Resumo 19 - Imunoensaios

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Resumo da Malu – 2020.2 
Imunoensaios
Aplicações dos Testes Imunológicos 
 
→ Diagnóstico de diversas doenças: 
• Baseada na pesquisa do antígeno, detectando a presença 
do patógeno, de partes do patógeno, ou de seus produtos 
em amostras clinicas 
• No passado, era uma técnica completamente indireta pois 
a soberania estava com a microbiologia – que pegava uma 
amostra clinica de paciente e isolava o microorganismo 
daquela amostra e comprovava a presença do patógeno 
no paciente, e muitas vezes não se conseguia fazer isso 
devido à dificuldade de se manipular esses patógenos (por 
não crescerem em meios artificiais, por demorar semanas 
para serem isolados como no caso de vírus, que dependem 
de hospedeiros vivos) 
• Logo, a imunologia era uma ferramenta muito importante, 
pois naquela época, se conseguisse detectar o aumento na 
quantidade de anticorpos em um soro de paciente com 
determinado patógeno, estava configurado que esse 
indivíduo estava tendo uma infecção por aquele patógeno 
• Com isso, houveram muitos avanços no uso da imunologia 
no diagnóstico a partir do momento em que foram 
produzidas técnicas que conseguem detectar a presença 
do patógeno, de partes dele, ou de produtos do patógeno 
nas amostras clínicas 
 
→ Acompanhamento terapêutico: 
• As técnicas de diagnóstico possuem grande uso para o 
acompanhamento terapêutico 
• Logo, se começar um tratamento baseado em determinado 
diagnóstico, o patógeno vai desaparecer ou os anticorpos 
diminuem muito a sua quantidade, restando apenas um 
nível basal devido a memória imunológica induzida pelas 
células imune quando o sistema imune é estimulado 
 
→ Epidemiologia 
• O diagnóstico, acompanhamento terapêutico e a pesquisa 
possuem grande importância na epidemiologia 
• Para a epidemiologia, cada vez que se detecta grupos 
sorológicos ou tipos sorológicos de determinado patógeno 
circulando na população através de testes de diagnóstico, 
se consegue mapear então esse patógeno na população, e 
com isso, desenvolve-se terapias mais adequadas 
- Vacinas mais adequadas para aquela população 
 
→ Pesquisa: 
• Essencial para a montagem de um kit de diagnóstico 
 
Reações Antígeno X Anticorpo 
 
→ Sorologia: 
• Pesquisa indireta 
• Avalia a presença de antígenos ou anticorpos no soro do 
paciente 
• Envolve o diagnóstico das infecções através da detecção 
de anticorpos e antígenos, e baseada nela pode-se realizar 
o monitoramento do tratamento 
 
→ Imunohistoquímica, Imunofluorescência, Citometria de Fluxo: 
• Técnicas voltadas para a pesquisa de células ou patógenos 
presentes em amostras clínicas (tecido ou célula) 
• Pesquisa de bacilo da tuberculose ou da lepra em biopsia 
de tecido 
• Citometria de fluxo – pesquisa na própria célula presença 
de células alteradas, tumorais, etc 
 
→ Características das reações antígeno X anticorpo: 
• Especificidade: 
- Seria a especificidade da interação do anticorpo com o 
antígeno que deu origem a ele 
- O anticorpo é formado sob influência de características 
estruturais do antígeno → logo, seja um Ag molecular ou 
um patógeno inteiro, o epítopo da molécula presente na 
estrutura do patógeno ou que é liberada pelo patógeno, 
que vai selecionar o receptor do linfócito B determinando 
qual linfócito B que vai responder contra ele produzindo 
seus anticorpos 
- A sequência de aminoácidos do sítio combinatório é 
complementar a configuração espacial do epítopo, visto 
que o que une um e outro são ligações de curto alcance 
- Quanto maior for a especificidade do encaixe do Ag ao 
Ac, mais forte e homóloga será essa interação 
• Afinidade: 
- É a força de interação de um único epítopo com um único 
sítio combinatório do anticorpo 
- Epítopo imunodominante – presente quando o antígeno 
e o anticorpo são quase ou totalmente complementares, 
e a força de ligação entre eles é muito grande, devido a 
afinidade ser muito alta 
- Quando o encaixe não é muito perfeito, a afinidade é 
menor, pois o numero de sequencias de aminoácidos 
daquele epítopo, interagem com um numero menor de 
ligações no anticorpo 
- No entanto, pode-se encontrar antígenos que possuam 
ou um epítopo igual ou similar (sequencias de aas iguais 
ou similares) ou epítopo homólogo ou imunodominante, 
sendo chamados de epítopos de reação cruzada 
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- A reação cruzada pode mascarar o resultado de um 
diagnóstico → quando se faz um diagnóstico baseado na 
pesquisa e na quantidade de anticorpos contra um 
patógeno, caso se tenha um anticorpo interagindo com 
um antígeno de outro patógeno, no exame vai ser 
detectado uma quantidade de anticorpos muito maior 
que não apenas o anticorpo específico contra aquele 
patógeno 
- Os antígenos que melhor estimulam a resposta imune são 
os epítopos imunodominantes, pois os anticorpos serão 
formados primeiramente contra eles, por terem alta 
afinidade pelo receptor 
- A mesma linha de raciocínio serve para o MHC, ou seja, 
antígeno que se melhor se ligar ao MHC com uma maior 
afinidade, será também melhor apresentado para o LT 
• Avidez: 
- É a força de ligação total entre um antígeno (com seus 
muitos epítopos) aos anticorpos multivalentes 
- IgG: 
♥ É um monômero com 2 valências 
♥ Realiza uma ligação bivalente 
♥ Possui alta afinidade (sofre maturação de afinidade 
que foi induzida por Ags timo-dependentes) 
♥ Avidez alta apenas para antígenos solúveis (epítopos 
acessíveis), pois a possibilidade de todos os epítopos 
ligarem às valências da IgG será maior 
- IgM: 
♥ É um pentâmero com 10 valências (são 5 monômeros 
ligados por uma cadeia J) 
♥ Ligação pentavalente (com sítios de ligação idênticos) 
♥ A afinidade de cada sítio para o antígeno é baixa (não 
sofre maturação de afinidade, logo, é um anticorpo de 
resposta primária) 
♥ Avidez total do Ac para o Ag multivalente elevada 
- Devido ao seu número maior de valências, a IgG terá um 
numero maior de avidez por determinado antígeno, do 
que a IgG 
• Estado físico do antígeno: 
- Quando se tem um anticorpo IgG contra determinada 
partícula, dificilmente ele conseguirá ligar todas as suas 
valências em uma mesma partícula, embora a valência 
seja igual para os epítopos dessa partícula 
- Quando o antígeno é uma molécula, a ligação dessas 
valências da imunoglobulina aos epítopos da molécula se 
torna mais fácil, se os epítopos estiverem próximos um do 
outro (isso é necessário para a ativação do complemento 
pela IgG, onde se precisa de pelo menos 2 IgGs próximas 
em uma mesma molécula) 
- Já no caso da IgM, o antígeno ser uma partícula não é 
um problema, pois ela não só ativa eficientemente o 
complemento, como também é capaz de ligar várias 
partículas entre si, e era nessa ligação que se baseava 
uma relação antígeno X anticorpo 
• Concentração Antígeno X Anticorpo: 
- Equivalência antígeno e anticorpo – para se ver a reação 
Ag X Ac, deve-se ter uma zona de equivalência, onde a 
quantidade de anticorpo e de antígeno devem estar 
equivalentes de forma a permitir a formação de um 
grumo (a IgM ligando uma partícula na outra, essa 
partícula pesava e pela força da gravidade, ela ia para 
o fundo do tubo de ensaio) 
- Excesso de anticorpo – no entanto, se houver um excesso 
de anticorpo no soro, e ele for colocado no tubo de 
ensaio com determinada concentração de antígeno, os 
anticorpos por estar presente em grande quantidade, 
vão disputar os epítopos do antígeno (molécula ou 
partícula), e o Ac que sobrou vai saturar o antígeno, e 
isso não forma uma rede pesada que consiga se destacar 
no tubo de ensaio, ficando em suspensão 
- Excesso de antígeno – quando há excesso de antígeno, 
ocorre um consumo rápido dos anticorpos, logo, eles não 
são suficientes para unir um antígeno ao outro, de forma 
que o agregado consiga se destacar no solvente 
 
• Logo, toda vez que se for fazer uma reação antígeno X 
anticorpodeve-se pesquisar a zona de equivalência para 
ser possível a visualização da reação 
• Quando há um excesso de antígeno ou de anticorpo, tendo 
uma relação desproporcional entre eles, ocorre então um 
o chamado fenômeno prozona, que gera resultados falso-
negativos 
• Com o objetivo de se evitar o efeito prozona, nos kits de 
diagnóstico é sempre especificado quantas vezes deve-se 
diluir o antígeno para achar a quantidade de equivalência 
(consiste no mínimo de antígeno necessário para conseguir 
visualizar a reação) 
 
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→ Componentes das reações antígeno X anticorpo: 
• Antígenos: 
- Íntegro – pode-se usar o antígeno inteiro 
- Extrato – pode-se fazer um extrato de microorganismo, 
extraindo estruturas do patógeno, mas sem purifica-las 
- Purificado – pode-se realizar a purificação da estrutura 
(flagelo ou pilina), da glicoproteína de membrana, 
polissacarídeo de membrana ou cápsula desse patógeno 
- Recombinante – com auxílio da biologia molecular pode-
se construir um peptídeo sintético, a partir do estudo da 
glicoproteína desse patógeno, surgindo então proteínas 
recombinantes 
• Anticorpos: 
- Policlonais – oriundos de diferentes linfócitos B, eles são 
uma mistura de moléculas de Igs secretadas contra um 
antígeno específico, cada uma reconhecendo um epítopo 
diferente do mesmo imunógeno 
- Monoclonais – produzido por um único clone de linfócito 
B, se ligam a um epítopo específico do antígeno 
• As primeiras técnicas de imunoensaio se baseavam nas 
reações visíveis, pegando um antígeno e colocando-o na 
presença do soro que continha os anticorpos, e observava 
para ver se a reação ia acontecer 
- Reação de aglutinação – excelente para visualizar a 
reação de forma rápida, pois as partículas aglutinam 
formando um grumo e precipitam ficando no fundo do 
tubo de ensaio ou na lâmina de microscopia 
- Reação de precipitação – mais difícil e mais dependente 
da zona de equivalência, apesar das duas dependerem 
da equivalência antígeno X anticorpo para formar a rede 
• Com o passar do tempo, foram introduzidos os chamados 
sistemas reveladores, que permitiam revelar a reação sem 
depender muito da zona de equivalência 
- Reação de fixação de complemento – primeiro sistema 
revelador utilizado, onde se pega o antígeno, colocava o 
soro do paciente, e adicionava o complemento que fazia 
a lise, e após a reação formada colocava-se a hemácia 
com seu anticorpo ligado, e se o complemento tivesse 
livre, ele ligaria no complexo hemácia-anticorpo, lisando 
a hemácia, liberando a hemoglobina que deixava o meio 
líquido todo vermelho. No entanto, se o paciente tinha 
anticorpo ligado ao antígeno, quando se adiciona o 
complemento, ele vai se ligar na reação do antígeno com 
o anticorpo no soro do paciente, e após colocar a 
hemácia com o anticorpo, não há complemento livre para 
lisar a hemácia, que vai pesar indo para o fundo do tubo 
de ensaio → é uma reação muito trabalhosa 
- Fluorocromo 
- Radioisótopo 
- Enzimas 
 
→ Fontes Antigênicas: 
• Antígenos totais 
• Antígenos de superfície 
• Frações purificadas 
 
• Proteínas Recombinantes 
• Peptídeos Sintéticos 
 
→ Princípio da produção de anticorpos: 
• Anticorpo Policlonal: 
- A partir da inoculação de um antígeno com todos os seus 
epítopos em um animal, seguido pela coleta do soro dele 
tendo então o soro policlonal que contém todos os clones 
de linfócitos, cada um ativado por um epítopo diferente 
 
• Anticorpo Monoclonal: 
- A partir da inoculação de um antígeno com todos os seus 
epítopos em um animal, seguido pela coleta das células 
do baço (local onde é produzido a maior quantidade de 
anticorpos) 
- Se faz isso pois o antígeno, dependendo da via que ele é 
introduzido, ele vai chegar imediatamente no baço, e 
com o auxílio dos antígenos que são introduzidos pelas 
vias parenterais, vão cair no linfonodo, permitindo uma 
eficiência maior da resposta imune 
- Após a coleta das células do baço, a partir delas eram 
produzidos mielomas 
- A partir do principio que essas células do baço são 
compostas por vários clones de células, cada uma delas 
produzindo resposta contra determinado epítopo, essa é 
uma metodologia onde é preciso fazer diluições ao 
infinito, para partir do principio que se tem uma célula 
em cada tubo de ensaio 
- Nunca se conseguiu deixar apenas uma célula em cada 
tubo, mas se conseguiu pelo menos 2 a 3 células por tubo 
- E cada uma das diluições eram testadas em uma placa 
com meio de cultura especial, que permite a amplificação 
da resposta e as células obtidas em cada placa eram 
desafiadas com o epítopo mais importante do antígeno 
- A célula que respondesse melhor era selecionada e então 
introduzida para formar os chamados hibridomas que 
será mantido em nitrogênio liquido ou em liquido ascítico 
em camundongos, que vai dar origem aos anticorpos 
monoclonais 
 
 
 
 
 
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Anticorpos Monoclonais 
 
→ Características: 
• Homogeneidade 
• Especificidade 
• Reprodutibilidade 
 
→ Aplicações: 
• Identificar marcadores fenotípicos e análise funcional de 
moléculas de superfície celular 
- Como por exemplo, identificar o fenótipo de um LT 
• Imunodiagnóstico de doenças infecciosas 
- Principalmente quando se trabalha com amostra clínica, 
se o anticorpo monoclonal for voltado apenas para o 
antígeno daquele patógeno, mesmo em uma amostra 
clinica onde se tem uma mistura de componentes, o 
anticorpo se liga diretamente naquele patógeno por ser 
específico para ele 
• Diagnóstico e imunoterapia de tumores: 
 
 
Sorologia 
 
→ Características: 
• Pode ser qualitativa ou quantitativa 
• Qualitativa: 
- Consiste no uso do antígeno e anticorpo, e na observação 
para avaliar se a reação acontece 
• Quantitativa: 
- É a dosagem semi-quantitativa do antígeno ou anticorpo 
usando um Ac ou Ag conhecido, respectivamente 
- Depende de uma titulação – técnica utilizada para 
determinar a quantidade de matéria em uma amostra 
utilizando uma solução com concentração conhecida 
fazendo diluições seriadas de maneira a achar o título 
• Título: 
- Maior diluição do componente pesquisado (antígeno ou 
anticorpo) onde ainda há manifestação visível da reação 
• Titulação do antígeno: 
- Determina a concentração mínima de antígeno a ser 
usada numa reação sorológica, de forma que não se 
tenha um falso-negativo por excesso de antígeno 
• Titulação de anticorpo: 
- Determina uma semi-quantidade de anticorpo presente 
em um soro → muito usado em sorodiagnóstico 
- Observa-se de forma indireta até onde há anticorpo 
reagindo com o antígeno 
- Quanto maior o título, maior será a quantidade de Ac no 
soro inicial (soro bruto do paciente) 
• Deve-se levar em consideração a época da coleta do soro 
- Levando em consideração a resposta primária em relação 
à resposta secundária, o pico é sempre mais baixo 
- O anticorpo predominante na resposta primária é sempre 
IgM, oriundo do foco extrafolicular, e a IgG aparece no 
final da resposta primária 
- Logo, no diagnóstico de uma infecção aguda, não é muito 
efetivo pesquisar IgG, visto que ela está em pouquíssima 
quantidade na resposta primária, porém, é bem efetivo 
investigar a IgM visto que ela está sendo produzida 
desde o início dessa resposta 
- Pode ser que no final da fase aguda os níveis de IgM e 
IgG comecem a se igualar 
- Caso o soro seja coletado no inicio do seu processo de 
recuperação, ou seja, no início da resposta secundária, 
só será possível detectar IgG pois dificilmente vai se 
encontrar IgM, a não ser em técnicas especiais para a 
pesquisa de IgM 
 
 
→ Pesquisa de classe de anticorpo: 
• É muito importante se pesquisar a classe do anticorpo 
quando vai se dar um diagnóstico 
• Detecção de IgM: 
- Indica uma infecção primária (aguda) 
- Como a IgG aparece muito no final da fase aguda, a 
maioria das técnicas nãoconseguem detectá-la, a não 
ser usando recursos especiais 
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- Muito importante no diagnóstico de infecção em recém-
nascido (0 e 6 meses) → quando se pede a dosagem de 
anticorpos, será feita a medição dos anticorpos totais, e 
é a IgG que predomina em uma infecção, mas, lembrando 
que se for uma infecção aguda e esse bebê tendo IgG da 
mãe, é importante que se faça um exame que não 
detecte anticorpos que atravessam a placenta ou que 
não são transmitidos por secreções ou leite materno, 
então o primeiro passo para o diagnóstico de infecção 
em recém-nascido é a dosagem de IgM, que não será 
herdada da mãe pois não atravessa e placenta e não é 
transmitida pelo leite materno 
• Detecção de IgM e IgG: 
- Indica o final da fase aguda 
- Detecta a infecção em curso, ou seja, a fase da doença 
• Detecção de IgG: 
- Quando se detecta altos níveis de IgG, pode ser que o 
indivíduo esteja na fase de convalescência 
- Quando se detecta níveis não muito altos de IgG, pode 
ser por conta da vacinação, dependendo da fase em que 
ele foi vacinado 
- Quando o título é muito baixo, pode indicar uma cicatriz 
sorológica (o indivíduo teve a doença, se curou, e possui 
um nível basal de anticorpo) 
- Em alguns casos é importante se estabelecer a fase da 
doença apenas com a detecção da IgG, através do teste 
de avidez para IgG 
 
→ Teste de Avidez de IgG – ELISA modificado: 
• Quanto mais avançada está a doença, mais ela está 
convalescendo, logo, maior será a avidez da IgG 
• Isso ocorre devido a maturação de afinidade, seleção, e 
outros processos que fazem com que a avidez da IgG fique 
maior 
• É muito importante essa detecção principalmente quando 
se quer diagnosticar determinadas doenças em grávidas 
• A detecção da avidez da IgG garante que a mulher não 
esteja transmitindo a doença para o feto, ou garante que 
o feto não esteja sendo afetado pelo fato da mãe ter tido 
determinada doença ou estar na fase final dessa doença, 
o que não é garantido se a doença estiver no começo 
• No inicio da doença a avidez da IgG ainda é muito baixa, 
e no final quando ela já está convalescendo, a avidez será 
alta 
• Fundamento do teste – Feito a partir de uma técnica 
imunoenzimática colorimétrica (o extrato da enzima possui 
uma cor), onde se usa um agente (uréia 6M) que dissocia 
o complexo antígeno-anticorpo, e nessa concentração ela 
possui uma maior ou menor possibilidade de dissociar a 
reação Ag-Ac dependendo da avidez da IgG 
• Usa-se uma placa, onde é colocado o antígeno, e depois é 
introduzido o soro da gestante na placa, fazendo diluições 
seriadas, ou apenas em duplicata ou triplicada para ver a 
dosagem melhor 
• Já as outras placas, com o antígeno e o soro da gestante, 
são colocadas para reagir, e após o tempo de reação, 
algumas placas serão lavadas com a ureia 6M e as outras 
não serão lavadas 
• Dependendo da avidez da IgG pelo antígeno, a uréia vai 
desligar essa IgG da placa, que será lavada e a outra 
placa não será lavada deixando a reação ocorrer normal 
• Depois, será colocado o conjugado (anti-IgG + enzima) 
nessas placas 
• Se a IgG estiver ligada, o substrato terá uma cor, que será 
quantificada no aparelho pela densidade ótica da cor 
• Se a IgG não ficar ligada, a cor será pouco intensa 
• Tem-se a quantidade total do anticorpo ligado à placa, e 
a quantidade que continuou ligada após a lavagem 
• Com isso, é feita a equação que determina a percentagem 
de ligação: 
 
𝑑𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑎𝑝ó𝑠 𝑎 𝑢𝑟𝑒𝑖𝑎
𝑑𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑠𝑒𝑚 𝑎 𝑢𝑟𝑒𝑖𝑎
 𝑥 100 
 
 
• O resultado dessa equação, ou seja, a interpretação do 
teste de avidez, será traduzido pelo índice da leitura da 
cor por um aparelho: 
- Índice > 0,200 – IgG possui baixa avidez pelo antígeno, 
indicando infecção recente “aguda” (menos de 4 meses) 
- Índice entre 0,200 e 0,300 – IgG possui uma avidez 
intermediária, indicando que não é possível determinar 
o tempo de infecção 
- Índice ≥ 0,300 – IgG possui alta avidez, indicando uma 
infecção pregressa ou crônica (mais de 4 meses) 
• Exemplos de teste de avidez com toxoplasmose: 
- Toxoplasmose pregressa ou crônica – anticorpos IgG de 
alta avidez 
- Toxoplasmose recente aguda – anticorpos IgG em geral 
de título alto e baixa avidez e IgM de título alto 
- Toxoplasmose recente não-aguda – anticorpos IgG em 
geral de título alto e de alta avidez, IgM de título baixo 
• Esse teste é muito usado para avaliação de infecção em 
mulheres grávidas 
• Caso a grávida esteja com índice maior ou igual a 0,300 é 
um bom sinal, pois significa que a IgG de alta avidez já 
controlou a infecção ou está mantendo a infecção sob 
controle e dificilmente vai comprometer o feto 
• Caso a grávida esteja na fase intermediária é importante 
fazer o acompanhamento próximo do feto através do teste 
de avidez e outros exames 
• Caso a grávida esteja com índice menor que 0,200, seria 
um caso mais grave com mais chances do feto ser afetado 
 
→ Sorologia Pareada: 
• É a analise de 2 soros colhidos em etapas diferentes de um 
mesmo paciente 
• A primeira coleta deve ser feita na fase aguda, ou seja, 
quando esse paciente está no auge da sintomatologia 
• A segunda coleta deve ser feita de 2 a 4 semanas após a 
primeira coleta 
• Deve-se observar então a conversão sorológica 
- Confirmar a infecção por um determinado patógeno 
 
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- Consiste no aumento de no mínimo 4x do título de 
anticorpos do soro da fase convalescente (2ª coleta) em 
relação ao soro da fase aguda (1ª coleta) 
• Muito importante para a epidemiologia, pois é possível 
confirmar o patógeno que está circulando na população 
• Muito importante para a infecção viral, pois é possível 
fazer o tratamento dos sintomas na fase aguda 
 
→ Sorologia: 
• A escolha do teste sorológico a ser utilizado no diagnóstico 
das infecções agudas devem levar em consideração a 
sensibilidade e a janela imunológica, que consiste na 
duração do período necessário para o aparecimento de 
títulos de anticorpos detectáveis 
• A montagem da resposta imune requer um tempo que 
envolve o reconhecimento do patógeno, proliferação e a 
diferenciação da célula que está produzindo a resposta 
imune e a possibilidade de detectar a presença de 
anticorpos (janela imunológica) 
• Resultados positivos necessitam de testes confirmatórios 
sempre por uma metodologia diferente 
• Resultados sevem ser interpretados dentro de um contexto 
clínico e epidemiológico 
 
Métodos Sorológicos Visíveis 
 
→ Aglutinação Direta: 
• O antígeno faz parte da estrutura da célula (seja ela célula 
do hospedeiro, da bactéria, ou outros) 
• O antígeno presente na superfície da célula ou partícula 
quando combinado ao anticorpo solúvel, que deve estar 
na zona de equivalência para que consiga juntar uma 
partícula na outra formando um agregado ou grumo 
• Essa técnica pode ser feita em lâmina, microplaca, tubo 
• Pode ser qualitativa ou quantitativa: 
 
» Qualitativa: 
♥ Usada para a tipagem sanguínea – determinação de 
grupo sanguíneo ABO e/ou Rh, para isso se pinga duas 
gotas do sangue do paciente em cada lâmina, e em 
uma gota se pinga o soro anti-A (determina o grupo 
sanguíneo A), e na outra o soro anti-B (determina o 
grupo sanguíneo B), e o sangue que aglutinar é por ser 
referente àquele determinado grupo sanguíneo 
 
 A B AB 0 
 
♥ Usada para diagnóstico de infecções bacterianas – a 
maioria das infecções bacterianas são baseadas no 
isolamento da bactéria na amostra do paciente, no 
entanto, muitas delas possuem tipos sorológicos, então 
nesse caso a microbiologia faz o diagnóstico, isola a 
bactéria que esta causando a doença na amostra 
clínica, obtém uma cultura pura daquela bactéria, e a 
imunologia testa a bactéria com os soros padronizados 
para os diferentes tipossorológicos, e o que tiver a 
reação positiva será referente àquele determinado 
tipo sorológico de bactéria 
♥ Usado para pesquisa de anticorpos para infecções – 
como a salmonelose, leptospirose, toxoplasmose, e em 
geral deve-se usar anticorpos padronizados (como a 
salmonela, leptospira, toxoplasma) 
 
» Quantitativa: 
♥ Envolve a titulação – primeiro é realizada a diluição do 
soro do paciente em solução tampão (PBS), e depois se 
acrescenta um volume de antígeno determinado no 
tubo, o qual se sabe a concentração de antígeno que 
foi determinado anteriormente ou pelo kit de antígeno 
fornecido, após isso deve-se armazenar em 4°C por 72 
horas e outros primeiro na temperatura ambiente e 
depois em 4°C, e após isso será realizada a leitura a 
cada 24 horas, e se considera o título a reação anterior 
à reação que deu negativo 
♥ Um exemplo clássico é a Reação de Widal usada para o 
diagnóstico de febre tifóide, causada pela bactéria 
Salmonella typhi quando ela está disseminada no soro 
do sangue do paciente, logo, é muito mais difícil 
realizar uma hemocultura para achar a bactéria, então 
pode-se utilizar o recurso de pesquisar anticorpo 
contra essa bactéria no soro do paciente 
 
 
 
♥ Quantitativa em placa – pode ser feita em placas, após 
a diluição do soro são colocadas as amostras na placa, 
sendo uma fileira para cada indivíduo, no chamado 
teste de hemaglutinação → quando a hemácia deixa 
de aglutinar, ela escorre pela parede da placa e forma 
um botão no fundo indicando o teste negativo, já 
quando a bactéria forma uma rede, que seria o grumo, 
e fica espalhada na placa, indica o teste positivo 
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• Considerações Práticas: 
- Facilidade de execução 
- Baixo custo 
- Elevada sensibilidade 
- Leitura visual 
- Permite realizar um semi-quantitativo – para ter noção 
da quantidade de anticorpos 
• Exemplos: 
- Tipagem de grupos sanguíneos 
- Sorotipagem de bactéria – foco no auxílio do diagnostico 
microbiológico 
- Reação de Widal – auxilia diagnóstico de febre tifoide 
- Reação de Paul-Bunnell-Davidsohn – auxilia diagnóstico 
da mononucleose infecciosa 
 
→ Aglutinação Indireta: 
• Quando o antígeno é solúvel a visualização é mais difícil, 
devido o antígeno e o anticorpos serem moléculas 
• Com isso, surgiu então a ideia de transformar a molécula 
imunogênica em uma partícula, sendo esse o fundamento 
da aglutinação indireta 
• Usada para pesquisa de anticorpo e antígeno: 
» Pesquisa de Anticorpo: 
♥ O antígeno solúvel é adsorvido na superfície de uma 
partícula (hemácia, látex, polietileno, etc) 
♥ É indireta – pois o antígeno está na superfície dessa 
partícula, porém ele não faz parte da partícula 
♥ O soro do paciente possui anticorpos específicos para 
o antígeno, e como esse antígeno está na superfície da 
partícula, ele vai amontoar em volta da partícula 
fazendo a reação positiva 
♥ Caso o soro do paciente não tenha anticorpo, a reação 
será negativa 
 
 
♥ Usada no sorodiagnóstico da sífilis através da pesquisa 
de anticorpos específicos contra o Treponema pallidum 
- Teste confirmatório importante por ser treponêmico, 
feito a partir de reação de hemaglutinação indireta 
♥ Sorodiagnóstico da Sífilis: 
- No início da patogenia da sífilis, o T. pallidum provoca 
alterações no tecido do paciente, expressando Ags 
lipídicos, promovendo a uma grande quantidade de 
anticorpos reagínicos 
- Esses anticorpos reagínicos são gerados devido a 
liberação de antígenos heterofilos, que geram Acs 
reagínicos heterofilos (ou seja, não são gerados pela 
estrutura do Treponema em si) 
- O anticorpo não é voltado contra o Treponema, eles 
são voltados na verdade para aquela estrutura 
patogênica de antígenos heterofilos, que fazem parte 
dos fosfolipídios das células humanas, que são muito 
proeminentes principalmente no caso da sífilis 
- Isso é usado como uma característica da fase aguda 
da sífilis, permitindo a suspeita de ser sífilis, antes 
mesmo que ocorra a produção de anticorpos no final 
da fase primaria da sífilis 
- O antígeno heterofilo é o lipídio (cardiolipina), então 
a primeira reação para sífilis será uma reação 
chamada VDRL (reação de laboratório contra 
doenças venéreas) onde se pega a cardiolipina e 
adsorve ela em um cristal de colesterol sensibilizado 
ele, cristais esses que só são visíveis com o uso de uma 
lupa ou usando um microscópio com aumento de 100x 
sendo esse resultado negativo, já o resultado positivo 
ocorre quando os cristais aglomeram devido a reação 
com o anticorpo 
 
 Resultado Negativo Resultado Positivo 
- Porém, isso é apenas um indicativo de sífilis, sendo um 
diagnóstico de triagem, e não necessariamente o 
diagnóstico positivo, após isso é necessário realizar 
um teste treponêmico 
- A principio é muito utilizado o TPHA, que é uma reação 
de hemaglutinação 
- Um avanço que se teve no diagnóstico de triagem, foi 
a utilização do VDRL látex, que se usa partículas de 
látex ao invés de usar cristais de colesterol, na qual 
se vê imediatamente partículas brancas aglomeradas 
 
 Resumo da Malu – 2020.2 
 
- Os testes VDRL com cristais de colesterol ou látex são 
testes de triagem não-treponêmicos, que pesquisam 
anticorpos reagínicos heterófilos, sendo necessário 
sempre realizar um teste treponêmico após eles para 
efetivamente confirmar o diagnóstico 
- Existes testes treponêmicos por imunocromatografia 
 
♥ Inibição da Hemaglutinação: 
- É um teste muito utilizado para vírus hemaglutinantes 
(vírus da influenza, sarampo, outros) 
- A inibição da aglutinação ocorre devido a presença 
de anticorpo no soro do paciente 
- Os vírus hemaglutinantes tem na sua estrutura, uma 
estrutura chamada hemaglutinina (HA) 
- Quando se tem uma infecção por um desses vírus, os 
primeiros Acs formados são contra a hemaglutinina 
por ela estar mais exposta 
- Então, eles aglutinam em torno dele as hemácias 
- Um indivíduo que está tendo uma doença por esse 
vírus, forma anticorpos contra a hemaglutinina, que 
vão se ligar a ela neutralizando-a, e mesmo que a 
hemácia chegue perto desse complexo anticorpo-
vírus hemaglutinante, ela não vai aglutinar, devido a 
hemaglutinina estar obstruída pelo anticorpo que 
está neutralizando-a → esse pensamento foi usado 
como base para o diagnóstico desses vírus 
 
 
- Logo, tendo a amostra de um indivíduo (soro teste) e 
o vírus hemaglutinante, serão feitas várias diluições 
seriadas do soro do paciente, que será colocado em 
cada poço da placa, e depois adicionado o vírus 
padrão hemaglutinante, que será incubado para 
esperar a reação 
- Se tiver presença de anticorpo, ele reagirá com vírus, 
se não tiver presença de anticorpo, não vai reagir 
- Depois disso, serão adicionadas as hemácias 
- Se observarmos a formação de uma rede, quer dizer 
que as hemácias aglutinaram, ou seja, o soro não 
tinha anticorpo devido a hemaglutinina do vírus 
estar livre, indicando que o indivíduo é negativo 
 
- Se observamos a formação de um botão, quer dizer 
que as hemácias não aglutinaram, ou seja, o soro 
possui anticorpo e por isso a hemaglutinina do vírus 
foi neutralizada, indicando que o indivíduo é positivo 
 
- Vírus influenza (3 tipos) – aglutina hemácias do grupo 
O de galinha, cobaio, carneio e humanas 
- Vírus do sarampo – aglutina hemácias de macaco 
- Vírus da Dengue – aglutina hemácias de ganso 
 
» Pesquisa de Antígeno: 
♥ Muito pouco usado atualmente 
♥ É um teste rápido, que foi muito usado antigamente 
♥ Se usa o anticorpo específico (solúvel) contra um Ag e 
adsorve ele a uma partícula (pode ser látex, hemácia, 
S. aureus) 
♥ Usado para pesquisa de proteína C-reativa (látex) – é 
uma proteína de fase aguda que representa que 
aquele paciente está tendo algum processo infeccioso 
(reação inata infecciosa) 
♥Usado para pesquisa de fator reumatóide (hemácia ou 
látex) – é uma IgM alterada 
♥ Usado para pesquisa de Ags polissacarídeos (S. aureus) 
 
→ Precipitação: 
• É uma reação difícil de se observar a olho nu 
• Usada em pesquisa para Ags polissacarídicos (solúveis) 
que se difundem muito bem em meios gelificados 
• Pode ser usada para fungos 
 Resumo da Malu – 2020.2 
• A única metodologia que ainda se usa é em micologia, para 
se fazer um teste “rápido”, chamado imunodifusão radial 
dupla (Ouchterlony) 
• Para se evitar que o antígeno e anticorpo ficasse boiando 
no meio liquido dentro do tubo de ensaio, foi introduzido o 
meio gelificado 
• Em uma lâmina ou placa, coloca-se um meio de cultura 
(tampão) com um gel purificado (gel de agarose), que 
forma uma camada gelatinosa que endurece depois 
• São feitos orifícios nessa superfície, onde o antígeno e o 
soro do paciente (com anticorpos ou não) são colocados 
em poços equidistantes 
• Como o é muito usado para antígeno polissacarídeo e esse 
é um meio molhado, os antígenos vão migrar em todas as 
direções do orifício, e quando precipita eles formam uma 
linha de precipitação, ou seja, o anticorpo reagiu com o 
antígeno, havendo uma reação positiva para esse paciente 
 
• É difícil de observar a linha de precipitação a olho nu, mas 
não impossível 
• Lembrando que o anticorpo é uma glicoproteína, pode-se 
usar um corante para se conseguir enxergar melhor a linha 
de precipitação 
• Quanto maior o número de linhas de precipitação, maior 
são as frações antigênicas para as quais aquele individuo 
tem anticorpo 
 
 P. brasiliensis 
 
→ Métodos Automatizados: 
• Detecta antígenos em meio liquido de forma mais eficiente 
e com maior sensibilidade 
• Se baseiam no método de realizar uma reação antígeno X 
anticorpo específico para esse antígeno, em um tubo 
• Usa-se o soro do paciente, contendo ou não anticorpos, e 
nele coloca-se um antígeno solúvel ou utiliza-se o antígeno 
do paciente com um soro padrão, em um tubo de ensaio 
• Ao ocorrer a reação forma-se esses complexos antígeno-
anticorpo que ficam em suspensão, e ao submeter esse 
tubo de ensaio a uma fonte luminosa, quando o raio incidir 
no complexo ele sofrerá uma refração (desvio de luz) 
• Fonte luminosa muito usada é o laser 
• Usado para detecção de substancia solúveis e proteínas 
de significado clínico em qualquer fluido corporal 
- Fator reumatóide, IgA, IgG, IgM, C3, C4, albumina, 
transferrina, proteína C, fibronectina, etc 
• Tipos de métodos automatizados: 
» Nefelometria: 
▪ Precipitação entre antígeno e anticorpo em soluções 
diluídas, quando submetidas a uma fonte luminosa 
produzem um aumento da reflexão da luz, medida pela 
dispersão da luz incidente 
▪ O nefelômetro é um aparelho que mede a reação a 
partir da luz dispersada (desviada) comparando com a 
luz incidente no turbo controle negativo 
▪ Deve-se observar vários parâmetros: 
- Se deve trabalhar com soro monoclonal 
- Não pode trabalhar com soro lipêmico (soro turvo ou 
leitoso), deve-se tratar o soro 
- Alta restrição em relação a coleta 
▪ Vantagens: 
- Totalmente automatizado 
- Fácil realização 
- Rápido e preciso 
▪ Desvantagens: 
- Custo elevado dos equipamentos e dos soros imunes 
 
» Turbidimetria: 
▪ Precipitação entre antígeno e anticorpo em soluções 
diluídas, quando submetidas a uma fonte luminosa 
conseguem bloquear a transmissão da luz incidente 
▪ Mede a reação pela luz transmitida (conseguiu passar 
pelo tubo de ensaio) 
▪ Onde não tem complexo Ag-Ac a luz consegue passar 
▪ Controle negativo 
▪ Vantagens: 
- Não necessita de equipamentos especiais 
- Reações podem ser medidas em espectrofotômetro, 
visto que se está medindo a transmitância (consiste 
na capacidade de transmitir a luz, ou seja, a fração 
de energia luminosa que consegue atravessar a 
espessura de um determinado material) – mede-se a 
luz transmitida em relação à luz incidente (controle) 
 
 
 
Métodos de Sistemas Reveladores da 
Reação Antígeno X Anticorpo 
 
• Vieram para acelerar/facilitar a leitura das reações 
• Aumentou em muitas vezes a especificidade e a sensibilidade 
das reações 
 
 Resumo da Malu – 2020.2 
→ Imunofluorescência: 
• Não muito usado nos dias atuais 
• Marcador: fluorocromo – substancia que acoplada à um 
reagente conhecido, quando submetido a uma luz de baixo 
comprimento de onda, os átomos do fluorocromo vão para 
órbitas externas e quando retornam à sua órbita normal, 
eles emitem uma luz fluorescente de baixo comprimento de 
onda 
• Revelação: através da detecção da fluorescência (luz) 
 
→ Radioimunoensaio (RIE) e Imunorradiométrico (IRMA): 
• Não muito usado nos dias atuais 
• Marcador: radioisótopo 
• Revelação: medição da radiação – mede-se a quantidade 
da radioatividade em um cintilógrafo (aparelho) 
• Método mais caro, por seus reagentes serem mais caros e 
terem uma meia-vida relativamente curta 
• Exige-se preparo e qualificação do profissional que vai 
realizar o teste 
 
→ Enzimático: 
• Método amplamente usado 
• Se baseia no uso de uma enzima acoplada ao reagente 
conhecido 
• Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (EIA ou ELISA): 
- Marcador: reagente conhecido é acoplado à uma enzima 
cujo substrato é cromogênico – quando a enzima 
consome esse substrato, essa reação emite uma cor 
- Revelação: quantifica a reação a partir da emissão da 
cor, comparando a quantidade de cor produzida em uma 
reação, com o controle negativo, onde a cor é baixíssima 
devido à ausência de reação 
• Quimioluminescência (ICMA): 
- Substrato quimioluminescente – revela por brilho 
- Marcador: reagente conhecido é acoplado à uma enzima 
que produz uma reação quimioluminescente – reação 
que quando consome o substrato, emite um brilho 
- Revelação: brilho emitido pela reação química da enzima 
consumindo o substrato pode ser quantificado por um 
aparelho 
• Imunofluorimétrico (IFMA): 
- Marcador: reagente conhecido é acoplado à uma enzima 
cujo substrato é fluorigênico – quando a enzima consome 
esse substrato, essa reação emite uma fluorescência 
- É diferente do fluorocromo da imunofluorescência, que é 
excitado por uma fonte luminosa, pois o fluorocromo não 
é um substrato 
- Revelação: a fluorescência emitida pela reação química 
da enzima consumindo o substrato pode ser quantificada 
- Não é preciso um aparelho especial 
 
 
 
Imunofluorescência 
 
→ Pesquisa de Antígeno: 
• Pesquisa-se o antígeno em uma amostra clínica – na célula 
ou em um corte de tecido 
• Direta: 
- Coloca-se uma amostra clínica (célula ou corte do tecido) 
que pode conter ou não o antígeno, em uma lâmina 
- Após isso usa-se um anticorpo (geralmente monoclonal) 
marcado com fluorocromo, que será inserido na amostra 
- A lâmina com a amostra e o anticorpo será lavada com 
solução tampão, e se o Ag estiver presente nessa amostra 
ele se ligará ao Ac, e o local ficará fluorescente 
- Aplicação – muito usada para detectar microorganismos 
presente em secreções (urina, fezes, biópsia) 
 
• Indireta: 
- Em amostra clínica contendo antígeno e outras várias 
substâncias, com o objetivo de se detectar determinado 
antígeno, adiciona-se nessa amostra um soro com Acs 
específicos aquele antígeno de interesse, e após isso se 
lava a amostra com uma solução tampão 
- Após isso, usa-se então um anticorpo conjugado, ou seja, 
um anti-anticorpo marcado com fluorocromo 
- O anticorpo conjugado servirá para detectar o antígeno 
- Pelo conjugado ser um anti-anticorpo, pode-se usar esse 
conjugado para detectar qualquer antígeno que se 
deseja pesquisar naquele corte de tecido, pois o que vai 
especificar a reação é o anticorpo específico 
- Pode-se usar um soro específico para cada antígeno em 
diferentes lâminas para se identificar diferentes Ags, e 
depois usar o mesmo anticorpo conjugado para marcar 
o antígeno de interessenessas diferentes lâminas 
- Dessa forma, não se precisa corar todos os anticorpos 
específicos, podendo corar apenas o Ac conjugado que 
reconhece todos os outros anticorpos específicos 
- Aplicação – em bacteriologia, é um dos poucos métodos 
de imunofluorescência direta (IFD) ainda usados em 
laboratório clínico para identificação de Streptococcus 
do grupo A e para a identificação de coproantígenos em 
fezes 
 
 Imunofluorescência Direta Imunofluorescência Indireta 
• As etapas de lavagem com a solução tampão são muito 
importantes para tirar todas as substancias que não são 
do interesse da pesquisa 
 Resumo da Malu – 2020.2 
 
 Legionella pneumophila Cryptosporidium sp 
 
Dupla coloração com Cryptosporidium (verde) e Giardia (vermelho) 
 
→ Pesquisa de Anticorpo: 
• Indireta: 
- Técnica mais usada 
- Possui a vantagem de sempre usar um anti-anticorpo 
para detectar o anticorpo no soro do paciente 
- Isso barateou o custo da reação, por não precisar de um 
anticorpo específico para cada pesquisa de anticorpo, 
pois o conjugado serve para o diagnóstico de qualquer 
anticorpo, servindo para inúmeras reações diferentes 
- Um microorganismo ou uma cultura de células infectadas 
com determinado antígeno é colocado em uma lâmina, 
fixando esse antígeno nela 
- O soro a ser testado é colocado na lâmina de interesse, 
no caso, a lâmina com o Ag que se quer diagnosticar 
- Tem um tempo de espera para a reação acontecer, e após 
essa espera faz-se a lavagem com tampão (PBS) para 
retirar tudo o que não ligou com especificidade ao Ag 
- Após isso, adiciona-se o anticorpo conjugado ligado ao 
fluorocromo 
- Se o indivíduo tem anticorpo contra o patógeno presente 
na lâmina, mesmo após a lavagem o anticorpo vai 
continuar ligado ao antígeno 
- Após a adição do Ac conjugado ligado ao fluorocromo, 
ele vai se ligar ao Ac ligado ao Ag, marcando-o com a 
sua fluorescência 
- O mesmo conjugado pode ser usado para lâminas com 
diferentes antígenos, pois o que vale para o diagnostico 
é se o soro do paciente tinha ou não anticorpo para o 
antígeno presente na lâmina 
- Vantagens: 
♥ Sensibilidade 
♥ Especificidade 
♥ Reprodutibilidade 
♥ Padronização e execução simples 
♥ Permite detectar classes e subclasses de anticorpos 
utilizando anticorpos conjugados específicos 
♥ O mesmo conjugado pode ser usado para diferentes 
sistemas 
 
- Desvantagens: 
♥ Necessidade de microscópio de fluorescência 
♥ Subjetividade na leitura 
♥ Não-automação 
- Aplicações: 
♥ Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas 
humanas – doença de Chagas, SIDA/AIDS, hepatites e 
complexo antígeno X anticorpo em doenças autoimunes 
e toxoplasmose 
♥ Medicina veterinária – neosporose, campilobacteriose 
genital bovina, toxoplasmose e raiva 
 
 
 
Obs: FTA-ABS – é um teste para a pesquisa de anticorpo anti-
Treponema pallidum → anticorpo treponêmico muito 
usado para testes confirmatórios não treponêmicos (VDRL, 
látex, imunocromatográfico) 
 Foi substituído pelo TPHA (hemaglutinação) por ser mais 
fácil de realizar o teste 
 É qualitativo, não precisa calcular título 
 ABS – tratamento feito antes de colocar o soro na lâmina 
onde está o treponema (saprófita). O soro do paciente é 
tratado com uma mistura de treponemas que não são 
pallidum, logo, se tiver algum anticorpo contra saprófita, 
ele fica bloqueado, e quando se joga o soro do paciente 
na lâmina, é detectado apenas anticorpos específicos 
para o treponema. Ou seja, se aparecer fluorescente, 
significa que aquele anticorpo foi o que sobrou para o 
treponema, e os que não eram para treponema saíram 
no ABS (adsorvente) 
 
 
FTA-ABS: Teste para pesquisa 
de anticorpo anti-Treponema 
pallidum – confirmatório de 
teste não treponêmico (VDRL, 
látex, imunocromatográfico) 
 
IFI para T. cruzi – 
confirmatório da reação 
Machado Guerreiro 
(fixação de complemento) 
Teste de 
imunofluorescência 
indireta confirmatório 
para HIV 
 
 Resumo da Malu – 2020.2 
Citometria de Fluxo 
 
→ Características: 
• Técnica utilizada para pesquisa de antígenos em amostras 
clinicas (células ou tecidos) 
• Não é valido para extratos celulares, pois as células 
precisam ser analisadas soltas (individualmente) 
• A base dessa técnica é a possibilidade de se investigar o 
antígeno em cada célula individualmente, diferente do que 
ocorre na imunofluorescência convencional (onde tem-se 
uma amostra clínica fixada em uma lâmina) 
• Permite a análise multiparamétrica das partículas uma a 
uma em suspensão 
• A partícula é introduzida em um aparelho que possui uma 
espécie de capilar, e essa partícula passa uma a uma em 
frente a um feixe de luz, que analisa essas partículas de 
forma individual baseado em certos parâmetros, como: 
 - Tamanho da célula (FSC – forward scatter) 
- Complexidade (SSC – side scatter) 
- Fluorescência relativa (FACS – fluorescence-activated 
cell sorting) 
• Logo, as células devem ser preparadas em um meio liquido 
que permita que essas células passem uma a uma, nesse 
mecanismo de introdução 
• As células podem ser separadas em populações distintas 
baseada na combinação desses parâmetros 
 
• O feixe de luz analisa essa célula de acordo com o seu 
tamanho e complexidade, e quando elas estão marcadas 
por um fluorocromo, ainda é possível em um sistema de 
filtros capturar a luz de diferentes fluorocromos emitidos 
(fluorescência relativa), para se ter uma ideia de cada tipo 
de célula que se está passando nesse conjunto 
 
→ Complexidade e Tamanho: 
• Complexidade Interna (SSC – side scatter): 
- Detecta a dispersão lateral do laser 
- A luz que atravessa a célula, é dispersada lateralmente 
de acordo com a quantidade de partículas que ela bate 
quando atravessa a célula, permitindo ter uma ideia da 
complexidade dessa célula 
 
• Tamanho (FSC – forward scatter): 
- Detecção da dispersão frontal do laser 
- As luzes que passam por fora da célula dão uma noção 
do tamanho dessa célula, por passar beirando a lateral 
da partícula 
 
• Observando o gráfico abaixo, que é emitido pela parte 
computacional do aparelho 
• Side scatter (SCC) – permite separar as células de acordo 
com a complexidade interna, de forma que quando mais 
avançam no gráfico, mais complexos essas células são 
- Os granulócitos são os mais complexos por serem células 
ricas em grânulos no seu interior 
• Forward scatter (FSC) – permite separar as células de 
acordo com o tamanho, de como que quanto mais elas 
avançam no gráfico, maior será o tamanho dessas células 
 
• Como essas células são separadas a medida que passam 
pelo feixe de luz, isso permite que possam ser coletadas em 
frascos ou tubos diferentes, para posteriormente serem 
analisadas 
 
→ Fluorescência Relativa: 
• Após a coleta de determinado frasco, com o objetivo de se 
analisar separadamente subtipos de determinada célula, 
pode-se marcar esses diferentes subtipos com diferentes 
fluorocromos, para avaliar então a fluorescência relativa 
 
 Resumo da Malu – 2020.2 
 
• Essa análise é feita de acordo com a coleta da luz emitida 
por cada fluorocromo 
• Diferentes lasers marcados com diferentes fluorocromos, 
que são capturados por prisma (filtros diferentes) 
• Logo o laser marcado com azul, quantifica todas as células 
marcadas em azul, e assim segue para todas as cores 
 
 
• A análise pode ser representada por gráficos na forma de: 
- Histograma – mede a intensidade da fluorescência pelo 
numero de células, permitindo a quantificação de cada 
célula marcada. Nesse caso, a marcação é feita de um 
tipo celular determinado, as células que não sofreram 
marcação permanecem na origem, e os 44,46% que 
migraram são as células marcadas de interesse 
 
- Dot Plot – mede a intensidade de uma determinada cor 
de luz fluorescente 
 
- Density Plot – medea densidade de uma determinada 
cor de luz fluorescente 
 
- FSC – é possível coletar o material de um determinado 
tubo, e pode-se marcar essas células e analisar elas de 
forma individual. Na porção Q1 se tem a amostra inicial, 
que não foi marcada para nenhum dos 2 tipos celulares 
pelo corante permanecendo na origem e sendo chamada 
de duplo negativo, na porção Q2 as células foram 
marcadas por PE que marca LTCD8, na porção Q3 as 
células foram marcadas com FITC, que marca LTCD4, e na 
porção Q4 representa as células que foram marcadas 
para os dois tipos celulares, sendo os chamados duplo 
positivos → permite quantificar cada célula marcada 
- Nesse gráfico de histograma, as células foram coletadas 
do mesmo tubo, 
 
→ Aplicações: 
• Permite separar as células por complexidade e tamanho 
• Permite realizar a imunofenotipagem – após analisar as 
células de interesse no gate, com auxílio da marcação por 
diferentes fluorocromos isso permite a identificação de 
diferentes grupos de células 
 Resumo da Malu – 2020.2 
 
• Usado em hematologia – para contagem celular, formula 
leucocitária, análise da medula óssea 
• Usado em farmacologia – estudo de cinética celular, e da 
resistência a drogas 
• Usado em imunologia – reconhecer subpopulações de LT, 
tipagem tissular, estimulação linfocitária, apoptose vs. 
necrose, tipagem para transplantes 
• Usado em oncologia – diagnóstico/prognóstico, monitorar 
tratamento de pacientes 
• Usado em microbiologia – diagnóstico bacteriano e viral, 
sensibilidade a antibióticos, resistência a antibióticos 
• Usado em genética – determinar cariótipo, diagnóstico de 
portador, tipagem para transplante, e para o diagnóstico 
pré-natal 
 
Ensaio Imunoenzimático ELISA 
 
→ Características: 
• Enzyme-linked immunosorbent assay 
• Metodologia que usa um reagente conhecido associado à 
uma enzima 
• No começo da descoberta dos sistemas reveladores a única 
enzima utilizada eram as enzimas que emitiam cor quando 
consumiam o substrato → EIA ou ELISA tradicionais 
• Depois, surgiram enzimas que emitem um brilho quando 
consomem o substrato, no caso da quimioluminescência, ou 
enzimas que emitem uma fluorescência quando consomem 
o substrato, no caso da fluorimetria 
• Avaliação qualitativa e quantitativa 
• Usado para detecção de antígenos – hormônios, citocinas, 
enzimas, antígenos microbianos, drogas ilícitas, BHCG 
• Usado para detecção de anticorpos em fluidos corporais 
ou em sobrenadantes de culturas – anti-HIV 
• Usado para detecção pela quantificação do produto da 
reação da enzima X substrato – pode-se detectar apenas 
qualitativamente, se desenvolveu cor ou não comparando 
ao controle negativo, ou pode detectar quantitativamente 
através da quantificação dessa cor, pois a intensidade da 
dor fornece uma noção da intensidade daquilo que se está 
pesquisando 
- Quanto maior a presença do que se está pesquisando na 
amostra clínica, maior será a marcação coma enzima e 
consequentemente, maior será o consumo do substrato, 
que permite quantificar a presença da substancia de 
interesse naquela amostra 
• É uma metodologia barata e acessível por não precisar de 
um aparelho especial 
 
 
 
→ Etapas Fundamentais das Reações: 
• Determinar o controle positivo e controle negativo: 
- Para se saber se a reação está funcionando, deve-se ter 
esses controles para se ter uma noção se a técnica está 
funcionando 
- Através de cálculos matemáticos entre as médias das 
leituras de densidade dos controles positivo e negativo, 
isso permite determinar o ponto de corte – acima desse 
determinado número de quantificação o resultado é 
positivo, e abaixo dele o resultado é negativo 
- Os controles devem funcionar perfeitamente para se ter 
reações válidas 
• Sensibilização da placa: 
- Se a pesquisa é de um anticorpo no soro do paciente, 
deve-se fixar na superfície da placa um Ag conhecido, 
para depois conseguir testar o soro teste (Ac teste) 
- Se a pesquisa é de um antígeno em uma amostra clínica, 
deve-se fixar na placa um anticorpo contra esse Ag, para 
se conseguir testar esse antígeno posteriormente 
- Em pesquisa, sensibiliza-se a placa com o antígeno ou 
anticorpo que se quer estudar, encubando essa placa de 
um dia para o outro 
- Após fixar o antígeno ou o anticorpo conhecido, deve-se 
incubar essa placa de um dia para o outro, e depois lavar 
essa placa com solução tampão (PBS) para retirar as 
moléculas que não se fixaram no fundo da placa 
• Bloqueio dos sítios inespecíficos de ligação: 
- Quando se tem uma placa sensibilizada pelo antígeno, 
digamos que seja para dosar anticorpo, o antígeno é 
uma molécula que se liga a superfície da placa, porém 
ficam espaços intermoleculares entre essas moléculas 
 
 Resumo da Malu – 2020.2 
- Essas placas são de polietileno ou polivinil, sendo feitas 
para ligarem principalmente proteínas, e sabendo que o 
anticorpo é uma proteína, caso não se tenha preenchido 
os espaços entre as moléculas de antígeno conhecido 
presente na placa, o anticorpo por ser proteína poderia 
se ligar entre esses espaços 
- Então, quando começasse a detectar proteínas através 
da coloração da placa, poderia se detectar o anticorpo 
ligado ao antígeno e o não ligado também 
- Por isso, uma das primeiras etapas é o bloqueio de sítios 
inespecíficos de ligação, que consiste no preenchimento 
desses espaços intermoleculares entre as moléculas de 
antígeno com uma substancia proteica irrelevante (que 
não tenha nada a ver com o que está sendo pesquisado) 
- Se a placa é de kit, ela já vem com o espaço preenchido 
pela substancia bloqueadora 
- Substâncias bloqueadoras muito usadas: 
o Albumina 3% 
o Leite desnatado 5% 
- Logo, no dia seguinte à sensibilização se lava essa placa, 
e se usa então uma solução de uma dessas substâncias 
bloqueadoras, incuba a placa por 1h a 37°C, podendo 
lavar ou não após o bloqueio 
- Existem placas para ligarem antígenos polissacarídicos, 
mas elas não funcional tão bem quanto para ligar na sua 
superfície substancias proteicas 
• Etapas de lavagens para remoção de antígeno e anticorpo 
não complexados: 
- É sempre indicado que se lave a placa para retirar tudo 
o que não é de interesse e não se ligou na placa para a 
reação ficar mais “limpa” 
- Deixa a reação mais reprodutível e fidedigna 
• Escolha do anticorpo conjugado: 
- O anticorpo conjugado é um segundo anticorpo anti-
anticorpo conhecido associado a enzimas 
- Se liga apenas aos anticorpos ligados no antígeno, que 
foram os que restaram após a lavagem pós incubação 
- Após adicionar o conjugado, lava-se novamente essa 
placa para retirar tudo o que não se ligou e coloca-se 
então o substrato da enzima 
- A enzima quando consome o substrato dá uma reação 
colorida, que se pode medir a intensidade dessa cor e 
pode também titular 
- Em uma pesquisa, se foi produzido um soro padrão para 
ver a reatividade do antígeno em um coelho, deve-se 
usar um anti-anticorpo para coelho 
- Se for um diagnóstico, pesquisando anticorpo no soro de 
um paciente humano, o conjugado usado deve ser um 
anti-anticorpo humano 
- Em uma pesquisa, quando se trabalha com 2 conjugados 
ao mesmo tempo, com objetivo de ver se o antígeno 
funciona para humanos, pode-se usar como parâmetro a 
resposta obtida com o soro padrão produzida no coelho 
e o outro para observar se com humanos funciona da 
mesma maneira 
 
- Em uma reação para diagnóstico, pode-se usar um 
conjugado anti-anticorpo total (serve para qualquer 
isotipo de anticorpo presente no soro) ou pode-se usar 
um anti-anticorpo contra IgM, IgG, IgA 
• Essas etapas são essenciais para que a reação funcione 
corretamente e dependendo do que se quer investigar 
 
 
 
→ ELISA direto: 
• Avalia a presença de um 
antígeno em uma amostra 
• Se tem a amostra clínica do 
paciente, que pode conter 
ou não um antígeno, e nela 
se jogao Ac marcado para 
aquele antígeno 
• Nessa amostra, só vai ficar 
marcado o local que estiver presente o antígeno 
 
→ ELISA de captura do antígeno: 
• Avalia a presença de um 
antígeno em uma amostra 
• Nessa amostra há muitas 
moléculas que não são do 
nosso interesse 
• Uma maneira de melhorar 
essa reação é pegar um 
suporte e colocar um Ac 
conhecido sem marcação 
nele, e quando colocar a amostra ali, apenas o antígeno 
de interesse vai se ligar ao anticorpo 
 Resumo da Malu – 2020.2 
• Após isso, é bom lavar esse suporte com solução tampão 
para retirar tudo o que não ligou no anticorpo 
• Depois isso coloca-se um anticorpo marcado, que vai se 
ligar ao antígeno que já estava ligado ao anticorpo preso 
no suporte, que vai permitir a visualização da amostra 
 
→ ELISA indireto: 
• Avalia a presença de anticorpo específico em uma amostra 
de soro de paciente 
• O primeiro passo é a fixação do antígeno específico para 
o anticorpo pesquisado na placa, que será incubada para 
esse antígeno fixar nela, lavada e posteriormente será 
feito o seu bloqueio, usando uma substancia bloqueadora 
para preencher os espaços intermoleculares 
• Será adicionado o soro testado contendo os anticorpos do 
paciente nessa placa, ela será incubada, e posteriormente 
será lavada com solução tampão 
• Após isso, vai ser adicionado o anticorpo conjugado (anti-
Ac) marcado com enzima nessa placa, que será incubada 
novamente 
• Após o tempo de incubação, ela será lavada novamente, 
ficando ligado apenas os anticorpos de interesse no soro 
do paciente, que poderá ser quantificado após adicionar 
o substrato enzimático dessa enzima 
• Isso ocorre, pois a enzima consome esse substrato e essa 
reação é passível de quantificação pelo leitor de ELISA 
(espectrofotômetro) que vai quantificar a cor da reação 
• A quantidade da cor comparada com a média de controles 
positivos e negativos, dá a região de corte (cut-off) 
• O resultado positivo é aquele acima da região de corte 
• O resultado negativo é aquele abaixo da região de corte 
• Usado para diagnóstico de HIV, toxoplasmose, doença de 
Chagas, etc 
 
 
→ ELISA de Captura – Detecção de IgM: 
• Captura de anticorpos IgM no soro do paciente para 
identificar a resposta sobre a fase aguda do paciente 
• A placa é sensibilizada com anticorpos anti-IgM, que será 
encubada e lavada com solução tampão, e depois vai-se 
adicionar a substância bloqueadora 
• Após isso se adiciona a amostra do soro do paciente, que 
será incubado novamente para dar o tempo de captura da 
IgM desse soro pelo anticorpo anti-IgM fixado na placa 
• Esse paciente pode ter IgM contra mais de uma infecção 
ao mesmo tempo ou pode ter o chamado fator reumatoide 
(tipo de IgM produzida por alguns indivíduos) 
• Após o tempo de incubação a placa será lavada, e serão 
adicionados os antígenos específicos para a doença que 
se deseja analisar, e caso a IgM seja específica para esse 
antígeno, ela vai captura-lo 
• Após isso, é adicionado um anticorpo conjugado marcado 
com a enzima, e será feita uma nova lavagem, ficando 
marcado com a enzima apenas as IgM específicas contra 
a doença que está sendo pesquisada 
• Se os Ags inespecíficos conseguirem se ligar mesmo que de 
forma fraca à IgM, apenas os antígenos específicos serão 
quantificados, pois o conjugado é específico para eles 
• Após jogar o substrato, a enzima vai consumir ele, e essa 
poderá ser quantificada posteriormente 
• Usada para o diagnóstico da dengue 
• Usado para infecções agudas que se tem urgência para 
identifica-las 
 
 
Westernblot 
 
→ Diagnóstico: 
• Usado para detectar anticorpos específicos contra frações 
proteicas antigênicas (epítopos desses patógenos) de um 
determinado patógeno em um soro de paciente 
• Antes de realizar a reação imune, é feita uma eletroforese 
que separa as frações antigênicas daquele patógeno 
 
→ 1ª ETAPA – Eletroforese (SDS-PAGE): 
• PAGE – eletroforese em gel de poliacrilamida 
• SDS (dodecilsulfato de sódio) – substância adicionada 
para igualar as cargas na amostra antigênica de maneira 
que embora se use uma corrente elétrica que empurra a 
amostra para correr no gel, a separação se ocorre por 
tamanho, pelo gel ser uma trama 
 Resumo da Malu – 2020.2 
• Quando se polimeriza o gel, ele forma uma espécie de rede 
e pode-se usar uma rede com todos os entremeios iguais 
ou uma rede em gradiente, aumentando ou diminuindo a 
trama da rede 
• Montagem – monta-se duas placas, e seu entremeio será 
preenchido com o gel de separação até uma determinada 
altura, e em cima coloca-se o gel de empilhamento que 
possui uma trama bem leve, e antes do gel polimerizar se 
coloca uma espécie de pente, e depois que o gel polimeriza 
ficam os slots para se colocar a amostra depois 
• Então, quando se coloca a amostra nos slots, ela é passada 
na corrente elétrica do polo negativo em direção ao polo 
positivo, pois o SDS-PAGE faz com que a carga da amostra 
fique toda negativa 
• Então, a amostra é empurrada na direção da corrente e 
como a trama é uma rede com diferentes “estágios”, as 
amostras maiores ficam retidas no início pois passam por 
entre as partículas da rede caminhando mais devagar por 
terem que desviar da trama, já as amostras menores 
conseguem passar com facilidade pela trama, pois passam 
dentro das bolinhas do gel, avançando mais rápido no gel, 
e com isso, essa amostra é separada pelo tamanho 
 
• Em um dos slots (normalmente o primeiro) serão usados 
marcadores de peso molecular, para ser um valor de 
referência para a amostra 
• Normalmente, se faz o gel 
decrescente, e como as 
frações pequenas passam 
mais rápido no meio das 
bolinhas do gel, elas 
avançam mais rápido, 
enquanto as frações de 
maior peso molecular 
demoram mais por ficarem 
retidas pela trama, por 
precisarem desviar das moléculas do gel para passar 
• Em cima, tem-se as moléculas de alto peso molecular 
• Em baixo, tem-se as moléculas de baixo peso molecular 
• Lembrando que a amostra precisa ser corada, e o corante 
usado possui baixo peso molecular → com isso, quando as 
amostras vão chegando no fim do gel, deve-se interromper 
a corrente, para a amostra não sumir 
• Uma vez terminada a corrida, deve-se então montar a 
eletrotransferência para a membrana (nitrocelulose ou 
PVDF) 
• Montagem – tem-se uma placa do anodo (+) embaixo, 
acima dela um papel de filtro (anodo de reserva), em cima 
dele é colocada a membrana e o gel por cima, e depois 
completa-se com outro papel de filtro (catodo de reserva) 
e a placa do catodo (-) 
• Deve-se ter muito cuidado na hora da transferência 
• Por se usar um tampão com carga negativa, deve-se correr 
a amostra no sentido do polo negativo para o positivo, 
então a membrana deve estar do lado do polo positivo 
para quando a amostra ser empurrada do gel para baixo, 
ela ir de encontro a membrana para ser capturada por ela 
• Lembrando que é importante calcular o tempo que isso vai 
levar para a amostra não passar da membrana 
 
 
→ 2ª ETAPA – Reação Imunoenzimática: 
1. Reação antígeno-anticorpo: 
• Será feita em cima da membrana 
• Visto que a membrana possui diversas frações, é então 
colocado o anticorpo nela, e essa placa contendo a 
membrana e o anticorpo será incubado por um tempo 
• Após o tempo de espera, a amostra será lavada para 
tirar tudo que não foi ligado 
2. Reação com Ac conjugado com substrato cromogênico: 
• Após a lavagem, é adicionado o anticorpo conjugado 
(anti-anticorpo) marcado com a enzima 
• Esse anticorpo pode ser marcado por fluorescência, 
radioisótopo, mas o mais usado é por ELISA (enzima) 
• Se espera um tempo para reagir, a amostra é lavada 
novamente e é adicionado o substrato, que quando 
consumido pela enzima desencadeia uma reação 
cromogênica 
3. Visualização do complexo antígeno-anticorpo formado: 
• Só vai ser corada a amostra antigênicapara qual o 
individuo tiver anticorpo específico para ela 
 1 2 3 
 
 Resumo da Malu – 2020.2 
• A revelação pode ser feita com um substrato colorimétrico 
ou quimioluminescente 
 
→ Western blot para diagnóstico de HIV: 
• Essa técnica ganhou fala quando foi empregada para o 
diagnóstico de HIV, servindo para o acompanhar a doença 
 
• Membrana mostrando para quais antígenos esse paciente 
possui anticorpo ao longo dos dias 
- NC (controle negativo) – onde se pegou uma tirinha da 
nitrocelulose com Ags separados e colocou soro negativo 
- PC (controle positivo) – nele deve ser visualizado as 
bandas para todos os antígenos para o HIV 
- D0, D2 e D3 – janela imunológica onde ainda não houve 
soroconversão desse paciente, não sendo possível fazer 
a detecção dos anticorpos contra o agente 
- D5 – nesse dia começa a aparecer os anticorpos contra 
o antígeno p24 do HIV, e sua banda é intensificada ao 
longo dos dias 
- D8 – nesse dia começa a aparecer outros antígenos que 
são enzimas ou precursores das proteínas virais 
- D9 – começa a aparecer a glicoproteína 160, que é o 
precursor da glicoproteína 120 presente no envoltório do 
vírus do HIV 
- D10 – começa a aparecer a última glicoproteína gp41 
• O western blot captura antígenos em diferentes fases da 
doença, e permite acompanhar a evolução da conversão 
sorológica do indivíduo, e consequentemente, quanto mais 
anticorpos ele apresenta contra as principais moléculas de 
frações antigênicas do HIV, mais avançado está a AIDS 
 
 
• Atualmente, a fase de janela imunológica permite que se 
detectasse por PCR, a carga viral (presença do HIV) 
Teste Imunocromatográfico 
 
→ Características: 
• É um teste super rápido que necessita de uma confirmação 
posteriormente por um teste especifico e mais sensível 
• A separação das frações por peso molecular desses testes 
é feita diretamente na membrana de nitrocelulose 
• Boa especificidade e sensibilidade não tão boa assim 
• Representa grande avanço, pois possibilitou uma técnica 
de triagem em uma população contra um determinado 
patógeno 
 
 
→ Teste Rápido: 
• Permite detectar rapidamente a presença de antígeno ou 
anticorpo na amostra 
• Vantagens: 
- Facilidade de armazenamento e transporte para a coleta 
em campo 
- A maneira que ele foi feito faz com que ele não precise 
de armazenamento em geladeira 
- É transportado em grandes quantidades sem problemas 
- Pode ser realizado no consultório médico 
- Fácil utilização 
- Não exige grande quantidade de reagente (como ELISA) 
• Resultado positivo – deve-se fazer um teste diagnóstico 
confirmatório mais específico e sensível 
• Resultado negativo – necessidade de se testar novamente 
após um período de tempo (em torno de 14 dias), pois ele 
não detecta com tanta facilidade os anticorpos 
• Existem vários tipos de testes rápidos, cada um adaptado 
a um tipo de pesquisa. São eles: 
- Imunocromatografia de Fluxo Lateral 
- Imunocromatografia de Dupla Migração (DPP) 
- Imunoconcentração 
- Imunocromatografia de Fase Sólida 
 Resumo da Malu – 2020.2 
• O primeiro teste inventado foi um pequeno cassete, entre 
as duas placas de plástico há presença de uma membrana 
de nitrocelulose 
• Nessa membrana, serão fixados os reagentes, como por 
exemplo para se determinar a presença de anticorpos no 
soro de um paciente, então na membrana de nitrocelulose 
será fixado um anticorpo ligado a ouro coloidal 
• O ouro coloidal faz com que o antígeno de interesse que se 
está testando precipite na membrana, quando ficar preso 
ali, aparecendo então a marcação do ouro coloidal 
• É colocado ali a amostra de sangue do paciente junto com 
o tampão que vai ajudar na migração 
• Quando o anticorpo do paciente se liga no conjugado anti-
anticorpo + ouro coloidal, forma-se um complexo, que vai 
continuar migrando 
• O conjugado se ligou ao anticorpo específico do soro do 
paciente para o antígeno que se está testando, e quando 
o complexo migra, se o anticorpo é específico para esse 
antígeno que se quer testar, ele grudar no antígeno 
• Dessa forma, o ouro coloidal vai precipitar, e o que sobrar 
por não ter ligado a nada vai continuar correndo 
• Se o anticorpo do paciente não for específico para esse 
antígeno, ele continuará correndo e vai se ligar na linha 
teste – possui anticorpo conjugado (anti-anticorpo) que 
captura os anticorpos não específicos para o antígeno que 
se está estudando que sobraram 
• Logo, o anti-anticorpo na linha controle captura o excesso 
do anti-anticorpo ligado ao ouro coloidal e o excesso do 
anticorpo não específico do indivíduo 
• Por isso, a linha controle deve SEMPRE dar positivo, pois 
ela deve capturar tudo o que não se ligou ao antígeno 
para comprovar que o aparelho está funcionando 
• A linha teste só vai funcionar se o indivíduo tiver anticorpo 
contra o antígeno, porém, o anticorpo está ligado ao anti-
anticorpo marcado com ouro coloidal, dessa forma, terá 
aparecendo a linha teste e a linha controle funcionando 
 
→ Imunocromatografia de Fluxo Lateral: 
• Usada para sífilis (Treponema pallidum) 
• No exemplo abaixo, a placa é marcada com o antígeno T. 
pallidum com ouro coloidal que é fixado na membrana de 
nitrocelulose 
• Quando se adiciona o soro do paciente, os anticorpos 
presentes nesse soro podem se ligar ao complexo antígeno 
+ ouro coloidal, e esse complexo será arrastado em direção 
à migração da nitrocelulose 
• Na área teste da membrana está localizada a proteína do 
T. pallidum, e a valência livre do anticorpo da amostra vai 
se ligar a essa proteína, que vai precipitar por conta do 
ouro coloidal formando uma linha 
• Os complexos que sobrarem ou que não ligarem vão 
continuar migrando na membrana 
• Chegando na área controle da membrana, está localizado 
o anticorpo conjugado anti-Treponema pallidum, que vai 
capturar os antígenos que sobraram do conjugado inicial, 
assim a linha controle será marcada 
• O teste só será válido se a linha controle aparecer 
 
 
→ Imunocromatografia de Dupla Migração ou Duplo Percurso: 
• A diferença desse teste é que existe um local para se 
adicionar a o anticorpo, e outro para se colocar a amostra 
• Eles irão migrar e se encontrar na janela de leitura 
• O complexo antígeno + ouro coloidal que sobrar por não 
ter anticorpo no soro do paciente vai ser capturado pela 
amostra controle 
• Caso o soro do paciente tenha anticorpo específico, ele 
será capturado pela amostra teste 
• A proteína A é extraída de Staphylococcus e se liga em IgG 
• Se há a presença de proteína A, e no soro do paciente tem 
anticorpo, ele vai se ligar na proteína A associada ao ouro 
coloidal, e esse complexo vai migrar pela membrana 
• Na outra janela é inserido o anticorpo anti-Treponema, e 
quando chegar na área teste, o que não for capturado 
pelo antígeno recombinante, vai sobrar e será capturado 
na área controle que possui uma imunoglobulina qualquer 
• Como a proteína A se liga em Ig, o que restou do conjugado 
será capturado na faixa controle 
• A proteína A se liga ao anticorpo do Treponema, e os dois 
se ligam no antígeno recombinante, e o que sobrar dessa 
área teste será capturada na área controle por uma Ig 
irrelevante qualquer 
• Esse teste só é valido quando a faixa controle funciona 
 
 
 
 
 Resumo da Malu – 2020.2 
 
→ Interpretação do Resultado: 
• Reagente – há formação de duas linhas coloridas, uma na 
área de teste (T) e outra na área de controle (C) 
 
• Não reativo – quando há formação de uma linha colorida, 
somente na área de controle (C), e nesse caso deve-se 
repetir o teste após 14 dias 
 
• Inválido ou Indeterminado – não há formação de linha 
colorida na área de controle (C) 
 
• Exemplos: 
- O cassete com o diluente, reagente e o acessório para 
furar o dedo são disponibilizados pelo kit 
- Ostestes podem ser feitos usando uma gota de sangue, 
saliva, plasma 
 
 
 
 
→ Parâmetros para um teste ideal: 
• Sensibilidade – Porcentagens de resultados positivos pelo 
teste na população de indivíduos doentes. Teste usado 
para detectar indivíduos positivos em uma população de 
pessoas que se tem certeza de estarem doentes 
- VP – valor positivo 
- FN – falso negativo 
𝑆𝑒𝑛𝑠𝑖𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 = 
𝑉𝑃
𝑉𝑃 + 𝐹𝑁
 
• Especificidade – Porcentagem de resultados negativos 
pelo teste na população de indivíduos não-doentes. Teste 
usado para detectar indivíduos negativos numa população 
que se tem certeza de estar sadia 
- VN – valor negativo 
- FP – falso positivo 
𝐸𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 = 
𝑉𝑁
𝑉𝑁 + 𝐹𝑃
 
• Valor preditivo positivo – proporção de indivíduos doentes 
entre os resultados positivos obtidos no teste em estudo 
- VP – valor positivo 
- FP – falso positivo 
𝑉𝑃𝑃 = 
𝑉𝑃
𝑉𝑃 + 𝐹𝑃
 
 
→ Diagnóstico de COVID-19: 
• Visão geral de quando se utiliza os testes 
• RT-PCR: 
- Teste padrão ouro feito por biologia molecular 
- É o método mais sensível para o diagnóstico viral 
- Pois nessa doença é bom detectar os indivíduos positivos 
o mais rápido possível, e sabendo que ele está doente se 
inicia o tratamento para que os sintomas não avancem 
prejudicando o indivíduo 
- Permite detectar a carga viral um pouco antes do início 
dos sintomas, pois é detectada através da liberação do 
ácido nucleico viral 
- Com apenas 5 dias ele já possui uma eficiência máxima 
para conseguir detectar esses ácidos nucleicos virais 
- Longo tempo de analise (leva no mínimo 6 horas), é um 
procedimento complexo que necessita de equipamentos 
e profissionais especializados para leitura dos resultados 
 Resumo da Malu – 2020.2 
• Testes rápidos: 
- Geralmente pesquisam anticorpo, porém o Ac demora a 
aparecer, surgindo a partir do 14º dia 
- Por isso, inventou o teste rápido que pesquisa antígeno 
- A intensidade com que se detecta é menor, pois se tem 
uma intensidade menor do antígeno, mas entre o 5º e 
10º dias de sintomas já é possível detectar 
- É um procedimento muito simples com resultado mais 
rápido, permitindo uma agilidade na tomada de decisão 
(importante visto o seu aspecto pandemiológico) 
- É menos sensível que o PCR 
• Testes sorológicos: 
- Detecção de anticorpos 
- Dependem da janela imunológica 
- Depende de quanto tempo a pessoa demora pra produzir 
anticorpo 
- Depende se o anticorpo é neutralizante ou não 
- Em caso de resultado de PCR negativo, pela diminuição 
do teste de título viral (a medida que o título viral vai 
caindo o PCR vai dando negativo), os testes sorológicos 
são uteis para verificar a presença do anticorpo e 
conduzir o paciente na investigação epidemiológica 
- É ineficiente no diagnóstico da fase aguda 
- Alguns detectam IgM, mas depende de muitos fatores 
 
 
 
 
→ Teste Rápido: 
• Pesquisa de antígeno (fluxo lateral): 
- Na membrana de nitrocelulose, se tem um conjugado 
(anti-S1 e anti-Proteína N) associado ao ouro coloidal 
- Proteína S1 – proteína spike de adesão 
- Proteína N – proteína do nucleocapsídeo 
- Quando se joga a amostra do paciente ali, esse complexo 
captura o antígeno, e junto com o diluente o complexo 
vai migrar 
- Na zona teste, se tem um anticorpo monoclonal contra as 
proteínas N e S1, que faz com que p complexo se ligue ao 
antígeno, tendo uma reação positiva 
- O que restar dessa reação, vai continuar migrando e vai 
se ligar aos anti-anticorpos presentes na zona controle, 
que garante a validade do teste 
 
 
• Pesquisa de anticorpo (fluxo lateral): 
- O que muda na pesquisa de anticorpo, é que ao invés de 
se ter o conjugado que captura o antígeno da amostra, 
vai se ter um conjugado ao ouro coloidal que captura 
anticorpos humanos 
- Na região teste, ao invés de se ter um anticorpo, vai ter 
um antígeno que vai se ligar no complexo anticorpo + 
conjugado anti-anticorpo 
 
 Resumo da Malu – 2020.2 
 
• TR DPP COVID-19 IgM/IgG (duplo percurso): 
- Teste imunocromatográfico numa plataforma de duplo 
percurso diferenciada 
- A tecnologia: evolução do teste rápido de fluxo lateral, 
pois consiste em um duplo teste de duplo percurso 
- Permite se identificar separadamente IgM e IgG em 
janelas diferentes 
- Ampliação dos níveis de sensibilidade e especificidade – 
pois separa o processo de ligação antígeno-anticorpo, 
do processo de revelação, com resultados confiáveis 
- Vantagens – leitura eletrônica (microleitor) e em uma 
amostra é possível realizar duas reações independentes 
simultaneamente (detecção diferenciada de IgM e IgG) 
- Faz o registro automático e tratamento dos dados em 
computador, que pode ser incorporado ao leitor 
 
• Teste rápido ELISA: 
- Pesquisa de anticorpo 
- Sensibilidade em torno de 98,0% 
- Especificidade em torno de 99,2% 
- Até 90 amostras por placa mais 6 controles 
- Tempo de teste de aproximadamente 2 horas 
 
→ Teste para anticorpos neutralizantes: 
• O anticorpo neutralizante é aquele que vai neutralizar a 
entrada do vírus na célula hospedeira 
• A entrada do SARS-CoV-2 é feita com ajuda da molécula 
spike (1 ou 2), e viu-se que a spike 1 possui um domínio de 
reatividade (RBD) grande para o receptor ACE2 
• RBD domain spike – essa região é o domínio de ligação da 
spike para o receptor ACE2 
• Nos testes de neutralização, se tem a ligação do ACE2 na 
placa, e se joga na placa o soro teste e o RBD 
• Se o indivíduo tem anticorpos neutralizantes contra o 
domínio RBD, ele vai se ligar nele, impedindo a sua ligação 
ao ACE2 da placa, tendo um resultado positivo 
• Os anticorpos não neutralizantes não se ligam ao RBD, 
tendo uma reação de inibição do ELISA, dessa forma há um 
resultado negativo 
• O anticorpo neutralizante tem a capacidade de neutralizar 
a reação do ELISA, já os anticorpos não neutralizantes vão 
se ligar, mas não serão detectados na reação 
• Quando a reação dá muita cor, ela reflete o anticorpo 
total 
• O que interessa para esse teste é o quanto inibiu, e a 
quantificação da inibição da cor, que diz quanto de 
anticorpo neutralizante havia nessa reação, pois não 
deixou o anticorpo comum se ligar, e quando se adiciona 
o anti-anticorpo marcado, ele vai se ligar dando muita cor, 
pois vai dosar todos os anticorpos presentes 
• Mas quando se diminui a cor, significa que o domínio foi 
bloqueado, não permitindo a sua ligação ao ACE2, e dessa 
forma, se consegue quantificar comparando a densidade 
do soro total com a inibição da densidade ótica, e dessa 
forma, é possível se ter uma noção da neutralização da 
reação