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A R E V I S T A U N I V E R S I T Á R I A N Ú M E R O 1 D A U F B A ED I ÇÃO N ° 3 A CÉLULA A UNIDADE FUNDAMENTAL DA VIDA J U N H O / 2 0 1 9 Í N D I C E D N A História do DNA 06 O Genoma 08 A cromatina 10 R E P L I C A Ç Ã O D O D N A DNA polimerase 13 Origem da replicação 15 Replicação de procariotos 17 Replicação de eucariotos 19 Reparo do DNA 20 E X P R E S S Ã O G É N I C A Transcrição 22 Transcrição em procariotos 24 Transcrição em eucariotos 25 Tradução 27 Processo de tradução 31 R E G U L A Ç Ã O D O C I C L O C E L U L A R Regulação do ciclo e câncer 37 Aplicação de conteúdos 42 Referências 48 A biologia é a ciência que estuda os seres vivos, ou seja, é o estudo da vida. M A biologia celular estuda as células e sua estruturas, elucidando a sua importância para a constituição, benéfica ou maléfica, dos seres vivos A biologia molecular estuda as interações entre os vários sistemas da célula e o modo como essas interações são reguladas. B C D N A H I S T Ó R I A D O D N A - G E N O M A - A C R O M A T I N A 5 O ácido desoxirribonucleico (DNA) é composto por quatro tipos de nucleotídeos (adenina, guanina, tirosina e citosina), que a partir das ligações fosfodiéster, constituem duas cadeias polinucleotídicas. Estas cadeias, por sua vez, são unidas por pontes de hidrogênio entre as bases dos nucleotídeos. Um nucleotídeo isolado é composto por uma pentose, um grupo trifosfato, que fornece energia para o nucleotídeo se ligar a uma cadeia polinucleotídica, e uma base nitrogenada. A forma pela qual os nucleotídeos estão unidos fornece uma polaridade química as fitas de DNA, indicada por uma extremidade 3‟ e outra 5‟. As fitas de DNA estão sempre igualmente espaçadas ao longo da molécula. Isso ocorre, pois uma base púrica, aquela que possui dois anéis, está sempre ligada a uma base pirimídica, aquela que possui um anel. Essa complementaridade de pareamento de bases permite um arranjo mais favorável energeticamente e é imprescindível para o processo de replicação e reparo do DNA. As fitas polinucleotídicas estão orientadas antiparalelas, ou seja, com polaridades opostas, na molécula de DNA, o que contribui para uma conformação mais estável energeticamente. Figura 1. Estrutura do DNA 6 O DNA foi descoberto pelo bioquímico alemão Johann Friedrich Miescher, em 1869. A sua pesquisa incidiu nos glóbulos brancos do pus, uma vez que estas células possuem grandes núcleos, fáceis de isolar do citoplasma. O intuito era traçar os compostos químicos existentes no núcleo das células. O material para a sua pesquisa, o pus, era fácil de obter nas ligaduras usadas para os ferimentos. Assim, o bioquímico descobriu um material de natureza ácida composta de fósforo e azoto. Era um composto, aparentemente constituído por moléculas grandes a que denominou por nucleína. Figura 2. Johann Friedrich Miescher Em 1880, Albrecht Kossel, demonstrou que a nucleína continha bases azotadas na sua estrutura, daí serem ricas em azoto como tinha mostrado o Miescher. Já em 1889, Richard Altmann, aluno de Miescher, comprova a natureza ácida, obtendo a nucleína com alto grau de pureza, e designou-a por ácido nucleico. A partir destes cientistas foram desencadeadas numerosas investigações, onde foi descoberto que a degradação do ácido nucleico resultava em quatro tipos de bases nitrogenadas, a adenina, guanina, citosina e timina e outro produto da degradação era um glicídio com 5 átomos de carbono, uma pentose (desoxirribose) e um fosfato. Mais tarde, em 1890, foi descoberto um outro tipo de ácido nucleico na levedura, ou seja, o fermento. Este possuía uracila em vez de timina e uma pentose diferente, uma ribose em vez de desoxirribose. Desse modo, aparecem, então, duas classificações de ácidos nucleicos, em concordância com o glicídio que possuíam: O ácido ribonucleico (RNA) e o ácido desoxirribonucleico (DNA). Phoebus Levine e Walter Jacobs, no início do século XX, concluíram que o componente básico dos ácidos nucleicos é constituído por uma unidade composta por uma base azotada ligada a uma pentose e esta, por sua vez, ligada um fosfato. Esta unidade designou-se por nucleotídeo. Portanto, um ácido nucléico é então composto por diversos nucleotídeos unidos entre si, formando um polinucleotídeo. Durante muitos anos os cientistas seguiram estudando os ácidos nucléicos sem que se notasse a sua real importância como material hereditário. Foi Rosalind Franklin, entre 1947 e 50, que obteve uma imagem da difração dos raios x de DNA cristalizado através dos estudos de Maurice Wilkins. O radiograma mostrava uma configuração em cruz o que significavam a forma em hélice. Dessa maneira, 7 estes estudos permitiram a Maurice, James D. Watson e Francis Crick confirmar a estrutura em hélice do DNA. Descobre-se em 1950, por Erwin Chargaff, duas regras fundamentais para a compreensão do DNA. Já se sabia que era feita a partir das 4 bases (A, G, T e C). O que se descobriu foi que, a quantidade de adenina é equivalente à de timina e a de guanina é igual à de citosina, mas que essas quantidades não são iguais para os dois pares de bases. Aproximadamente, as quantidades são: Figura 3. Rosalind Franklin e a imagem da difração dos raios x de DNA A=T=30% e G=C=20%, consequentemente, a quantidade de A, G, C e T é diferente para indivíduos diferentes. As regras de Chargaff são importantes, pois apontam para um tipo de "gramatica da biologia". E sendo assim, estas regras foram muito importantes para James Watson e Francis Crick conseguirem desenvolver seu modelo de pares de base para a estrutura da dupla hélice. E dessa forma, em 1953, James D. Watson, biólogo americano e o Francis Crick, físico inglês, propuseram o modelo da dupla hélice do DNA. Esta proposta foi uma das maiores conquistas científicas no séc. XX e fez com que conquistassem o Prémio Nobel de Fisiologia e Medicina. Figura 4. Watson e Crick 8 O genoma é um conjunto de informações genéticas que vão determinar as características de um determinado organismo. É uma estrutura dinâmica que sofre constantes processos de modificações que podem conferir ao organismo o surgimento de novas moléculas com novas funções, sendo isso, a variabilidade genética. Os procariotos possuem um cromossomo único circular, que está associado à Membrana Plasmática e não possui um envoltório nuclear. Eles também contém estruturas chamadas plasmídeos. Estes plasmídeos vão acelerar as mutações em bactérias provocando uma maior variabilidade no genoma de bactérias. A estrutura do DNA de Procariotos é caracterizada por uma fita dupla circular, de aproximadamente 1micrômetro, onde o cromossomo único vai se associar com proteínas básicas que irão promover enovelamento e compactação do DNA formando os domínios. O DNA ocupa 1/3 do volume da célula e 90% do seu DNA codificam proteínas. Os plasmídeos que estão nas células procarióticas que são responsáveis por fazer a replicação autônoma, ou seja, auto replicação, e isso é uma vantagem evolutiva. Figura 5. Organização do DNA em procariotos Já o DNA eucariótico está representado na figura dos cromossomos. Cada cromossomo interfásico (cromatina) se localiza em regiões especificas no núcleo e se liga em determinados locais à lâmina nuclear, de modo a evitar que os cromossomos se enrosquem. O cromossomo mitótico encontra- se muito compactado, porém tal compactação deve ser flexível para permitir o acesso rápido ao DNA quando necessário. Esse material genético está associado a proteínas denominadas histonas, que são responsáveispelo primeiro grau de condensação da cromatina, o nucleossomo. Figura 6. Cromossomos 9 Há 50 anos, pensava-se que a quantidade de DNA em um genoma tinha uma correlação positiva com a complexidade de um organismo, ou seja, quanto mais complexa fosse uma espécie, mais DNA era necessário para armazenar aquelas informações que seriam traduzidas em fenótipos hierarquicamente mais complexos. Ao investigar a complexidade dos genomas em diferentes espécies, cientistas descobriram que grande parte desse DNA não era traduzido, ou seja, não carregava informação para sintetizar uma proteína. Logo descobriram que genomas muito grandes possuíam uma enorme quantidade de sequências repetitivas, padrões reconhecíveis na sequência de DNA que ocorrem em várias cópias no genoma, dispersas ou em tandem. Essas sequências estão presentes em todos os genomas e podem ter diversas origens. O genoma humano, por exemplo, incorporou ao longo do tempo DNA viral de infecções antigas. A fração do genoma correspondente a esses resquícios virais é maior que a fração do genoma que é traduzida em proteínas, que são os éxons. Como muitas dessas sequências não possuíam nenhuma função aparente, acabaram recebendo o nome de DNA lixo quando foram descobertas. Aos poucos, foram sendo atribuídas funções a uma parte pequena dessas sequências. Elas podem ter função estrutural na organização dos cromossomos na célula e uma função regulatória no ajuste da quantidade de RNA mensageiro produzido por genes próximos, e são denominadas íntrons. Os Íntrons e os éxons são seqüências de nucleotide dentro de um gene. Os Íntrons são removidos pelo RNA que emenda como o RNA se amadurece, significando que não estão expressados no produto final do RNA de mensageiro (mRNA), quando os éxons forem sobre ser ligados a um outro a fim criar o mRNA maduro. Dessa forma, os íntrons podem ser considerados como sequências de intervenção, e éxons como sequências expressadas. Os Éxons são as sequências de nucleotídeos no DNA e no RNA que são conservadas na criação do RNA maduro. Os Éxons incluem geralmente o 5' - e 3' - as regiões untranslated de mRNA, que possuem códons de início e de parada, além do que todas as sequências de codificação da proteína. Já os Íntrons são as sequências de nucleotídeos no DNA e no pré-RNA que não codificam diretamente para proteínas, e são removidos durante a fase do pré-mRNA pelo processo de splicing. Figura 7. Íntrons e Éxons 10 As proteínas que se associam ao DNA para formar os cromossomos eucarióticos pertencem a duas classes: histonas e proteínas cromossômicas não-histonas, por sua vez, o complexo formado pelas duas classes de proteínas com a DNA nuclear é denominado cromatina. As histonas são responsáveis pelo primeiro grau de compactação à cromatina, o nucleossomo. O nucleossomo é formado por duas moléculas de cada tipo de histona, ricas em aminoácidos – lisina e arginina - carregados positivamente, o que favorece a associação com o DNA que tem carga negativa. São 4 tipos H2A, H2B, H3 e H4 unidas, que são enoveladas por uma fita de DNA com cerca de 200 nucleotídeos. Essa fita dá duas voltas incompletas em torna das 8 proteínas (octâmero de histonas) e forma os nucleossomos. Existe a H1 que são importantes para selar essas voltas do DNA nas histonas. Como o DNA possui uma grande quantidade de informações codificadas e as células precisam adquiri- las sempre que necessário, nas células eucarióticas a cromatina sofre modificações em sua estrutura objetivando expor determinadas regiões do DNA e, consequentemente, permitir o acesso de proteínas específicas envolvidas na expressão gênica, no reparo e replicação da molécula de DNA. A alteração da compactação da cromatina resulta em um efeito importante na estrutura dos Figura 8. A cromatina cromossomos interfásicos. Nesses cromossomos, a cromatina não está uniformemente compactada e encontra-se, desse modo, na forma condensada e na forma mais estendida. A forma mais altamente condensada da cromatina interfásica é denominada heterocromatina e é caracterizada pelo DNA que está permanentemente nessa compactação não conter genes. Os genes que acidentalmente são compactados em heterocromatina em geral não podem ser expressos. O exemplo mais importante da heterocromatina para manter os genes inibidos é a inativação do X. O restante da cromatina interfásica 11 é denominada eucromatina, essa região contêm os genes que são expressos e estão na forma mais relaxada ou estendida. A heterocromatina é a parte da cromatina condensada. São regiões de sequências de bases não codificantes, portanto, inativos. Podem ser de dois tipos: Heterocromatina constitutiva, que nunca se expressa como proteínas e que se encontra localizada à volta do centrómero, que contém geralmente sequências repetitivas; Heterocromatina facultativa, que, por vezes, é transcrita em outros tipos celulares, consequentemente a sua quantidade varia dependendo da atividade transcricional da célula. Apresenta condensada na interfase. Já a eucromatina, é constituída por regiões nas quais a cromatina encontra-se Figura10. Identificação da Heterocromatina (Vermelho) e Eucromatina (Azul) desespiralada na Interfase. Nestas áreas, os nucleossomas afastam-se uns dos outros, expondo os genes que podem, assim, "trabalhar" normalmente sem interrupções, isto é, ser transcritos. Na divisão celular, as regiões de eucromatina também se condensam, juntamente com a heterocromatina dando um aspecto uniforme, de bastões cromossómicos à cromatina como um todo. Determinados tipos da estrutura da cromatina podem ser passadas de uma célula para sua descendente. A capacidade de herdar a estrutura da cromatina ajuda as células eucarióticas a “lembrar” se o gene estava ativo na célula parental e assim, parece ser um processo fundamental na manutenção e no estabelecimento de diversos tipos celulares, tecidos e órgãos durante o crescimento e desenvolvimento de um organismo multicelular complexo. Esse tipo de herança na qual não envolve a passagem de sequências de DNA específicas de uma geração celular para outra caracteriza o que é conhecido como herança epigenética. Figura10. Modelo de compactação da cromatina REPLICAÇÃO DO DNA D N A P O L I M E R A S E - O R I G E M D A R E P L I C A Ç Ã O - R E P L I C A Ç Ã O D E P R O C A R I O T O S - R E P L I C A Ç Ã O D E E U C A R I O T O S - R E P A R O D O D N A 12 O processo biológico da reprodução requer a transmissão fiel da informação genética dos pais para os filhos. Portanto, a replicação do DNA genômico é essencial para a existência de todas as células e organismos. Todas as células, em algum momento terão que se dividir, algumas fazem a vida toda, outras, param em algum momento. Toda vez que se precise dar origem a células-filhas, o material genético terá que ser duplicado para que todas informações sejam passadas. Todo o seu genoma é duplicado, sendo necessária uma maquinaria enzimática para copiar grandes moléculas de DNA que constituem os cromossomos de procariotos e eucariotos. existirá outro mecanismo para tentar reparar. A ação de agentes ambientais também pode ser reparada, como por exemplo, danos por radiação. Anormalidades neste processo de reparo podem ter consequências desastrosas como o desenvolvimento do câncer. Inicialmente, vejamos as fases que compõem o ciclo celular. A interfase, que ocorre entre duas divisões celulares, é dividida em 3 intervalos: G1, G2 e S. Nas fases G1 e G2, a atividade metabólica da célula é bastante grande e em S essa atividade fica mais voltada à replicação do DNA. Posteriormente, a interfase progride para a fase de divisão celular. Nesse momento, os cromossomos duplicados na fase S serão separados para as duas células filhas. Figura11. Replicação do DNA Figura 12. A dupla-hélice atua como molde para sua própria duplicação Essa duplicação ocorre na fase S do ciclo, sendo uma fase controlada, fiel e bastante rigorosa onde existe uma série de processos, aos quais, as enzimas funcionam para diminuir ao máximo o erro e que este erro não seja passado a diante. Havendo erro durante a replicação do DNA Ao contrário da ideia que muitos livros trazem, que o DNA é autorreplicativo, a replicação do DNA depende de várias enzimas, como é o caso das polimerases. Essas DNA polimerases são muito importantes para catalisar a adição dos nucleotídeos na formação da molécula do DNA. 13 A replicação é um processo semiconservativo, no qual cada fita parental serve de molde para síntese de uma nova fita-filha, ou seja, temos duas fitas antiparalelas onde uma fita é complementar a outra e cada uma serve como molde para duas fitas novas, o que quer dizer que, as duas moléculas de DNA restantes terão sempre uma fita antiga e outra nova. A enzima central envolvida nesse processo é a DNA polimerase, que catalisa a junção de desoxirribonucleosídeos 5‟ – trifosfatados (dNTPs) para formar a cadeia crescente de DNA. Outras proteínas estão envolvidas e mecanismos de correção de erros são necessários para garantir que a exatidão da replicação seja compatível com a baixa frequência de erros exigida para reprodução celular. A DNA polimerase foi inicialmente identificada em lisados de E. coli, em 1956. Esta enzima possui a capacidade de copiar um molde de DNA e seu isolamento marcou a biologia molecular. Porém, esta primeira DNA polimerase identificada (DNA polimerase I) não é a principal enzima responsável pela duplicação em E. coli. Hoje se sabe que existem vários tipos de DNA polimerases, que desempenham diferentes papeis na replicação e reparo do DNA. Como dito anteriormente, o isolamento da DNA polimerase I foi extremamente importante para a biologia molecular e celular. Isso foi feito a partir do cultivo de E. coli, onde trataram com um mutagênico e isolaram uma linhagem deficiente em polimerase I. Percebendo que as bactérias deficientes em polimerase I continuavam se multiplicando, mas eram sensíveis a radiação UV. Isto levou à conclusão que a polimerase I não era essencial para replicação, mas estava envolvida com mecanismos de reparo de danos no DNA. Outros experimentos viram que existiam mais de uma polimerase (DNA polimerase II – reparo do DNA e III – enzima replicativa) e viram Figura 13. DNA polimerase porque os isolados deficientes em polimerase I continuavam se replicando. Atualmente se sabe que 14 1. Em procariontes, existem cinco ADN-polimerases. A primeira, descoberta por Kornberg, é nomeada ADN-polimerase I, ou pol I. As demais são nomeadas pol II, pol III, pol IV e pol V. 2. Existem aproximadamente 20 tipos de ADN-polimerases em células de mamíferos distribuídos em quatro famílias: A, B, X e Y. além da polimerase III a polimerase I também é necessária para replicação de E. coli. Portanto a replicação do DNA em E. coli envolve duas polimerases distintas. As células eucarióticas contêm cinco DNA polimerases (alpha - α, beta - β, gama - γ, delta - δ e épsilon - ε). A polimerase gama está localizada na mitocôndria e é responsável pela replicação do DNA mitocondrial. As outras estão no núcleo e estão envolvidas na replicação nuclear. As polimerases alpha, delta e épsilon apresentam maior atividade em células em divisão, o que sugere um envolvimento na replicação. Já a beta é ativa tanto em células em divisão quanto naquelas que não estão o que é consistente com a sua função no reparo de danos no DNA. O papel da épsilon ainda permanece confuso, embora essa enzima provavelmente funcione de maneira semelhante à polimerase delta que é suficiente para replicação na ausência da épsilon tanto em sistemas livres de células quanto em leveduras. Quanto à propriedade, todas as polimerases sintetizam DNA na direção 5‟ 3‟, adicionando um dNTP no grupamento 3‟ hidroxil da cadeia nascente. As DNA polimerases só podem adicionar um novo desoxirribonucleotídeo a uma fita de DNA (primer) que esteja ligado por pontes de hidrogênio a uma fita-molde complementar, que fazem síntese da fita a partir de um pedaço já pronto, enquanto outra enzima polimeriza esses pequenos fragmentos– primer, ribonucleotídeos, adicionando nucleotídeos complementares, todas as DNA polimerases precisam de um modelo para ir inserindo e pareando. Assim, diferem das RNA polimerases em que iniciam a síntese de uma nova fita de RNA sem necessitar de um primer. Esta propriedade parece ser essencial para manutenção da alta fidelidade de replicação do DNA. 15 Existem várias origens em todo o genoma e elas são ativadas simultaneamente, assim, a replicação tem início nesses pontos específicos do DNA, além disso, a variedade de origens possibilita a rapidez da replicação nos eucariotos. Tanto em procariotos quanto em eucariotos, a replicação começa em uma sequência chamada de origem de replicação (ORC). Este lugar é específico para as proteínas que iniciam o processo de replicação. A etapa essencial desse processo é a ligação de uma proteína iniciadora em sequências específicas de DNA na origem de replicação, onde essa proteína iniciadora começa desenrolando as fitas e recruta outras proteínas envolvidas na síntese de DNA. A helicase e a proteína SBB, então, atuam dando continuidade ao desenrolar a dupla fita e a exposição da fita-molde, e as primases iniciam a síntese das fitas contínuas. Assim, duas forquilhas de replicação são formadas e movem-se em direções opostas. Em genomas bacterianos ou virais existe uma única origem, porém em genomas maiores existem várias origens de replicação. A velocidade da replicação em procariotos é muito mais rápida do que em eucariotos, porém, apesar disso, os genomas de mamíferos são replicados em poucas horas devido às milhares de origens de replicação. Figura 14. Forquilha de replicação Os procariotos possuem somente uma origem. Nesses organismos, a replicação começa numa região chamada de Ori ou Ori C, que são regiões ricas em adenina e timina com são ligações mais fracas, nestas regiões os pares de bases variam de 100 a 245 pares. Nessa região uma proteína 16 iniciadora vai se ligar para começar o processo de replicação, iniciando o processo de desenrolamento das fitas e recrutando outras proteínas que estão envolvias no processo de síntese de DNA. A primeira delas é a helicase que vai quebrar as ligações ponte de hidrogênio entre as bases. Depois da separação das fitas a proteína primase irá sintetizar os primers de RNA, que são uma sequência de 15 a 20 nucleotídeos que vão servir para ancorar a proteína DNA polimerase. Estas vão replicar as fitas do DNA em direções opostas. Assim, formam-se duas forquilhas de replicação. Nos eucariotos a replicação inicia em várias origens de replicação (Ori ou OriC) em um mesmo cromossomo, essa replicação é rápida, mas como o DNA do eucarioto é bem maior do que o do procarioto ela vai demorar horas para se completar. Aqui são ativadas, proteínas iniciadoras se ligam ao DNA, abrindo as duas fitas para formar a forquilha (duas, de cima e de baixo) de replicação bidirecional e simultânea. Quando o sentido é 5‟ 3 „é de forma contínua, no outro sentido a polimerase vai para trás e corre, mas sempre no sentido 5‟ 3 „. Para síntese da fita continua só é necessário 1 primer, para a descontinua necessita de vários primers, além disso, as origens de replicação são espaçadas por intervalos de 50 a 300 Kb indicando mais ou menos 30000 origens de replicação no genoma humano. Parece que as sequências que definem as origens de replicação variam amplamente entre os eucariotos, embora o papel das proteínas do ORC, como iniciadoras da replicação, seja altamenteconservado. Figura 15. Processo de replicação 17 A replicação do DNA em células procarióticas tem início na forquilha de replicação, onde o DNA de ambas as novas fitas-filhas é sintetizado por um complexo multienzimático, que contém a DNA polimerase. Devido a orientação antiparalela das duas fitas de DNA na dupla-hélice, este mecanismo requer que uma d as fitas cresça na direção 5 ' - 3 ' e outra na direção 3 ' - 5'. Porém, nenhuma DNA polimerase atua na direção 3' - 5'. Para isso, há os fragmentos de Okazaki, transitório segmento de DNA na forquilha de replicação que são sintetizados somente na direção 5 ' - 3' da cadeia, juntando- se após a sua síntese para forma cadeias longas de DNA, pela mesma enzima DNAligase que une as aberturas formadas durante a reparação do DNA. A forquilha de replicação tem uma estrutura assimétrica. A fita-filha de DNA, continuamente sintetizada, é conhecida como fita líder e a sua síntese precede, ligeiramente, à síntese da fita-filha sintetizada descontinuamente e conhecida com fita retardada. A síntese da fita retardada é atrasada porque ela deve esperar que a fita líder exponha a fita molde, onde o fragmento de Okazaki é sintetizado. A síntese da fita retardada, por meio de um mecanismo descontínuo, significa que somente uma DNA polimerase do tipo 5' - 3' é necessária para a replicação do DNA. Proteínas adicionais são necessárias para ajudar na separação da dupla-helice, possibilitando a exposição da fita molde para que esta possa se r copiada pela DNA polimerase. A DNA helicase são proteínas que hidrolisam ATP, quando ligadas à DNA fita simples, utilizando este princípio para se deslocarem rapidamente ao longo de uma molécula de DNA fita simples, onde a enzima encontra uma região de dupla -hélice, procede o deslocamento ao longo da fita, e abre a hélice como uma alavanca (quebrando sua s pontes de hidro gênio). As proteínas ligadoras de DNA fita simples (proteínas deslizadoras da hélice) ligam-se às fitas expostas de DNA sem cobrir suas bases, permitindo que estas fitas fiquem disponíveis para servirem como moldes, e assim, estabilizam a conformação desenrolada da fita simples. Ainda, esta ligação cooperativa cobre completamente as regiões de DNA fita si mples, prevenindo a formação de pequenas hélices a partir dos grampos, que, se formadas, impediriam a síntese pela DNA polimerase. Assim, entra "em ação" o iniciador. Para a fita líder, faz-se necessário apenas no início da replicação; uma vez que a forquilha de replicação seja estabelecida, uma extremidade pareada da 18 cadeia será continuamente oferecida para que o DNA polimerase adicione novos nucleotídeos. Porém, um mecanismos especial se faz necessário para produzir a fita iniciadora pareada na fita retardada. O mecanismo envolve a DNA primase (ou RNA primer), que utiliza de ribonucleosídeos trifosfato para a síntese de cadeias curtas de RNA iniciadores. Esses iniciadores são feitos espaçadamente na fita retardada, onde são alongados pela DNA polimerase para iniciar o fragmento de Okazaki, que termina quando esta enzima desliza até o RNA iniciador preso na extremidade 5' do fragmento anterior. Para se produzir uma cadeia continua de DNA, a partir d e muitos fragmentos de D NA feitos na fita retardada, um sistema especial de reparação atua rapidamente p ara de gradar o RNA iniciador mais antigo e substituí-lo por DNA. Então, a DNA ligase e a extremidade 3' do novo fragmento de DNA à extremidade 5' do fragmento anterior, para completar o processo. A DNA polimerase tem tendência de se dissociar da molécula de DNA. Isso permite sua reciclagem após sintetizar um fragmento de Okazaki e iniciar um outro. Porém, dificultaria, para a polimerase, a síntese de fitas longas de DNA. Assim, há ajuda de uma proteína acessória que funciona como uma cinta regulada. Denominada de anel deslizante, mantém a polimerase firmemente ligada ao DNA, quando está em movimento, liberando-a assim que ela para. Um suporte giratório é formado na hélice de DNA por proteínas conhecida como DNA topoisomerases, impedindo que o DNA se emaranhe durante a replicação, quebrando a ponte fosfodiéster da fita de DNA, e ligando-a novamente. Figura 16. Processo de replicação 19 Os mecanismos básicos de replicação do DNA, incluindo tanto a geometria da forquilha de replicação quanto os componentes proteicos do aparato de replicação, são similares em procariotos e eucariotos. A principal diferença é que o DNA eucariótico é replicado não como um DNA nu, mas como uma cromatina (descondensada) onde o DNA é complexado a proteínas firmemente ligadas, denominadas histonas. As histonas formas estruturas em forma de disco em torno das quais o DNA é enrolado, criando uma unidade estrutural repetitiva denominada nucleossomo. Os nucleossomos são espaçados a intervalos de aproximadamente 200 pares de bases ao longo do DNA, o que talvez explique porque os novos fragmentos de Okazaki são sintetizados na fita retardada a intervalos de 100 a 200 nucleotídeos, como em bactérias. Os nucleossomos podem também atuar como barreiras que diminuem o movimento das moléculas de DNA polimerase, o que explicaria o deslocamento das forquilhas de replicação eucarióticas se apenas um décimo mais acelerado do que as forquilhas de replicação bacterianas. Figura 17. Telomerase A cromatina altamente condensada replica mais tarde, enquanto genes na cromatina ativa (eucromatina) replicam mais cedo. Regiões diferente de um mesmo cromossomo replicam em momentos distintos. Os telômeros são sequências de DNA especiais, presentes nas extremidades dos cromossomos eucarióticos. Essas sequências consistem de muitas repetições em tandem de uma sequência curta, que contém u bloco de nucleotídeos G adjacentes. Sua função é manter a estabilidade estrutural do cromossomo. Durante a replicação, essas extremidades são alongadas por uma telomerase, permitindo que a polimerase da nova fita de DNA seja completada. Ela reconhece a fita rica em G de uma sequência repetida telomérica, alongando-a na direção 5 ' - 3'. Ela sintetiza uma nova cópia de repetição, uti lizando um molde de RNA, que é um componente próprio da enzima. Assim, a replicação da extremidade do cromossomo pode ser completada pela DNA polimerase. Após o fim da replicação, essa extremidade alongada é retirada. 20 A exatidão da replicação do DNA é essencial para a reprodução celular, sendo que estimativas para frequências de mutações de diferentes genes indicam que os erros durante a replicação correspondem a somente uma única base incorreta a cada 10 à nona ou 10 à décima nucleotídeos incorporados. A DNA polimerase aumenta a fidelidade de replicação e se dá pela seleção da base correta para inserir na fita sendo sintetizada. Ela não catalisa simplesmente a incorporação de qualquer nucleotídeo que esteja pareado por pontes de hidrogênio. Ao invés disto, ela evita ativamente a incorporação de uma base mal pareada pela adaptação à conformação da base correta. Estudos dizem que a ligação correta de dNTPs induz mudança conformacional na polimerase o que leva a incorporação deste nucleotídeo ao DNA. Isto aumenta a exatidão da replicação em 1000 vezes, reduzindo a frequência de erros. Outro mecanismo é a correção de erros feita pela DNA polimerase. A exonuclease 3‟5‟ atua na correção dos erros que porventura ocorram na fita recém-sintetizada. Portanto, quando uma base incorreta é incorporada ela será preferencialmente removida pela atividade da exonuclease 3‟5‟, a qual requer um primer unido por pontes de hidrogênio à fita-molde para que a síntese continue, em vez de ser usada para continuar a síntese (aumenta a exatidão da replicação em 100 a 1000 vezes). A atividade de correção de erros da DNA polimerase combinada com a habilidade em evitar a introdução de bases incorreta é suficiente para reduzir 8 à frequênciade erros na replicação em 10 à nona. Portanto, há uma seleção dos nucleotídeos, uma revisão se eles foram colocados errado, e, se ainda houver erro, as enzimas que atuam no mau pareamento trocam esse que foi colocado errado por outro certo. A importância do mecanismo de correção de erros pode explicar o fato de que as DNAS polimerases exigirem a presença de um primer e catalisarem somente na direção 5‟3‟. Quando o DNA é sintetizado na direção 5‟3‟ a energia necessária para a polimerização deriva da hidrólise do grupo 5‟-trifosfato de um dNTP livre e ele é adicionado a um grupo 3‟ OH da cadeia nascente. Se a DNA fosse sintetizado na direção 3‟5‟ a energia da polimerização deveria ser derivada da hidrólise de um grupo 5‟-trisfosfato do nucleotídeo terminal já incorporado ao DNA. Com isso, ficaria eliminada a possibilidade da edição de erros, já que a remoção do nucleotídeo erroneamente pareado também removeria o grupo 5‟ trifosfato necessário como fonte de energia para extensão da cadeia. EXPRESSÃO GÊNICA T R A N S C R I Ç Ã O - T R A N S C R I Ç Ã O E M P R O C A R I O T O S - T R A N S C R I Ç Ã O E M E U C A R I O T O S - T R A D U Ç Ã O - P R O C E S S O D E T R A D U Ç Ã O 35 Muitos genes fornecem instruções para a produção de polipeptídeos. Como exatamente o DNA direciona a construção de um polipeptídeo? Esse processo envolve dois passos principais: a transcrição e a tradução. Na transcrição, a sequência de DNA de um gene é copiada para fazer uma molécula de RNA. Essa etapa é chamada de transcrição pois envolve reescrever, ou transcrever, a sequência de DNA num "alfabeto" similar de RNA. Nos eucariontes, a molécula de RNA deve passar por um processamento para se tornar um RNA mensageiro (RNAm) maduro. Na tradução, a sequência de RNAm é decodificada para determinar a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. O nome tradução significa que a sequência do RNAm precisa ser traduzida numa "linguagem" de aminoácidos completamente diferente. Figura 18. Dogma central Assim, durante a expressão de um gene codificante de proteína, a informação flui do DNA > RNA > proteína. Esse fluxo direcional de informação é conhecido como o dogma central da biologia molecular. Genes não codificantes de proteína, ou seja, genes que especificam RNAs funcionais, ainda são transcritos para produzir um RNA, mas esse RNA não é traduzido em um polipeptídeo. Tanto para um quanto para outro tipo de gene, o processo de ir de um DNA para um produto funcional é conhecido como expressão gênica. 36 O DNA genômico não direciona a síntese proteica diretamente, mas utiliza o RNA como uma molécula intermediária. Quando a célula necessita de uma proteína específica, a sequência de nucleotídeos da região apropriada de uma molécula de DNA em um cromossomo é inicialmente copiada na forma de RNA, o que corresponde à transcrição. Já as cópias de RNA a partir do segmento de DNA são usadas diretamente como moldes para direcionar a síntese proteica, denominada de tradução. O primeiro passo da célula para ler a informação necessária a partir de suas instruções genéticas é a cópia de uma parcela específica da sequência de nucleotídeos de um gene (DNA) sob a forma de uma sequência de nucleotídeos de RNA. Há diferenças químicas entre a informação na forma de RNA e DNA, mas a linguagem de ambos é a mesma. Figura 19. Transcrição O RNA é um polímero linear composto por 4 tipos diferentes de subunidades nucleotídicas unidas entre si por ligações fosfodiéster. A diferença química entre o RNA e o DNA são: 1. Os nucleotídeos do RNA são ribonucleotídeos (contém o açúcar ribose em vez de desoxirribose); 2. O RNA contém as bases adenina(A), guanina(G), citosina(C) e uracila(U), ao invés de timina(T). 3. As propriedades de complementaridade por pareamento de bases descritas para o DNA também se aplicam para o RNA (G-C, A-U). E, apesar da diferença química ser pequena, a diferença estrutural entre o DNA e o RNA é muito grande. O DNA sempre se encontra nas células sob a forma de uma hélice de fita dupla e longa, já o RNA se apresenta como fita simples e curta. Essa conformação do RNA lhe confere liberdade de dobrar- se sob diversas formas. Sendo assim, essa capacidade forma estruturas tridimensionais complexas que serão responsáveis por funções estruturais e catalíticas. Além disso, vale ressaltar, que as células produzem diversos tipos de RNA: O RNA- mensageiro (mRNA): moléculas que são copiadas a partir dos genes (DNA) e que definem a síntese de proteínas; O RNA-nuclear (snRNA): pequenos RNAs que direcionam o splicing (excisão de íntrons) do 37 pré-RNA para formar o mRNA; O RNAribossomal (rRNA): forma o cerne dos ribossomos e catalisam a síntese proteica; O RNA-transportador (tRNA): formam os adaptadores que selecionam aminoácidos e os colocam no local adequado nos ribossomos para serem incorporados em proteínas; O RNA- citoplasmatico (scRNA): participa do transporte intracelular de proteínas; E, por fim, o RNA-de interferência (siRNA): participa na regulação da expressão gênica. A principal enzima responsável pela síntese do RNA é a RNA-polimerase. Esta, é uma enzima complexa composta de múltiplas cadeias polipeptídicas. A enzima completa da E. coli é composta pelas subunidades: α, β, β’, ω e σ, onde, a subunidade σ está ligada de forma relativamente fraca e pode dissociar-se das demais subunidades e essa subunidade não é necessária para a atividade básica catalítica da enzima. As enzimas que realizam a transcrição são as RNA-polimerases. Essas enzimas catalisam a formação de ligações fosfodiéster que conectam os nucleotídeos entre si. A RNA-polimerase move-se sobre o DNA desespiralizando a dupla-hélice expondo novas regiões para o pareamento de bases por complementaridade. A cadeia de RNA é estendida em um nucleotídeo por vez na direção 5’-3’. A medida que o RNA está sendo sintetizado, sua liberação é quase imediata da fita de DNA, fazendo com que muitas cópias de RNA possam ser produzidas a partir de um mesmo gene em um período de tempo pequeno. A sequência de DNA na qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição de um gene é chamada de promotor, onde a subunidade σ liga-se especificamente a sequências presentes tanto na região promotora -35 quanto na região -10. Figura 20. Região promotora e o início da transcrição em procariotos Durante o alongamento, a polimerase permanece associada com o seu molde enquanto continua a síntese de RNAs. À medida que se move, a polimerase desenrola o DNA-molde à sua frente e o enrola novamente após a sua passagem. A síntese de RNA prossegue até que a polimerase encontre um sinal de terminação, ponto no qual a transcrição para, o RNA é liberado da enzima que se dissocia do molde do DNA. 38 A transcrição em procariotos se inicia com a associação de um fator sigma que se associa à RNA-polimerase, formando a holoenzima RNA-polimerase. Esse complexo enzimático se adere fracamente ao DNA bacteriano até chegar a uma região denominada de promotor (sequência especial de nucleotídeos indicando o ponto inicial para a síntese de RNA), na qual a RNA-polimerase adere-se fortemente ao DNA. Quem reconhece o sítio de iniciação é o fator sigma. Após a RNA-polimerase aderir-se firmemente ao DNA, ela abre a dupla-hélice para expor uma pequena quantidade de nucleotídeos em cada fita e uma das fitas serve de molde para o início da transcrição. Alguns nucleotídeos são adicionados e após cerca de 10 nucleotídeos de RNA serem sintetizados, a enzima quebra as interações com o promotor e o fator sigma é liberado. A partir desse momento, a RNA- polimerase desliza sobre o DNA e vai sintetizando RNA e, quando se depara com o terminador (segundo sinal), a polimerase para e libera tanto a cadeia molde de DNA quanto a cadeia de RNA sintetizada. Em bactérias, moléculasde RNA são sintetizadas por um único tipo de RNA-polimerase. Além disso, tanto a polimerase quanto o fator sigma são recicláveis e podem se associar novamente para começar outro processo de transcrição. O sinal de terminação consiste de uma fita de pares de nucleotídeos A-T, precedida por uma sequência de DNA duplamente simétrica, a qual, quando transcrita em Figura 21. Transcrição em procariotos RNA, dobra-se em uma estrutura de grampo de cabelo. Essa conformação auxilia a empurrar o sítio ativo da RNA-polimerase, impedindo a síntese do RNA e fazendo com que essa enzima se desligue do DNA. A escolha da fita molde depende da direção da enzima RNA-polimerase. No caso dessa figura, como a RNA-polimerase está indo para a esquerda, a fita molde é a de cima e na figura abaixo, como a RNA-polimerase está indo para a direita, a fita molde é a de baixo. 39 A transcrição em eucariotos é mais complexa e pode ser realizada a partir de 3 enzimas diferentes: a RNA-polimerase I, RNA-polimerase II e RNA-polimerase III. As 3 são estruturalmente similares mas transcrevem diferentes tipos de genes. As RNA-polimerases I e III transcrevem os genes que codificam o tRNA, rRNA e vários pequenos RNAs. A RNA-polimerase II transcreve a grande maioria dos genes, inclusive todos aqueles que codificam proteínas. Para que a RNA-polimerase procariótica funcione transcrevendo o DNA, ela necessita apenas do fator sigma, no entanto a RNA-polimerase eucariótica requer diversas proteínas adicionais, que coletivamente são denominadas de fatores gerais de transcrição. Além dessa diferença, a iniciação da transcrição eucariótica precisa lidar com o DNA empacotado em nucleossomos e sob outras formas de estruturação da cromatina, características ausentes dos cromossomos bacterianos. Os fatores gerais de transcrição ajudam a posicionar a RNA- polimerase eucariótica corretamente sobre o promotor, auxiliam na separação das duas fitas de DNA para permitir que a transcrição se inicie e liberam a RNA-polimerase do promotor para deslizar sobre a fita de DNA. Assim, a transcrição em eucariotos se dá, quando o fator de transcrição TFIID, a partir da sua subunidade TBP, reconhece e se liga ao promotor (que contém uma sequência de DNA denominada de TATA box) e que está localizado a 25 nucleotídeos do início da transcrição. Essa ligação provoca uma mudança conformacional na molécula de DNA que faz com que Figura 22. Transcrição em eucariotos outros fatores gerais de transcrição se associem no promotor, inclusive a RNA-polimerase II. Um fator importante que se liga posteriormente é o TFIIH que contém uma DNA-helicase que hidrolisa o ATP e permite que a fita dupla se desespiralize e também contém uma cinase, que fosforila a cauda da RNA- polimerase II para que ela seja liberada dos fatores gerais de transcrição e possa deslizar na fita molde de DNA. A RNA-polimerase II sofre diversas mudanças na configuração nesse processo que auxiliam no fortalecimento da sua interação com o DNA e adquire novas proteínas que lhe permitem transcrever por longas distâncias sem se dissociar do DNA. 40 Nas células eucarióticas, a molécula de RNA produzida por transcrição contém tanto sequências codificantes (éxons) e não-codificantes (íntrons). Antes da molécula de RNA ser traduzida em proteína, as duas extremidades do RNA são modificadas, os íntrons são removidos por reação de RNA splicing catalisada enzimaticamente e o mRNA resultante é exportado para o citoplasma (onde será traduzido). O splicing pode ser simultâneo à transcrição do RNA. Já nos procariotos, a extremidade 5’ do mRNA é produzida a partir da iniciação da transcrição e a extremidade 3’ é produzida a partir da terminação da transcrição. Como as células procarióticas não contém núcleo, a transcrição e tradução ocorrem no mesmo lugar. O Splicing é o processo durante o qual os íntrons são removidos e os éxons são unidos. Extremidade 5’ do íntron é identificada e clivada, se liga a uma adenina próxima a extremidade final do íntron, formando um laço chamado spliceossomo. Os exons então são unidos e os íntrons são degradados no núcleo. O spliceossomo é o laço de RNA possibilitado por ribonucleoproteínas (ribossomo + proteinas). Temos assim, o Splicing alternativo, que ocorre de acordo com o tipo celular, permite que os exons sejam unidos de maneiras distintas, formando diferentes RNAm a partir do mesmo transcrito primário. Possibilita aumento da diversidade de proteínas, sem aumentar o tamanho do genoma. O RNAm dos eucariotos é monocistrônico (produz uma proteína) e o pré-RNAm é policistrônico (produz várias proteinas). Figura 23. Splicing 41 Tradução é o nome utilizado para designar o processo de síntese de proteínas. É um processo biológico no qual a sequência nucleotídica de uma molécula de mRNA (RNA mensageiro) é utilizada para ordenar e servir como molde para a síntese de uma cadeia polipeptídica com sequência de aminoácidos que determina uma proteína. Ocorre no citoplasma. As proteínas são os efetores da maioria dos processos celulares, executando uma grande quantidade de tarefas que são dirigidas pela informação codificada no DNA genômico. A tradução é a etapa final da expressão gênica. Após a tradução do DNAm a cadeia polipeptídica dobra-se na conformação tridimensional e sofre várias etapas de processamento até chegar a sua forma ativa. Todos os RNAs mensageiros são lidos na direção de 5’ para 3’ e as cadeias polipeptídicas são sintetizadas da extremidade amina para a carboxila terminal. A tradução é realizada nos ribossomos com os RNAs transportadores servindo como adaptadores entre o molde de RNAm e os aminoácidos que estão sendo incorporados a proteína. Envolve interações com RNAm, RNAr, RNAt e proteínas necessárias para tradução. Existem quatro diferentes nucleotídeos no mRNA, Guanina, Citosina, Uracila e Adenina, e 20 tipos distintos de aminoácidos em uma proteína, logo não se pode dizer que há uma correspondência direta entre um nucleotídeo no RNA e um aminoácido na proteína. De um modo geral e bem simples, a sequência de nucleotídeos de um gene é traduzida pelo mRNA em uma sequência de aminoácidos de uma proteína a partir do código genético. Essa sequência que é traduzida em uma molécula de mRNA é lida em grupos de três, os códons. O RNA é um polímero linear com 4 diferentes nucleotídeos, logo existem 4x4x4=64 combinações diferentes de códons. Lembrando que mesmo havendo 64 possibilidades de códons, só existem 20 aminoácidos diferentes Figura 24. Código Genético encontrados nas proteínas, sendo assim cada códon especifica um aminoácido. 42 Esse código genético é utilizado universalmente em todos os organismos, mesmo que hajam diferenças, eles se localizam principalmente no DNA das mitocôndrias. Lembrando que, nas mitocôndrias existem sistemas próprios de transcrição e síntese de proteínas. Os códons são sempre escritos com o nucleotídeo 5’ à esquerda. Uma sequência de RNA pode ser traduzida em qualquer uma das três fases de leitura, dependendo onde vai iniciar o processo de decodificação. Recapitulando, cada aminoácido é especificado por 3 bases nitrogenadas que é igual a um Códon no RNAm, por exemplo as bases Uracila, citosina e uracila unidas nessa ordem formam um códon UCU que corresponde ao aminoácido serina, a união de uma sequência de aminoácidos formará uma proteína. Assim, delimita-se as etapas da tradução. Início: Códon de iniciação - AUG Alongamento Término: Stopcodons - UAA, UAG, UGA Figura 25. Etapas da tradução Figura 26. Códon de iniciação e Códons de parada 43 Na célula a tradução é processada em estruturas chamadas de ribossomos, que posicionam corretamente tRNAs com mRNAs e catalisam as ligações peptídicas entre aminoácidos para a síntese de proteínas. Os ribossomos são compostospor duas subunidades e agem de maneira a percorrer a totalidade da cadeia de mRNA. O papel do RNA transportador nesse processo seria o de conectar os códons do mRNA com os devidos aminoácidos espalhados pelo citoplasma. Ao efetuar tal processo, o ribossomo fará a ligação peptídica entre os códons trazidos Figura 27. Unidades ribossomais pelo RNA transportador, gerando a fita protéica. Assim, o RNA ribossômico associando-se a proteínas interagem formando o ribossomo propriamente dito. As fitas de RNAr formarão os ribossomos, orgânulos responsáveis pela leitura da mensagem contida no mRNA. Figura 28. Montagem das unidades ribossomais Sumariamente, o processo de tradução é realizado da seguinte maneira: ao combinar-se com os ribossomos, o RNAm tem sua seqüência de códons lida, e para cada codon o respectivo tRNA é atraído até os ribossomos, e pela complementariedade de bases é feita a ligação entre o codon (do mRNA) e o anticodon (do RNAt), liberando o aminoácido carregado pelo tRNA que é então ligado à 44 cadeia crescente do polipeptideo. Moléculas de RNA transportador (=transfer RNA) agem como adaptadores entre a seqüência codificante dos nucleotídeos do mRNA e o aminoácido que é codificado. Uma ponta dessa molécula carrega o aminoácido e uma outra ponta consiste de uma seqüência de três nucleotídeos conhecida como anticódon. A síntese da proteína é encerrada quando os ribossomos encontram um códon de parada no mRNA. Os processos de transcrição e tradução dos procariotos e eucariotos apresentam diferenças entre si. Dentre essas diferenças há duas principais: A primeira é que em procariotos o processo de tradução de um mRNA inicia-se antes que a transcrição do mesmo tenha se encerrado, o que quer dizer que, a transcrição e a tradução ocorrem concomitantemente. Já nos eucariotos, a tradução é iniciada somente após a finalização da transcrição, e nesse caso o mRNA sai do núcleo para o citoplasma onde é realizada a tradução. A segunda diferença é que nos eucariotos o mRNA sofre modificações antes de ser traduzido. O produto da transcrição (o mRNA), chamado de transcrito primário, sofre mudanças e somente após estas mudanças este mRNA agora “maduro” pode ser transportado do núcleo da célula para o citoplasma onde ocorrerá o processo de tradução. Uma mudança importante sofrida pelo mRNA antes de sair do núcleo é a retirada dos íntrons, como já citado na transcrição, a partir do processamento do pré-RNA ou splicing. Além das duas grandes diferenças acima, uma diferença mais peculiar é que em eucariotos, um transcrito contém apenas o produto de um único gene, já em procariotos, um transcrito pode conter mais de um gene pelo fato da grande maioria dos genes de procariotos estarem organizados na forma de opérons. Outra diferença que vale ser citada é que o inicio dá tradução em procariotos se dá a partir do reconhecimento do rRNA da sequência de Shine-Delgarno que antecede o códon de iniciação, enquanto nos eucariotos a unidade ribossomal menor vai se ligar à Cap 5’ até o encontro do códon de inciiação. Figura 29. Início da tradução 45 De um modo geral, durante o processo de tradução, ocorre em primeiro lugar a ligação da molécula de RNA mensageiro ao ribossomo. Em seguida o transporte de aminoácidos até o ribossomo pelas aminoacil-tRNA sintetases, e assim formam-se as ligações peptídicas entre aminoácidos e assim a cadeia polipeptídica vai crescendo. Na presença de um códon de parada, o complexo dissocia-se e a tradução termina. A informação contida na molécula de mRNA, ou seja, a sua sequência de bases, é organizada em códons e o código genético define a atribuição entre códons e aminoácidos, como já definido anteriormente. O mecanismo de tradução pode ser dividido em três passos principais: iniciação, alongamento e terminação. Na iniciação, o primeiro passo é a ligação de iniciador especifico de RNAt metionil e do RNAm à subunidade ribossomal pequena. A subunidade maior se liga ao complexo, formando um ribossomo funcional. Para iniciar a tradução em bactérias, é necessária a participação de vários fatores chamados de fatores de iniciação: IF1, IF2 e IF3 que se liga a subunidade ribossomal 30S. Então o aminoácido, o RNAm e o RNAt N-formilmetionina iniciador se unem ao complexo, com IF2, ligado a GTP, reconhecendo especificamente o RNAt iniciador. O IF3 é liberado, permitindo a associação da subunidade 50S ao complexo, seguido pela hidrolise de GTP ligado ao IF2 liberando de IF1 e Figura 30. Início da tradução em procariotos IF2 ligado a GDP, culminando na formação de um complexo de iniciação 70S. Em eucariotos, são necessários mais do que 3 fatores de iniciação, requer no mínimo 10 proteínas, são designados por eIFs, que quer dizer fatores eucarióticos de iniciação. A tradução inicia com os fatores eIF-1, eIF-1A, eIF-3, eIF-5 ligados a subunidade 40S e o eIF-2, em complexo com GTP, associado com o RNAt metionil iniciador, onde o RNAm reconhecido é levado ao ribossomo pelo grupo eIF4. O cap da extremidade 5’ do mRNA é reconhecido pelo eIF-4E. O fator eIF-4G liga-se ao eIF-4E e a uma proteína PABP (de ligação ao poli-A) associada com a cauda de poli-A na extremidade 3’ do RNAm. Dessa forma, os fatores de iniciação reconhecem tanto a extremidade 5’ como a 3’ dos RNAm 46 e são responsáveis pelo efeito excitatório da poliadenilação na tradução. Os fatores de iniciação eIF- 4E e eIF-4G associado a eIF-4ª e eIF-4B levam o RNAm a subunidade 40S, com eIF-4G interagindo com eIF-3. Subunidade 40S + RNAt metionil e eIFs ligados, percorre o RNAm, até encontrar o primeiro códon de iniciação AUG, onde o eIF-5 desencadeia a hidrolise de GTP ligado ao eIF-2. Posteriormente fatores de iniciação liberados, e a unidade 60S une-se à 40S, resultando no complexo de iniciação de células eucariótica. Figura 31. Início da tradução em eucariotos A elongação ou alongamento, é o crescimento da cadeia polipeptídica, ajudada por fatores proteicos de alongamento designados por EF-Tu, EF-Ts e EF-G. O ribossomo tem 3 sítios para ligação do RNAt (P-peptidil, A-aminoacil e E-saída). O tRNA metionil iniciador é ligado ao sítio P, seguido de uma Ligação do RNAt aminoacil ao sítio A pelo pareamento do segundo códon do RNAm. E é acompanhado até o ribossomo pelo fator de alongamento (EF-tu em procariotos r eEF-1α em eucariotos) ligado a GTP. A seleção correta do RNAt aminoacil em uma cadeia em crescimento é a etapa crítica que determina a precisão da síntese proteica. A taxa de erro é de, aproximadamente, 0,001 isso se deve também por um centro de decodificação, presente na subunidade pequena, que identifica os pares de bases corretos no códon-anticódon e discrimina os pareamentos incorretos. A inserção correta de um aminoacilRNAt no sitio A desencadeia uma mudança de configuração, que induz a hidrolise de GTP ligado ao EF-tu (eEF-1α) e a liberação do fator de alongamento ligado ao GDP. EF-tu (eEF-1α) deixa o ribossomo, a seguir a ligação peptídica entre RNAt metionil iniciador no sitio P e o segundo RNAt aminoacil no sitio A (reação catalisada pela subunidade grande e participação do RNAr fazendo a identificação do pareamento Figura 32. Etapa de elongação correto entre o códon-anticódon), propiciando a transferência da metionina para o RNAt aminoacil no sitio A e formando um RNAt peptidil nesta posição, e por consequente, o RNAt iniciador é descarregado no sitio P. Ocorre a translocação que necessita de outro fator de alongamento (EF-G procarioto e eEF- 47 2 em eucarioto) acoplado a hidrólise de GTP. Durante a translocação o ribossomo move-se 3 nucleotídeos sobre o RNAm posicionando o próximo códon em um sítio A vazio, onde vai haver a translocação do RNAt peptidil do sítio A para o P, e assim o RNAt descarregado vai do sitio P para o E. A terminação,depende dos códons de terminação que são: UAG, UAA e UGA. Essas trincas não são reconhecidas por um tRNA, mas sim por fatores proteicos chamados de fatores de terminação, que abreviando, se designam de RF -1 (UAA ou UAG) e RF -2 (UAA ou UGA). Em eucariotas, existe um único fator de terminação que reconhece os três códons de parada, UAG, UAA e UGA que é o eRF - 1. Tem também os fatores de liberação RF -3 e eRF -3 que não reconhecem códons de terminação, mas, agem juntamente com o RF -1 (eRF -3) e RF -2. Esses fatores unem -se a códons de terminação no sitio A e estimulam a hidrolise da ligação entre o RNAt e a cadeia polipeptídica no sítio P, seguido da liberação do polipeptídeo completo, e por fim o ribossomo dissocia -se nas subunidades 30S e 50S, libertando o último RNAt e o RNAm molde. Figura 33. Etapa de terminação 48 Antibióticos e Síntese Protéica Inibição da Síntese Proteica, pois precisa matar ou inibir o crescimento da bactéria sem ser toxico para a célula. Por isso os antibióticos que atacam as células eucarióticas não são uteis clinicamente, sendo usados apenas experimentalmente no estudo da síntese proteica. REGULAÇÃO DO CICLO CELULAR R E G U L A Ç Ã O D O C I C L O E C Â N C E R 35 Todas as células passam pelo ciclo celular, mas elas passam rapidamente de uma fase à outra? Se forem células cancerígenas, a resposta é sim. Entretanto, as células normais passam pelo ciclo celular de forma regulada. Elas usam as informações sobre seu próprio estado interno e sinais do ambiente ao seu redor para decidir se continuam com a divisão celular. Esta regulação garante que as células não se dividam sob condições desfavoráveis (por exemplo, quando seu DNA está danificado, ou quando não há espaço para mais células em um tecido ou órgão). O ponto de checagem é um estágio no ciclo celular eucarionte em que a célula examina sinais internos e externos e "decide" se irá continuar ou não a divisão celular. Existem vários de pontos de checagem, mas os três mais importantes são: O ponto de checagem G1, o ponto de checagem G2 e o ponto de checagem do fuso, na transição da metáfase para anáfase. Figura 34. Pontos de checagem O ponto de checagem G1 é o principal ponto de decisão para uma célula – ou seja, o primeiro ponto em que deve-se escolher entre dividir ou não. Uma vez que a célula passa o ponto de checagem G1 e entra na fase S, ela se torna irreversivelmente comprometida com a divisão. Ou seja, excetuando-se problemas inesperados, tais como dano no DNA ou erros de replicação, uma célula que passa pelo ponto de checagem G1 pelo resto do caminho através do ciclo celular e produzirá duas células filhas. Figura 35. O ponto de checagem G1 O ponto de checagem G1 localiza-se ao final da fase G1, antes da transição para a fase S. Se as células não passarem pelo ponto de checagem G1, elas podem "pular fora" do ciclo 36 celular e entrar em um estado de repouso chamado G0, a partir do qual poderão posteriormente entrar novamente em G1 sob condições adequadas. No ponto de checagem G1, as células decidem se vão ou não continuar com a divisão com base em fatores como: Tamanho da célula; Nutrientes; Fatores de crescimento; Danos no DNA No ponto de checagem G1, a célula checa se as condições internas e externas são favoráveis para a divisão. Aqui estão alguns dos fatores que uma célula pode avaliar: Se a célula tem tamanho suficiente para se dividir? Se a célula possui reserva de energia suficiente ou nutrientes disponíveis para se dividir? Se a célula está recebendo sinais positivos (como fatores de crescimento) das suas vizinhas? Ou se há algum DNA danificado? Esses não são os únicos fatores que podem afetar a progressão através do ponto de checagem G1 e quais fatores são mais importantes dependem do tipo da célula. Por exemplo, algumas células também precisam de sinais mecânicos (tais como estarem anexadas a uma rede de suporte chamada matrix extracelular) para se dividir. Se uma célula não obtém os sinais para seguir em frente que ela precisa no ponto de checagem G1, pode sair do ciclo celular e entrar em um estado de repouso chamado fase G_0t. Algumas células permanecem em G0, enquanto outras voltam à divisão se as condiçoẽs melhoram. No ponto de checagem G2, a célula verifica: Danos no DNA e se houve a replicação total do DNA. Para certificar-se de que a divisão celular ocorra bem (para que produza células filhas saudáveis com DNA completo e sem danos), a célula possui um ponto de checagem adicional antes da fase M, chamado de ponto de checagem G2. Nesta fase, a célula irá checar: Se há algum DNA danificado? E se o DNA foi completamente copiado durante a fase S? Se erros ou danos são detectados, a célula irá pausar no ponto de checagem G2 para permitir reparos. Se os mecanismos do ponto de checagem detectam problemas com o DNA, o ciclo celular é interrompido e a célula tenta completar a sua replicação de DNA ou reparar o DNA danificado. Se o dano é irreperável, a célula pode sofrer Figura 36. O ponto de checagem G2 37 apoptose, ou morte celular programada. Este mecanismo de autodestruição assegura que o DNA danificado não é repassado para as células filhas e é importante para prevenir o câncer. No ponto de checagem do fuso, a célula verifica: A ligação entre cromossomos e fuso na placa metafásica. O ponto de checagem M é também conhecido como ponto de checagem do fuso: aqui, a célula examina se todas as cromátides irmãs estão corretamente ligadas aos microtúbulos do fuso. Como a separação das cromátides irmãs durante a anáfase é um passo irreversível, o ciclo não irá continuar até que todos os cromossomos estejam firmemente ligados a pelo menos dois filamentos do fuso em lados opostos da célula. Parece que as células na realidade não Figura 37. O ponto de checagem no fuso examinam a placa metafásica para confirmar que todos os cromossomos estão lá. Ao invés disso, elas procuram por cromossomos "retardatários" que estão no lugar errado (por exemplo, flutuando ao redor do citoplasma). Se um cromossomo está no lugar errado, a célula irá pausar a mitose, permitindo que o fuso capture o cromossomo perdido. Mas, como os pontos de checagem realmente funcionam? A resposta geral é que os sinais internos e externos acionam vias de sinalização dentro da célula que ativam, ou desativam, um conjunto de proteínas essenciais que movem o ciclo celular para frente. Você pode aprender mais sobre essas proteínas e ver exemplos de como elas são afetadas por sinais tais como dano no DNA, no artigo sobre reguladores do ciclo celular. Diferentes tipos de câncer envolvem diferentes tipos de mutações, e cada tumor individual tem um conjunto único de alterações genéticas. De modo geral, contudo, mutações em dois tipos de reguladores do ciclo celular podem promover o desenvolvimento de câncer: reguladores positivos podem ser superativados (tornarem-se oncogênicos), enquanto reguladores negativos, também chamados de supressores de tumor, podem ser inativados. https://pt.khanacademy.org/science/biology/cellular-molecular-biology/stem-cells-and-cancer/a/cell-cycle-regulators/ 38 Os oncogênes são reguladores positivos do ciclo celular podem estar superativados no câncer. Por exemplo, um receptor de fator de crescimento pode enviar sinais mesmo quando fatores de crescimento não estão presentes, ou uma ciclina pode ser expressada em níveis anormalmente elevados. As formas muito ativas (promotoras de câncer) desses genes são chamadas de oncogenes, enquanto as formas normais, ainda não mutadas, são chamadas de proto-oncogenes. Este sistema de nomenclatura reflete que um proto-oncogene normal pode se transformar em um oncogene se ele sofrer mutação de tal maneira que sua atividadeseja aumentada. Mutações que transformam proto-oncogenes em oncogenes podem ter diferentes formas. Algumas mudam a sequência de aminoácidos da proteína, alterando seu formato e prendendo-a em um estado "sempre ligado". Outras envolvem amplificação, na qual uma célula ganha cópias extras de um gene e, assim, começa a fabricar proteínas demais. Ainda em outros casos, um erro na reparação do DNA pode conectar um proto-oncogene a parte de um gene diferente, produzindo uma proteína "combo" com atividade desregulada. Figura 38. Forma oncogênica da proteína Ras. A Ras normal é ativada quando os fatores de crescimento se ligam a receptores do fator de crescimento. Quando ativa, a Ras muda para sua forma ligada ao GTP e desencadeia uma via de sinalização que leva à divisão e proliferação celular. Então, a Ras normal troca GTP por GDP e volta ao seu estado inativo até que a célula perceba mais fatores de crescimento. Já forma oncogênica da Ras fica permanentemente presa em sua forma ativa, ligada a GTP. A proteína Ras oncogênica ativa 39 a via de sinalização levando ao crescimento e proliferação mesmo quando não houver a presença de fatores de crescimento. Muitas das proteínas que transmitem sinais de fator de crescimento são codificadas por proto- oncogenes. Normalmente, essas proteínas dirigem a progressão do ciclo celular apenas quando fatores de crescimento estão disponíveis. Entretanto, se uma das proteínas se torna hiperativa devido à mutação, ela pode transmitir sinais mesmo quando não há fator de crescimento presente. O receptor do fator de crescimento, a proteína Ras, e a enzima de sinalização Raf, são todos codificados por proto-oncogenes. Formas hiperativas dessas proteínas são comumente encontradas em células de câncer. Por exemplo, mutações oncogênicas da Ras são encontradas em aproximadamente 90% dos cânceres pancreáticos. Ras é uma proteína G, significando que ela alterna entre uma forma inativa (ligada a uma pequena molécula de GDP) e uma forma ativa (ligada a uma molécula parecida, GTP). Mutações cancerígenas frequentemente mudam a estrutura da Ras de modo que ela não mais possa mudar para a forma inativa, ou então o faz muito lentamente, deixando a proteína presa em um estado "ligado". Os supressores de tumor são reguladores negativos do ciclo celular podem estar menos ativos (ou mesmo não funcionais) em células cancerosas. Por exemplo, uma proteína que interrompe a progressão do ciclo celular em resposta a danos no DNA pode não mais perceber o dano ou desencadear uma resposta. Os genes que normalmente bloqueiam a progressão do ciclo celular são conhecidos como supressores de tumor. Os supressores de tumor previnem a formação de tumores cancerosos quando estão funcionando corretamente, e tumores podem se formar quando eles sofrem mutações de modo que não funcionem mais. Um dos mais importantes supressores de tumor é a proteína p53, que desempenha um papel- chave na resposta celular ao dano no DNA. A p53 age primeiramente ao final de G1 (controlando a transição de G1 para S), onde ela bloqueia a progressão do ciclo celular em resposta a um DNA danificado e a outras condições desfavoráveis. Quando o DNA de uma célula é danificado, uma proteína sensor ativa a p53, que interrompe o ciclo celular no final de G1desencadeando a produção de um inibidor do ciclo celular. Essa pausa dá tempo para o reparo do DNA, que também depende da p53, cuja segunda função é ativar enzimas de reparação do DNA. Se o dano for consertado, a p53 irá liberar a célula, permitindo que ela continue através do ciclo celular. Se o dano não for passível de conserto, a p53 irá desempenhar seu https://pt.khanacademy.org/science/biology/cellular-molecular-biology/stem-cells-and-cancer/a/cell-cycle-regulators 40 terceiro e último papel: desencadear a apoptose (morte celular programada) de modo que o DNA danificado não seja passado adiante. Figura 39. Diagrama mostrando uma p53 normal e uma p53 não funcional Em resposta ao dano no DNA, a p53 normal se liga ao DNA e promove a transcrição de genes alvo. Primeiro, a p53 desencadeia a produção de proteínas inibidoras Cdk, pausando o ciclo celular na G1 para permitir que os reparos sejam feitos. A p53 também ativa as vias de reparo do DNA. Finalmente, se não for possível reparar o DNA, a p53 aciona a apoptose. O efeito concreto das ações da p52 é impedir que o DNA danificado seja herdado, seja por reparar o dano ou por fazer com que a célula se autodestrua. Quando a célula contém apenas p53 não funcionais que não conseguem se ligar ao DNA, o dano no DNA não pode mais desencadear essas respostas. Apesar da p53 ainda ser ativada pelo dano, ela é incapaz de responder, pois não consegue mais regular a transcrição de seus alvos. Assim, a célula não pausa a G1, o DNA danificado não é reparado e a apoptose não é induzida. O efeito 41 Na Grécia antiga já se falava de câncer, o conhecimento da doença é tão antigo quanto a medicina, porém esse conhecimento não era tão difundido porque as causas das mortes eram atribuídas a outros fatores. Também afirma- se que a palavra “câncer” tem origem latina e significa “caranguejo”. Isso porque o câncer apresenta projeções semelhantes aos tentáculos do caranguejo que atacam as células vizinhas. “Ele invade os outros tecidos, vai se grudando e criando raízes”. concreto da perda de p53 é permitir que os danos (mutações) no DNA sejam passados adiante para as células-filhas. Em células cancerosas, a p53 geralmente está ausente, não funcional ou menos ativa que o normal. Por exemplo, muitos tumores cancerosos têm uma forma mutante da p53 que não consegue mais se ligar ao DNA. Como a p53 age ligando-se a genes-alvo e ativando sua transcrição, a proteína mutante não-ligante é incapaz de realizar o seu trabalho. Quando a p53 está deficiente, uma célula com DNA danificado pode proceder com a divisão celular. As células-filha de tal divisão provavelmente irão herdar mutações devido ao DNA não reparado da célula-mãe. Ao longo de gerações, células com a p53 defeituosa tendem a acumular mutações, algumas das quais podem transformar proto-oncogenes em oncogenes ou inativar outros supressores de tumor. A proteína p53 é o gene mais comumente mutado nos cânceres humanos, e células cancerosas sem mutações na p53 provavelmente inativam a p53 por meio de outros mecanismos. 42 O ciclo celular é um processo evolutivamente conservado necessário para o crescimento e desenvolvimento de células de mamíferos. Como as aberrações do ciclo celular são uma característica do câncer, esse processo tem sido alvo de terapias anti-câncer há décadas. No entanto, apesar de numerosos ensaios clínicos, os agentes de direcionamento do ciclo celular geralmente falharam na clínica. Esta revisão examina brevemente as terapias direcionadas ao ciclo celular e descreve como a experiência com esses agentes forneceu informações valiosas para refinar e melhorar as estratégias antimitóticas. Uma visão geral das abordagens antimitóticas emergentes com resultados pré-clínicos promissores é fornecida, e o conceito de explorar a instabilidade genômica das células tumorais através da inibição terapêutica dos checkpoints mitóticos é discutido. Acreditamos que esta estratégia tem uma alta probabilidade de sucesso, dado o seu potencial para melhorar o índice terapêutico, visando as vulnerabilidades específicas do tumor. Esse raciocínio estimulou nosso desenvolvimento de novos inibidores visando os reguladores críticos da estabilidade genômica e da mitose. 43 A unidade básica da cromatina é o nucleossomo que consiste em, aproximadamente, 146 pares de bases do DNA enroladas ao redor de um octâmero central de proteínas conhecidas como histonas. Essas proteínas básicas, inicialmente, foram consideradas como componentes meramenteestruturais, mas agora são reconhecidas pelo importante papel que desempenham na manutenção do equilíbrio dinâmico da cromatina. As caudas aminoterminais das histonas estão sujeitas a uma variedade de modificações pós-traducionais, como metilação, acetilação, fosforilação, entre outras, que regulam suas funções. Algumas modificações estão associadas a genes ativos, enquanto outras a genes silenciosos. Uma das modificações mais estudadas atualmente é a acetilação, que depende da atividade de duas famílias de enzimas, histonas acetiltransferases (HAT) e histonas desacetilases (HDAC). As mutações ou translocações cromossomais, envolvendo genes HAT e HDAC, resultam no desenvolvimento de malignidades hematológicas, como leucemia promielocítica aguda, linfoma e outras. Inibidores das histonas desacetilases (iHDAC) têm emergido como uma nova classe de agentes anticâncer. Estes iHDAC têm demonstrado atividades contra diversos tipos de câncer e notáveis efeitos na proliferação da célula tumoral, na morte celular programada, na diferenciação e angiogênese in vitro e in vivo. 44 Shigelose é uma doença entérica responsável por 1,1 milhões de mortes anualmente, 60% destas representadas por crianças menores de 5 anos. Espécies de Shigella são encontradas em água e alimentos contaminados, sendo a rota de transmissão deste patógeno por meio do contato fecal-oral. O presente estudo visou a adaptar uma técnica molecular com vistas à identificação de casos clínicos de gastroenterite provocadas por Shigella spp. A cultura bacteriana do isolado clínico de S. sonnei LCL- 01 foi submetida à extração de DNA genômico por meio do método de fenol-clorofórmio com modificações, submetendo o material genético resultante à técnica de PCR simplex. O procedimento de extração resultou em um DNA genômico de boa qualidade, obtendo-se fragmento de 615 pb após amplificação do gene ipaH. Dessa forma, viabilizou-se a identificação molecular de S. sonnei por meio da adaptação de uma metodologia in-house de baixo custo, baseada na utilização de fenol- clorofórmio como ferramenta para romper a parede celular bacteriana visando à extração de DNA genômico, a qual poderá auxiliar no rastreamento, detecção e tratamento de infecções causadas por S. sonnei. 45 As neoplasias hormônio-dependentes podem originar-se de mutações genéticas resultantes da proliferação de células normais ou da multiplicação de células já transformadas por outros carcinógenos. Alguns hormônios e drogas anti-hormonais estão sendo utilizados com sucesso no tratamento dessas neoplasias em humanos. Apesar da freqüência elevada das neoplasias hormônio- dependentes nos animais, seu tratamento com hormônios antagonistas e fármacos anti-hormonais, bem como a identificação imunoistoquímica de receptores hormonais nas neoplasias não fazem parte da rotina dos hospitais veterinários. 46 A associação entre a infecção pelo papilomavírus humano (HPV) e o câncer de colo uterino e de outros sítios anogenitais já está estabelecida. A medicina molecular tem evidenciado mecanismos específicos relacionados à carcinogênese induzida pelo HPV e revelado a importante interação de oncoproteínas virais com genes de controle do ciclo celular. Estudos epidemiológicos e em medicina molecular também sugerem que a infecção pelo HPV pode estar associada ao câncer de cabeça e pescoço. Isso se deve à significativa frequência da infecção pelo HPV, principalmente os tipos de alto- risco nessa situação. Entretanto, são necessárias pesquisas básicas para descrever o estado físico do vírus em uma variedade de tipos celulares e a sua interação com outros genes celulares, assim como estudos epidemiológicos auxiliariam na compreensão da associação entre o HPV e fatores de risco para o desenvolvimento de neoplasias, características demográficas e modos de transmissão. Isso nos motivou a revisar a literatura considerando os aspectos biológicos da infecção pelo HPV e seu potencial papel etiológico no câncer de cabeça e pescoço; a detecção da infecção pelo HPV no tecido normal, em lesões benignas e pré-malignas da cavidade oral, bem como no carcinoma oral, discutindo também os métodos de detecção do HPV. Verificamos taxas de detecção muito divergentes, com frequência variando de 0 a 78%, justificadas por vários fatores: diferentes métodos e técnicas, diferentes amostras de tecido e variabilidade interlaboratorial. Aanálise da literatura nos levou a concluir que: (1) os estudos epidemiológicos não demonstram clara associação entre a infecção pelo HPV e o câncer oral; (2) os estudos experimentais comprovam a ação de genes virais causando a “imortalização” celular; (3) os métodos de detecção do DNAviral em tecido da cavidade oral devem ser aperfeiçoados objetivando menor interferência nos resultados. 47 A proteína supressora de tumor p53 desempenha um papel crítico na limitação do desenvolvimento e progressão maligna. Quase todos os cânceres mostram perda da função da p53, através de mutação no próprio gene p53 ou defeitos nos mecanismos que ativam a p53. Embora a reativação da p53 possa efetivamente limitar o crescimento do tumor, esse é um objetivo terapêutico difícil de alcançar em muitos cânceres que não retêm a p53 do tipo selvagem. Uma abordagem alternativa se concentra na identificação de vulnerabilidades impostas aos cânceres em virtude da perda ou alterações na p53, para identificar vias adicionais que podem ser direcionadas especificamente para matar ou inibir o crescimento de células mutadas pela p53. Essas formas indiretas de explorar mutações na p53 - que ocorrem em mais da metade de todos os cânceres humanos - fornecem inúmeras possibilidades terapêuticas excitantes. 48 ALBERTS, Bruce et al. Biologia molecular da célula. Artmed Editora, 2010. ALBERTS, Bruce et al. Fundamentos da biologia celular. Artmed Editora, 2002. BERNE, Robert M. et al. Berne & Levy physiology. Elsevier Brasil, 2008. COOPER, Geoffrey M.; HAUSMAN, Robert E. A Célula-: Uma Abordagem Molecular. Artmed Editora, 2016.
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