveis intracelulares de ROS e influxo excessivo de íons Ca2+, os quais se apresentam
como resultado da ação da proteína mutante.
Discussão: Os mecanismos da neurodegeneração da DH se dão através da expansão da
trinca CAG, como já apresentado neste estudo. Os meios utilizados para o desenvolvimento
da patologia são as vias protéicas. Evidenciou-se que os neurônios do corpo estriado são
os mais afetados pela excitotoxicidade e da neuropatologia induzida na DH em modelos que
contam com a presença da HTT mutante, e nesse estudo, o 3-NP, visto que, como foi
demonstrado através de experimentos, a mHTT possui seletividade por exercer influência
sobre células com receptores NMDA com maior quantidade de subunidades do tipo NR2B,
os neurônios estriatais apresentam riqueza na presença dessas subunidades.
Em suma, a despolarização da membrana e o prolongamento do tempo em que a célula
passa em potencial de repouso resulta na hiperativação dos receptores NMDA, que por sua
vez, se ligam ao Mg2+ ao invés do glutamato, tendo como consequência uma maior
concentração de glutamato livre. A presença desse glutamato livre no meio celular e a
exposição dos neurônios a este neurotransmissor por um período maior resulta na
excitotoxicidade do SNC. Como consequência há o influxo de Ca2 +, a manutenção da
despolarização da membrana, morte celular, entre outros fatores que levam aos danos ao
tecido neural.
Substâncias como o ácido 3-NP, que possuem capacidade inibitória sobre o complexo II
da cadeia respiratória, têm sido usadas como agentes químicos capazes de induzir o
quadro sintomático e a neuropatologia da DH. Os modelos de estudo para a Doença de
Huntington desenvolvidos com a toxina exógena 3-NP fornecem a base teórica que indica a
influência dos receptores NMDA na desenvoltura excitotóxica da doença. Essa relação se
estabelece em virtude da deficiência da produção de ATP pelo comprometimento do
metabolismo energético mitocondrial, que pode resultar na despolarização da membrana
celular, tornando os neurônios mais suscetíveis a níveis anormais e endógenos de
glutamato. O glutamato quando em excitotoxicidade causa comprometimentos metabólicos
como a formação de espécies reativas de oxigênio, combinado com o estresse oxidativo,
que resultam no desbalanço metabólico e consequente desativação de proteínas
importantes como a enolase e a aconitase, que são de extrema importância para o pleno
funcionamento do ciclo do ácido cítrico. O excesso de glutamato livre desativa a
desidrogenase succinato, o que causa a elevação do lactato e a diminuição da síntese de
ATP, através do bloqueio do ciclo do ácido cítrico, levando a deficiência energética daquele
metabolismo, e os danos ocorrem em cadeia, pois sem energia, ocorre a morte neuronal
progressiva. Evidências apontam que a despolarização da membrana neuronal está
associada à concentração de glutamato nas fendas sinápticas, e em situações de HTT
mutante, os receptores NMDA estão em superestimulação.
Com a membrana despolarizada, o resultado é a retenção de Mg2+ e consequentemente
um aumento da concentração de Ca2+ no meio intracelular a níveis neurotóxicos, devido a
alta atividade do sistema glutamatérgico, isto é, em excitotoxicidade do glutamato. Pode-se
observar que a relação entre a concentração de glutamato com a concentração de ATP nas
células do núcleo estriado é inversamente proporcional, e isso foi possível de se observar
através da hipótese da inibição do complexo II da cadeia transportadora de elétrons, o que
afeta diretamente a produção de NADH. Por outro lado, com essa relação entre ATP,
glutamato e NADH, é possível concluir também que o glutamato age de de forma prejudicial
nos complexos I e II devido a deficiência de ATP, resultante da presença do glutamato na
mitocôndria, que inibe a ação dos complexos da cadeia respiratória. É necessário que os
mecanismos do estresse oxidativo, do desbalanço mitocondrial e da deficiência energética
sejam elucidados. Podemos explicar através da mutação da proteína HTT, porém,
aprofundando-se um pouco mais, podemos relacionar esses processos patológicos à ação
do glutamato. Principalmente a deficiência energética, com a inibição dos complexos I e II
da cadeia respiratória, que pode ser explicada pela atividade em excitotoxicidade do
sistema glutamatérgico, que induz o aumento do consumo de oxigênio, para que o
gradiente eletroquímico seja reconstituído, numa tentativa celular de manter a homeostase.
Conclusão: Por conseguinte, foi exposto que a capacidade modulatória do glutamato em
altas concentrações endógenas provou-se como um fomentador da neuropatologia e agente
ativo da excitotoxicidade por trás do quadro neurotóxico da DH.
Ademais, o sucesso em induzir o comportamento bioquímico de células acometidas pela
presença da forma mutante da HTT - explicitado pelos resultados dos experimentos
presentes nos gráficos - o qual abrange desde a paralisação de complexos respiratórios,
passando pelo prejuízo energético e disfunção mitocondrial até a morte celular, por meio do
uso exógeno da neurotoxina 3-NP contribuiu para a confirmação do papel de destaque do
glutamato nos mecanismos por trás da DH.
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