Coloração de GRAM

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1. Equipamentos laboratorio 
- Placas de Petri 
- Meio de cultura 
- Autoclave – esterilização através do calor úmido 
- Estufa bacteriológica – mantém temperatura (incubação) 
Preparo do meio de cultura 
- Depois de preparar o meio de cultura é colocado na 
autoclave até 121ºC por 15 minutos 
Há materiais que serão esterilizados por óxido de etileno ou 
radiação gama 
 
2. Cultivo de microrganismos 
- Inoculação em meio de cultura adequado e incubação em 
condições ambientais igualmente adequadas 
Meios de cultura – nutrientes 
Condições ambientais – temperatura, PH (maioria cresce no 
PH neutro), Oxigênio 
Meio de cultura 
- Mistura de nutrientes necessários ao crescimento 
microbiano 
- As bactérias apresentam exigências nutricionais 
diferentes, portanto há diversos meios de cultura 
Tipos do meio de cultura 
- Meio sólido: quando a solução nutriente é gelificada por um 
polímero extraído de algas, o ágar. Meio é geralmente 
utilizado para obter colônias isoladas. Cada célula bacteriana 
ou agrupamento isolado dá origem, por multiplicação, a um 
aglomerado que constitui colônia 
Incubado de 18 a 24 horas na estufa na temperatura de 
35º 
 
 
 
 
Meio complexo 
- Não conhece exatamente sua composição qualitativa, nem 
quantitativa. Este meio é preparado com extratos 
desidratados de diversos órgãos de diferentes animais 
Ex: BHI – rico em nutrientes 
Meio seletivo 
- Contém substâncias que inibem o crescimento de um 
determinado grupo de microrganismos, mas permite o 
desenvolvimento de outros 
Ex: MacConkey (seletivo para bactérias GRAM negativas) 
Meio diferencial 
Permite a distinção de colônias de bactérias diferentes 
Ex: Ágar sangue 
- Diferenciação de hemólise de Streptococcus spp. 
Distingue quanto a capacidade hemolítica 
MacConkey 
- Permite a distinção de colônias de bactérias diferentes 
- Bactéria que não fermenta fica bege 
Bacterias Gram – Positivas 
 Possui parede celular mais espessa. 
 Parede celular composta de peptídeoglicano, proteínas e 
ácidos teicoicos (que atuam na entrada e saída de cátions, 
proteção de rupturas, promovem adesão e especificidade 
antigênica). 
 Em coloração de Gram é visualizada na cor ROXA. 
 São mais sensíveis à penicilina. 
 Ácido teicoico e lipoteicoico: (1) Mantem a parede estável 
quando há divisão; (1) Estimulam a reposta imune e fatores 
de virulência; (3) Sítios receptores de bacteriófagos; (4) 
Facilita ligações da bactéria; (5) Serve de sitio de ligação com 
epitélio do hospedeiro. 
 Podem formar esporos (estrutura que protege a bactéria 
de condições extremas) 
 Ex: Staphylococcus, Streptococcus 
 
Coloração de GRAM 
 
Bacterias Gram - Negativas 
 Possui parede celular mais complexa. 
 Além de uma membrana plasmática, contém uma fina 
camada de peptídeoglicano e uma segunda membrana 
externa (bicamada lipídica assimétrica). 
 Há um espaço entre o peptideoglicano e a membrana 
externa, denominado espaço periplasmático (local de ação de 
várias enzimas). 
 Presença de lipopolissacarídeo na membrana externa 
(barreira para moléculas grandes e hidrofóbicas, incluindo 
alguns antibióticos). 
 Em coloração de Gram é visualizada na cor ROSA. 
 Menos sensível a ação de penicilinas e derivados 
 Ex: Excherichia coli, Pseudomonas. Obs: saber se a 
bactéria é gram-positiva ou gram-negativa é importante 
quanto ao uso de antibióticos. 
 
Passos para a coloração de Gram: 
1. Aplicação de cristal de violeta (afinidade por 
componentes de carga negativa) 
- O corante liga-se ao fosfato livre e cora todas as 
bactérias presentes 
2. Aplicação de iodo (ajuda a fixar o cristal). 
- Lugol (solução iodo-mordente) – intensifica a cor 
3. Lavagem com álcool (nos Gram negativos, como a 
camada de peptídeoglicano é menor, o álcool cria 
poros na parede e promove a saída do corante 
violeta associado ao iodo) 
- Álcool acetona (solução diferenciadora) 
- GRAM positivo – continuam roxa 
- GRAM negativo – perdem a cor (incolores) 
4. Aplicação do contracorante Safranina (Gram 
positivos não perdem o cristal violeta, logo 
permanecem com essa cor, já os negativos são 
corados nessa etapa e ficam róseos).