Biologia Molecular - Aglutinação

Prévia do material em texto

aglutinaçãoAglutinação
Métodos híbridos: a amplificação do sinal também
pode ser obtida com o emprego de partículas grandes
que entram na reação antígeno/anticorpo e aumentam
o tamanho dos imunocomplexos, como na aglutinação
e nos métodos automatizados de precipitação.
A aglutinação é um método híbrido porque o reagente
não está marcado por nenhuma substância radioativa,
enzimática, quimioluminescente ou fluorescente. O
reagente está ligado por uma partícula grande que
torna os imunocomplexos muito maiores, mesmo em
baixas concentrações de antígenos ou anticorpos.
Por sua vez, nos métodos automatizados de
precipitação, diferentemente da aglutinação, não há a
amplificação exata do sinal, mas uma leitura muito
mais sensível, automatizada.
A aglutinação caracteriza-se pela formação de
agregados visíveis como resultado da interação de
anticorpos específicos e partículas insolúveis que
contêm determinantes antigênicos em sua superfície.
As reações de aglutinação acontecem em dois estágios
que ocorrem quase ao mesmo tempo. O que diferencia
eles é que o primeiro é um estágio bem rápido,
enquanto o segundo é mais longo.
1º Estágio: ligação das moléculas do anticorpo aos
antígenos de superfície, de uma molécula natural ou
aos antígenos que estão ligados a uma partícula, por
meio de ligações não covalentes. Ou seja, a primeira
coisa que acontece no primeiro estágio é a primeira
ligação.
2º Estágio: resulta das colisões que ocorrem entre as
partículas, ou seja, o imunocomplexo pequeno começa
a se chocar com outros pares de antígenos ou
anticorpos que se ligaram na amostra. Na sequência, Ac
ligados a uma partícula ligam-se a determinantes
antigênicos de outra. Uma IgG tem dois sítios de
ligação. Se pensarmos, no primeiro estágio, uma IgG
ligou-se a um antígeno e outra IgG ligou-se a outro
antígeno, no primeiro estágio haverá o choque entre
elas, resultando na formação de um imunocomplexo, já
que o sítio livre de ligação do anticorpo vai se ligar ao
mesmo antígeno em outro determinante antigênico do
mesmo antígeno. Esses imunocomplexos vão ficando
grandes e podem ser visíveis a olho nu ou no
microscópio.
Por isso, a aglutinação é uma técnica semi-
quantitativa, porque tem-se o aspecto qualitativo de
controle de perceber se é positivo ou negativo, mas não
é possível determinar um valor, ou seja, dar uma leitura
para ela. No entanto, através de diminuições seriadas é
possível fornecer um título.
A aglutinação é mais sensível que a precipitação
(necessitam de uma quantidade de Ac 500 vezes
maior), pois as partículas amplificam a reação. Além
disso, é empregada para o diagnóstico laboratorial de
doenças autoimunes, doenças causadas por vírus,
bactérias, protozoários e fundos, na detecção de
hormônios, na tipagem de grupos sanguíneos etc.
A formação do agregado que vai permitir a leitura da
reação é influenciada por variáveis.
Se é um anticorpo da classe IgM, o anticorpo é
pentamérico. Logo, enquanto o IgG se liga a dois
antígenos, o IgM pode ligar-se a 5 antígenos,
amplificando a reação e facilitando a formação de
imunocomplexos grandes, que vão dar mais
sensibilidade à reação. Por isso, o anticorpo influencia
muito.
Na aglutinação, o pH ideal para se processar é de 6 a 8.
Ademais, quando há pouca molécula hidrofílica no
material, a aglutinação fica prejudicada, razão pela
qual o aumento desse tipo de molécula favorece a
reação. Por sua vez, a presença de enzimas consegue
afastar a ocorrência de reações inespecíficas, dando
mais especificidade para a reação.
Quando se faz uma leitura muito rápida na aglutinação,
sem aguardar a formação dos imunocomplexos, é
possível haver um resultado falso negativo. Também é
importante uma temperatura para realizar essa leitura.
Todos esses fatore interferem na formação dos
agregados e devem ser considerados na hora da
reação.
Obs: A aglutinação pode ser feita em tubo ou placa:
Tubo: quando resultado para o teste é positivo, forma-
se um aglutinado como apresentado na imagem. Já no
resultado negativo, não há nenhuma formação de
aglutinado, fazendo com que a solução fique
totalmente formada.
Placa: geralmente nas placas de 96 poços. A formação
do botão de hemácias na placa revela uma reação
negativa, porque as hemácias continuaram na amostra
sem se agregar, indo para o fundo da placa. Por outro
lado, quando há a formação de um tapete no fundo da
placa, o resultado é positivo. Com cartões em um fundo
escuro, quando há uma solução totalmente
homogênea, o resultado é negativo, enquanto a
formação de grumos é um resultado positivo.
Há mais duas variáveis para a aglutinação:
Direta: O princípio da aglutinação é que o antígeno está
aderido a uma partícula, porque ela é que vai 
 amplificar o sinal e dar as qualidades dessa 
 reação. Na aglutinação direta, as partículas já
apresentam determinantes antigênicos naturais em
sua superfície (hemácias, bactérias, protozoários etc.). A
titulação do grupo sanguíneo ABO é feita porque as
hemácias do grupo A, B ou AB tem os antígenos
naturalmente na sua superfície, logo uma
determinação de grupo sanguíneo é uma aglutinação
direta.
Quando se está pesquisando uma bactéria ou
protozoário, por exemplo, o antígeno pesquisado não
foi inserido por alguém, mas esse micro-organismo que
já tem aquele antígeno naturalmente expresso em sua
membrana.
Fenômeno de prozonaFenômeno de prozona
Indireta ou passiva: Partículas inertes (látex,
poliestireno etc.), ou com células antigenicamente não
relacionadas (hemácias, bactérias), às quais se 
 adsorvem ou se fixam Ag solúveis. Na aglutinação
indireta ou passiva, a partícula inerte ou a célula
biológica teve um antígeno solúvel adsorvido (colado, 
pregado) na sua superfície. Quando se tem uma 
 hemácia ou bactéria, nesse caso, não se está
pesquisando um antígeno natural dela.
É a possibilidade de resultados falso-negativos em
caso de elevado título de anticorpos aglutinantes.
Nesse caso, a amostra tem o anticorpo que se está
pesquisando, mas a quantidade é tão grande que
acaba dando um falso-negativo. Esse fenômeno deriva
de uma reação desproporcional entre o antígeno e o
anticorpo. Com isso, em um teste sem diluir, o
resultado falso-negativo aparece.
No primeiro desenho, há 3 antígenos e 5 anticorpos. Os
anticorpos vão se ligar ao antígeno e bloquear toda a
sua estrutura, impossibilitando a formação de um
imunocomplexo. O máximo que ocorre de ligação é de
dois anticorpos com um antígeno no meio. Isso não é
capaz de formar um imunocomplexo grande o
suficiente para ser visualizado a olho nu. Isso é
chamado de pró-zona e tem a leitura do falso-negativo.
Na segunda imagem, há o desenho de uma zona ideal,
chamada de zona de equivalência. Os imunocomplexos 
são grandes suficientes porque a quantidade é 
 proporcional à quantidade de antígenos. A leitura
nesse tipo de zona é positiva.
No último desenho, há a pós-zona que revela uma 
 leitura de negativo verdadeiro. A quantidade de
antígeno é maior do que de anticorpos. O título de
anticorpo fica menor que o limite de reatividade.
capaz de formar um imunocomplexo grande o
suficiente para ser visualizado a olho nu. Isso é
chamado de pró-zona e tem a leitura do falso-negativo
No primeiro desenho, há 3 antígenos e 5 anticorpos. Os
anticorpos vão se ligar ao antígeno e bloquear toda a
sua estrutura, impossibilitando a formação de um
imunocomplexo. O máximo que ocorre de ligação é de
dois anticorpos com um antígeno no meio. Isso não é
Na segunda imagem, há o desenho de uma zona ideal,
chamada de zona de equivalência. Os imunocomplexos 
são grandes suficientes porque a quantidade é 
 proporcional à quantidade de antígenos. A leitura
nesse tipo de zona é positiva.
No último desenho, há a pós-zona que revela uma 
 leitura de negativo verdadeiro. A quantidade de
antígeno é maior do que de anticorpos. O título de
anticorpo fica menor queo limite de reatividade.
Entretanto, se o in natura deu negativo, é preciso
avaliar a opção diluída. Se a opção diluída deu 
 negativo, a amostra é realmente negativa. Porém, 
 se der positivo, significa que havia uma situação de
pró-zona, em que havia tanto anticorpo que não era
possível formar os imunocomplexos. Ao fazer a diluição
foi possível fazer os anticorpos não ficarem livres, ou
seja, em excesso.
Zona de equivalência: Ag-Ac se ligam equimolarmente,
formando uma rede estável.
Excesso de antigeno: Os complexos podem ser
dissolvidos quando há excesso de Ag, pois o Ac fica 
 livre para se ligar a novos Ag adicionados, 
 diminuindo a formação de complexos insolúveis.
Excesso de Ac: Ocorre redução de imunocomplexos,
pois todo o Ag está precipitado e fica Ac livre no
sobrenadante.
Pró-zona é igual a anticorpo livre. Para fazer a
eliminação do problema é preciso fazer diluições
seriadas do soro.
–Exemplo: fazer um teste da amostra in natura e outro
com ela diluída em 1 para 10. Se o resultado in natura
foi positivo, então trata-se de uma amostra realmente
positiva
Aglutinação diretaAglutinação direta
É o tipo de aglutinação em que a partícula utilizada
tem o antígeno ligado à sua superfície de forma
natural, ou seja, partículas antigênicas insolúveis em
sua forma íntegra ou fragmentada. Esse método é
utilizado para hemácias, bactérias, fungos e
protozoários podem ser aglutinados diretamente por
Ac.
Nesse sentido, a aglutinação direta fará, basicamente, a
pesquisa de Ac (IgG ou IgM – é mais eficiente, porque é
pentamérica) específicos com diluições seriadas do Ac,
frente a uma quantidade constante de Ag. O resultado,
normalmente, será expresso em título do Ac. No
entanto, não se trata de regra, pois o ABO, por exemplo,
não tem título. O título é inverso da máxima diluição
em que ocorre a aglutinação
Exemplo: amostra foi testada in natura com resultado
positivo. Para saber o grau de positividade é preciso
pegar o soro e fazer diluições seriadas: ½, ¼, 1/8, 1/16 (o
denominador da fração está sempre sendo 
 multiplicado por 2). Ao verificar que aglutinou em
 ½, ¼ e 1/8, mas no 1/16 não aglutinou, nesse caso, 
 o título da reação será o inverso da última 
 diluição que foi positiva, ou seja, o título é 1/8, já que a
diluição foi em 8 vezes
Hemácias como Ag: tipagem de grupos
sanguíneos do sistema ABO e Rh e a reação de
Paul-Bunnel-Davidson (diagnóstico da
mononucleose). Na doença mononucleose, o 
 indivíduo possui anticorpos da classe IgM que 
podem ser identificados ao aglutinar as hemácias
através do método de aglutinação direta.
Ag íntegros ou fragmentados de microrganismos: 
teste de Wright (brucelose), o teste de Weil-
Felix (riquetsiose) e aglutinação para
leptospirose, toxoplasmose e tripanossomíase.
No laboratório, para saber qual o grupo sanguíneo, é
preciso testar as hemácias com o soro anti-A e anti-B. O
resultado se dará conforme a tabela a seguir:
É o principal exemplo da aglutinação direta. Os
indivíduos que são membros do grupo A terão na sua 
 hemácia os antígenos classificados no grupo A. Eles 
produzem naturalmente anticorpos contrários ao
grupo B. No grupo B, os indivíduos terão o anticorpo A e
o antígeno B. No grupo AB, há os antígenos A e B sem a
presença de anticorpos. Por último, o grupo O é a
ausência de antígenos na superfície da B, logo se
produz os anticorpos contra A e B.
Grupo ABOGrupo ABO
O mesmo tipo de teste serve para saber o RH. Se o
paciente tem o antígeno R e não tem o anticorpo,
significa que o RH é positivo. Mas, se não há o antígeno
nem o anticorpo, significa que o RH é negativo. Para o
grupo RH, não há produção natural espontânea de
anticorpo. Essa é uma especificidade do RH: o anticorpo
só será produzido quando o organismo entra em
contato com uma hemácia que possua o antígeno RH,
ou seja, se for sensibilizado.
Obs.: O antígeno D é o principal do grupo RH e 
 corresponde a 80% dos antígenos que formam esse
sistema. Por isso, é possível falar em grupo RH ou anti-
D como sinônimo.
Inibição de hemaglutinaçãoInibição de hemaglutinação
diretadireta
Realizada para pesquisa de Ac contra determinados Ag
virais capazes de, espontaneamente, aglutinar
hemácias. Esse teste é bem específico. Alguns vírus, 
 quando entram em contato com as hemácias
humanas, espontaneamente as aglutinam.
Se o paciente tem o vírus, ele produz anticorpos contra
eles, por isso, para saber se ele tem os anticorpos, é
preciso pegar o soro do paciente e incubar com o vírus
por, aproximadamente, 1 hora. Ocorrendo o que a
imagem especifica:
A formação de um tapete no fundo da placa de 96
poços é um resultado negativo para a presença de
anticorpos.
Ausência de hemaglutinação: resultado POSITIVO
para a presença do vírus. Ou seja, os anticorpos
impediram os vírus de fazerem a hemagutinação.
Quando os Ac (IgG ou IgM) estão presentes, 
 revestem as partículas virais, impedindo a
hemaglutinação espontânea.
Se o paciente não tem o anticorpo pesquisado, o vírus
aglutina todas as hemácias, formando o tapete no
fundo do poço, dando um resultado negativo.
Obs.: Exemplo de vírus hemaglutinantes: rubéola,
sarampo, influenza. 
A formação de botão indica o resultado positivo para a
presença do anticorpo pesquisado contra um
determinado vírus
Na aglutinação indireta ou passiva, a molécula usada
como base para a aglutinação é sintética ou biológica
com a adsorção de um antígeno que não é natural dela.
As partículas inertes (látex, poliestireno etc.) ou 
 células (hemácias, microrganismos) são sensibilizadas
com Ag solúveis. As hemácias são um dos melhores
suportes de antígenos, tendo um grande número de
antígenos que podem ser ligados a sua superfície de
forma bastante sensível. Por isso, muitas vezes, é
melhor usá-la do que uma partícula inerte.
Adsorção passiva: antígenos polissacarídios. No
processo, a partícula de látex é deixada em contato
com o antígeno e, espontaneamente, acontece a
ligação.
Adsorção via agentes químicos: antígenos proteicos. No
processo, a adsorção é forçada com a ajuda de agentes
químicos.
Conjugação do Ag por ligações covalentes: o antígeno
é ligado por ligações covalentes.
Devido à presença de uma grande diversidade de Ag
que podem se ligar às células ou partículas, no método
de aglutinação indireta, a aplicação dos testes de
aglutinação passiva é muito variada: Toxoplasmose,
Chagas, Fator Reumatoide, ASLO, PCR, Sífilis
Aglutinação indireta ouAglutinação indireta ou
passivapassiva
A imagem com número 5 é um resultado negativo para
o fator reumatoide, enquanto a de número 6
demonstra um resultado positivo
A pesquisa de Ac (IgG ou IgM) específicos é feita com 
diluições seriadas do Ac, frente a uma quantidade
constante de Ag. O resultado, normalmente, é expresso
em título do Ac, ou seja, inverso da máxima diluição em
que ocorre a aglutinação. Se o último resultado
positivo foi a diluição em 16 vezes, o título será de 1/16,
por exemplo.
Fator Reumatoide é um anticorpo que ataca os
anticorpos naturais. Ele é da classe IgM, logo é
pentamérico e liga-se a porção Fc das moléculas dos
anticorpos IgG naturais. Ele aparece, principalmente,
em doenças autoimunes, reumáticas, processos
infecciosos, degenerativos, entre outros. Quando a IgM
é adsorvida na superfície do látex com o soro do
paciente para reagir (com IgG), a IgM vai ligar-se à
porção Fc da IgG e formar a aglutinação, dando um
resultado positivo para o teste.
Exemplo: em uma molécula de látex foi agregado um
antígeno. A pesquisa é para saber se no soro do
paciente há o antígeno de superfície da hepatite B.
Primeiro, incuba-se o soro do paciente com o antígeno
anti-HBS. Se, no soro do paciente, há o antígeno B, vai
haver a ligação. Quando isso for incubado com o látex
contendo o antígeno na sua superfície, nada vai
acontecer, porque os anticorpos já estãoocupados
pelos antígenos do soro do paciente.
O grau de inibição relaciona-se com a quantidade do
Ag presente na amostra e com a afinidade pelos sítios 
de combinação do Ac. A ausência de 
 hemaglutinação: resultado POSITIVO para a presença
dos antígenos.
Obs.: Exemplo da inibição da hemaglutinação indireta:
HbsAg.
Inibição de hemaglutinaçãoInibição de hemaglutinação
indireta ou passivaindireta ou passiva
A única diferença entre a inibição da hemaglutinação
direta com a indireta é a partícula. Na forma indireta, é
realizada para pesquisa de Ag que competem com o Ag
adsorvido no suporte pela ligação aos Ac adicionados.
MicrofloculaçãoMicrofloculação
Esse é um método para testar a presença dos 
 anticorpos para Sífilis. É um teste de aglutinação de
cristais de colesterol, descoberto pelo VDRL (venereal
disease research laboratory). Consiste no emprego 
 de cristais de colesterol sensibilizados com lecitina 
e cardiolipina (molécula de natureza lipídica e muito
semelhante ao material genético da bactéria
causadora da sífilis) para a pesquisa de Ac na sífilis.
Positivo: formação de flóculos. Se o paciente está 
 contaminado com Sífilis, há a produção dos
anticorpos que serão enganados quando entram em
contado com a cardiolipina, achando que elas são uma
porção lipídica do treponema pallidum. A formação dos 
imunocomplexos vão formar uma molécula 
 insolúvel que irá flocular. A formação dos flóculos
indica um teste positivo para VDRL
Negativo: aspecto homogêneo e sem agregados. Há a
presença de uma “areia” bem fina, porque a
cardiolipina, devido ao cristal de colesterol, acaba
sendo visível a olho nu, mas é muito menor que no
resultado positivo