Aula 07 - Producao de Antibioticos

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Produção de Antibióticos
Prof. Dr. Antony Barbosa
Principais Características
São substâncias com toxidade seletiva;
Possui ação danosa aos microrganismos, sem afetar as células do hospedeiro;
Usado no tratamento de doenças infecciosas;
São conhecidas cerca de 100.000 substâncias, porém somente 800 são utilizadas;
História
Paul Ehrlich (1854 - 1915) – desenvolveu a “bala mágica” através de experimentos com corantes e técnicas de coloração de microrganismos;
1904 – Foi utilizado o vermelho tripan no tratamento do tripanossoma, causador da doença africana do sono;
Ehrlich & Hata (1910) – uso da arsfenamida no tratamento de sífilis (Salvarsan);
História
G. Domagk (1935) - Vermelho Prontosil (camundongos), e o Prontosil quando clivado no organismo originava a sulfanilamida (droga eficaz);
H. Florey & E. Chain (1939) – Após 43 anos da descoberta da penicilina por E. Duchesne, conseguiram a purificação da penicilina e testes em cobaias;
História
S. Waksman (1944) – descobrimento da estreptomicina (Streptomyces griseus);
1953 – Isolamento de microrganismos produtores: Cloranfenicol, Neomicina, Terramicina e tetraciclina;
A partir de 1953 – a indústria investiu milhares de dólares na busca de novas drogas antimicrobianas.
Processo de Investigação de Novas Drogas
Desaceleração na taxa de realização de novas pesquisas;
Altos Custos 
(10 - U$20 milhões)
2,6 % das novas drogas usadas para fins terapêuticos (1965). Atualmente apenas 1%.
8-10 anos de pesquisa;
Importância de Novas Pesquisas 
Aprimoramento dos antibióticos naturais
Maior atividade;
Menor toxicidade;
Menores efeitos colaterais
Maior espectro de ação;
Melhores propriedades farmacológicas.
Fig: Recente surto de E. coli, na Alemanha, cepas resistentes à antibióticos.
Aumento na Resistência Múltipla e Cruzada:	
Desenvolver resistência simultânea a mais de um antibiótico, que possuam o mesmo modo de ação.
Importância de Novas Pesquisas 
Fonte: Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003. 
Princípios de um Agente Antimicrobiano
Ser ativo frente ao patógeno in vivo;
Não deve produzir reações indesejáveis, ou seja, deve ser relativamente atóxico para fagócitos, células, tecidos e órgãos do corpo;
Princípios de um Antibiótico
Não deve precipitar as proteínas do soro;
Ser solúvel em água ou soro fisiológico;
Ser relativamente estável;
Não deve hemolisar o sangue.
Fig.: Dano causado às hemáceas durante a hemólise.
Princípios de um Antibiótico
A potência varia com a massa;
Nível sérico varia com a via de absorção;
O antibiótico deve ser ingerido periodicamente de modo a manter a concentração mínima letal ao patógeno.
Fonte: Uerj.
Aplicações
Agentes terapêuticos;
Antitumorais (citostáticos);
Contra doenças das plantas:
Tratamento de sementes
Cultura do arroz.
Conservantes de alimentos (ex: nisina contra os clostrídios).
Estimulantes do crescimento animal;
Ferramentas na bioquímica e biologia molecular.
Fig: Validamicina (validacin, Produto comercial.
Antibióticos Contra Doenças em Plantas
	Antibióticos e seu grupo químico	Microrganismo	Usos
	Blasticidina S (nucleosídeo)	Streptomyces griseochromogenes	Fungicida do arroz contra Piricularia oryzae
	Polioxina (nucleosídeo)	Streptomyces cacaoi	Fungicida de uso múltiplo
	Prumicina (nucelosídeo) 	Streptomyces kagawaensis	Fungicida contra espécies de Botrytis e Sclerotinia
	Cicloheximida (aminoácido)	Streptomyces griseus	Fungicida para folhas, tóxico para animais de sangue quente e tem uso na colheita.
	Kasugamicina (aminoglicosídeo)	Streptomyces kasugaensis	Fungicida para arroz contra Piricularia oryzae
	Validamicina (aminoglicosídeo)	Streptomyces hygroscopicus	Fungicida contra Rhizoctonia
Grupos Microbianos Produtores de Antibióticos
	Grupo Taxonômico	Nº de Antibióticos
	Actinomicetas 	4200
	Fungos	1600
	Outras
Bactérias 	950
A
B
C
A – Aspergillus sp; B – Bacilos sp.; C – Penicillium sp
Fonte: Biotecnologia Industrial, V3, 2001.
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Segundo nível
Terceiro nível
Quarto nível
Quinto nível
Classificação
Os antibióticos podem ser classificados de acordo com:
Espectro antimicrobiano;
Mecanismo de ação;
Cepa produtora;
Forma de biossíntese;
Estrutura química.
Classificação de acordo com o Espectro de Ação
Fonte: (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)
Classificação de acordo com o Mecanismo de Ação
Inibidores da síntese da parede celular;
Penicilinas e celafosporinas.
Inibidores da síntese de DNA e RNA;
Actiomicinas.
Inibidores da síntese de proteínas;
Aminoglicosídeos.
Alteradores de permeabilidade da M. citoplasmática;
Polimixinas.
Classificação de acordo com a Estrutura Química
Biotecnologia Industrial, 2005.
Grupo dos β-Lactâmicos
Lábeis em meio ácido;
Inativados pela hidrólise do anel β-lactâmico com penicilinase;
Baixa toxicidade;
Só 0,5 -2% dos pacientes desenvolve alergia;
Inibidores da transpepitidase;
bloqueio da síntese de parede celular bacteriana (peptidoglicano).
Fig.: β-Lactâmicos com anéis em destaque.
Mecanismo de Ação β-Lactâmicos
Fonte: (Adaptado de Atlas, R.M., Principles of Microbiology, 1997) 
Efeitos de Antibióticos β-Lactâmicos
A
B
Escherichia coli: [A] morfologia normal
[B] morfologia após 30 min contato com ceftazidima (celafosporinas)
Penicilina
Penicillium chrysogenum;
Interfere na síntese da parede de peptídeoglicano e leva à Lise celular;
Amplo espectro de ação; 
DST”s, infecções trato intestinal e meningite.
Penicilina G e V.
Classificação de acordo com a Estrutura Química
A
B
Fig. A – Estrutura da penicilina; B – Produto comercial á base de penicilina.
Classificação de acordo com a Estrutura Química
Cefalosporinas
Cephalosporium acremonium;
Antibiótico bactericida;
Possui Anel Beta-lactamico;
Controle de Gram(+) e Gram(-)
Cocos e Escherichia coli, respectivamente.
Interrompem a síntese de Peptídeoglicano
Causa diarréia e náuseas.
A
B
Fig.: A – Antibiótico à base de cefalosporina; B – Staphylococus aureus 
Penicilinas
Penicilinas Semi-sintéticas
Mais estáveis;
>Resistência à β-lactamase;
>Atividade antimicrobiana;
Hidrolisação da Penicilina Natural à 6-APA;
Adição de precursores 
Ácidos da cadeia lateral;
Penicilina V, adição Ác. Fenoxiacético.
Penicilina G, adição Ác. Fenilacético.
Biossíntese e Regulação
L-cisteína
L-valina;
Ác. α-aminoadípico 
(α-AAA)
		Condensação 	num tripéptido δA 	(L-α- aminoadipil) 	cisteinilvalina
O tripéptido é ciclizado e forma-se a isopenicilina N
Primeiro composto com atividade microbiana
Produção da Benzipenicilina a partir Ác. Fenilacético reagindo com Ác. α-aminoadípico
Biossíntese e Regulação
Inibidores da síntese de penicilina
Lisina, retroinibição da homocitratosintase*
*enzima envolvida na síntese de α-AAA.
Concentração de Fosfato;
Glicose, repressão catabólica
Prefere-se a lactose para o processo de fermentação. 
Desenvolvimento de Cepa – Fatores Interferentes
Qualidade da Cepa;
Screening;
Técnicas recombinação 
	do DNA.
pH;
Em torno 6,5.
Temperatura;
25 à 27ºC.
Oxigênio
Aeróbios;
Aeróbios facultativos.
Agitação;
Fig: Fermentador utilizado para produção de antibióticos.
Desenvolvimento de Cepas
Objetivos: 
Aumento rendimento
Eficiência na recuperação do produto; 
P. Notatum (Flaming);
1943- P. chrysogenum NRRL 1951.
Por mutagênese – estirpe WisQ176.
Fig.: Cepas de P. crysogenum
Agentes Mutagénicos
Screening de mutante;
Até anos 60;
Raio x;
Radiações λ curto;
Atualmente
Nitritos;
Agentes Alquilantes;
Nitrosoguanidina.
Outros meios de desenvolvimento de Cepas
Fusão de protoplastos;
Aumento de rendimento de 8%;
Superior obtido por mutação ou seleção.
Tecnologia de DNA recombinante;
Não muito usada em P. chrysogenum.
Métodos de Produção
Processo submerso de fermentação;
Fermentadores de 40-200mil litros.
Processo aeróbico;
Absorção volumétrica de Oxigênio de 0,4-0,8mM/L-min;
 Velocidade de aeração requerida entre 0,5-1,0 vv;
Faixa de temperatura ótima é de 25-27°C.
Fluxograma de Produção
Métodos de Produção
O inoculo se iniciautilizando esporos liofilizados*;
*Manutenção cuidadosa das cepas;
 Formação de agregados (“Pellets”) e concentração de esporos;
Etapas de crescimento.
Métodos de Produção
Fermentação típica de penicilina
Tempo de crescimento de 40 horas
Tempo de duplicação de 6 horas
Baixa aeração do cultivo em crescimento é critica;
Alimentando o meio com diferentes componentes a produção se estende por até 120 – 160 horas.
Métodos de Produção
Componentes de um meio de cultura:
Nitrogênio ( água de milho ou farinha de soja);
Carbono (lactose);
Vários tampões;
pH mantido constante a 6,5.
Adição do precursor;
ácido fenilacético;
Produção Penicilina G.
Biomassa g.L-1, carboidratos, amônio e penicilina (g.L-1 x 10)
Métodos de Produção
Fermentação contínua;
Dificultado pela instabilidade das cepas de produção.
Adoção do sistema enche e retira;
Retira-se 20-40% da fermentação;
Alimenta-se com solução fresca de nutrientes;
Repete-se esse procedimento por até 10 vezes, sem redução do rendimento.
Métodos de Produção
Teor de penicilina excretada é de menos de 1%;
Se encontra unida ao micélio
Separa-se por filtração;
Recuperação do produto por meio:
Extração continua em contracorrente do caldo de fermentação
Rendimento de 90%
Cefalosporinas
Biossíntese e Regulação
Precursores:
δ-(α-aminoadipil)-l;
Cisteinil-d-valina;
Isopenicilna-n.
Transformação de cadeia lateral;
Formação de penicilina N;
Enzima racemase.
Hidroxilaçao controlada por uma dioxigenase à deacetilcefalosporina C;
Biossíntese e Regulação
O ponto final da via biosintética em fungos é dada pela acetilaçao da cefalosporina C;
A produção de cefalosporina é regulada pelo fosfato, pelo nitrogênio e regulação catabólica do carboidrato;
A adição de lisina a baixas concentrações favorece a produção de cefalosporina.
Desenvolvimento de cepas
Realizado com a cepa original de Brotzu, C. acremonium, utilizando mutação, seleção e técnicas parassexuais;
Mutantes reguladores resistentes a enxofre tem uma produção superior de cefalosporina;
Recombinação parassexual em C. acremonium é de difícil acontecimento.
Desenvolvimento de cepas
Fusão de protoplastos de diferentes cepas tem um aumento de 40% na produção de cefalosporina, melhor crescimento e esporulação; 
Processo de Produção
A fermentação da cefalosporina é similar a da penicilina;
Utiliza-se meios como macerado de milho, extrato de carne, sacarose, glicose e acetato de amônio;
Processo descontinuo alimentado é usado nas fermentações, condição semi-continua de nutrientes.
Processo de Produção
pH de 6 a 7;
Temperaturas entre 24 e 28º C;
Na fase de crescimento é necessário alta velocidade de aeração;
A síntese química de cefalosporina pode ser feita por expansão do anel da penicilina;
Bibliografia
BORZANI, W.; LIMA, A,U.; AQUARONE, E.; SCHMIDELL,W.; Biotecnologia industrial, vol. 3, p. 101-120. São Paulo, 2001.
http://vsites.unb.br/ib/cel/microbiologia/antibioticos/antibioticos.html. Acessado em 08/11/2011, às 01:31.