Expressão genica

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Biologia Celular e Molecular Biologia Celular e Molecular 
Regulação da Expressão 
GênicaGênica
Enzimas de Restrição Enzimas de Restrição 
EletroforeseEletroforese
Genoma 
AA maiormaior parteparte dede dodo genomagenoma eucarióticoeucariótico nãonão codificacodifica parapara genesgenes
funcionaisfuncionais..funcionaisfuncionais..
GenomaGenoma HumanoHumano
 ApenasApenas 22%% codificacodifica parapara proteínasproteínas;;
 AA seqüênciaseqüência genômicagenômica temtem aproximadamenteaproximadamente 9999,,99%% dede
similaridadesimilaridade emem indivíduosindivíduos dede todastodas asas espéciesespécies..
 PeloPelo menosmenos 5050%% dodo genomagenoma derivaderiva dede elementoselementos tranponíveistranponíveis.. PeloPelo menosmenos 5050%% dodo genomagenoma derivaderiva dede elementoselementos tranponíveistranponíveis..
 GenomaGenoma possuempossuem aproximadamenteaproximadamente 2020..000000 genesgenes;;
 NúmeroNúmero dede intronsintrons podepode variarvariar dede zerozero aa 234234;; NúmeroNúmero dede intronsintrons podepode variarvariar dede zerozero aa 234234;;
 MaiorMaior genegene 22,,55 MbMb dada distrofinadistrofina
Genes Humanos
PlasmídeosPlasmídeos – Molécula de DNA circular, extracromossomal,
autorreplicativa encontrada em bactériasautorreplicativa encontrada em bactérias
GenomasGenomas
DNADNA repetitivorepetitivo::DNADNA repetitivorepetitivo::
 centrômeroscentrômeros
 TelômerosTelômeros TelômerosTelômeros
 RepetiçõesRepetições emem tandemtandem
 VNTRsVNTRs –– NúmeroNúmero variávelvariável dede repetiçõesrepetições emem tandemtandem
 1515 aa 100100 pbpb -- minisatélitesminisatélites
 STRsSTRs –– RepetiçõesRepetições curtascurtas emem tandemtandem
 di,di, tri,tri, tetratetra –– microsatélitemicrosatélite
 RetrotransposonsRetrotransposons
Como podemos explicar as diferenças 
celulares entre os tecidos, se todos celulares entre os tecidos, se todos 
possuem o mesmo material genético (com 
a mesma seqüência de DNA) dentro de a mesma seqüência de DNA) dentro de 
cada uma de suas células? 
Diferença na expressão dos genes 
Genes expressos (ativos) em algumas linhagens Genes expressos (ativos) em algumas linhagens 
celulares podem estar inativos (não-expressos) em 
outras. outras. 
Mas por que alguns genes ficam ativos em umas e Mas por que alguns genes ficam ativos em umas e 
inativos em outras?
Genes com expressão constitutiva
Genes constitutivos – continuamente expressos. Ex. rRNA,Genes constitutivos – continuamente expressos. Ex. rRNA,
tRNA, genes envolvidos na manutenção celular.
Genes com expressão regulada
Como a célula regula, “escolhe” quais 
genes vão ser expresso em quais genes vão ser expresso em quais 
momentos?momentos?
Regulação da expressão Gênica:Regulação da expressão Gênica:
• Procariotos.• Procariotos.
• Eucariotos.• Eucariotos.
Níveis de regulação em Procariotos 
• Inicio da transcrição• Inicio da transcrição
• Antiterminação
• Regulação da tradução
Regulação em ProcariotosRegulação em Procariotos
Genes são controlados por sinais extracelulares.Genes são controlados por sinais extracelulares.
Proteínas reguladoras:Proteínas reguladoras:
• Ativadores
• Repressores• Repressores
Regulação Positiva:Regulação Positiva:
Na regulação positiva, o ativador está ligado ao DNA
facilitando a transcrição, ou seja, uma proteína celular vai
ativar a expressão de determinado gene ou operon.ativar a expressão de determinado gene ou operon.
Regulação Negativa:
Na Regulação Negativa, o repressor está ligado ao
DNA inibindo a transcrição, ou seja, uma proteína vai reduzir aDNA inibindo a transcrição, ou seja, uma proteína vai reduzir a
expressão de determinados genes.
Regulação em ProcariotosRegulação em Procariotos
Genes são controlados por sinais 
extracelulares.extracelulares.
Moléculas efetoras :Moléculas efetoras :
• Indutoras 
• Co-repressoras• Co-repressoras
Regulação em ProcariotosRegulação em Procariotos
Genes são controlados por sinais extracelulares.Genes são controlados por sinais extracelulares.
• Indutível negativa-• Indutível negativa-
• Repressor impede a transcrição
• repressor + indutor – ativação da transcrição
• Indutível positivo-• Indutível positivo-
• Ativador + indutor –ativação da transcrição
• Repressível negativo-• Repressível negativo-
• Repressor + co-repressor – impede a transcrição
• Repressor sozinho – não impede a transcrição• Repressor sozinho – não impede a transcrição
• Repressível positivo
• Ativador ativa a transcrição
• Ativador + repressor – incapaz de ativar a transcrição
Ativação pelo 
recrutamento da Nível basal recrutamento da 
RNA-polimerase
Nível basal
RNA-polimerase
Alto níveis de transcrição
Ativadores por Alosteria dobramentoAtivadores por Alosteria dobramento
Regulam etapas 
posteriores à posteriores à 
ligação da RNA-
polimerase
Atuação à distância e curvatura do DNA
Uma proteína que induz curvatura favorece a aproximação do ativador com RNA 
polimerase.polimerase.
Ativação pelo recrutamento da RNA-polimerase
Meio interferindo na expressão gênica
E. coli podem crescer usando qualquer um dentre vários E. coli podem crescer usando qualquer um dentre vários 
carboidratos,Ex: glicose, sacarose, galactose, lactose. 
Na presença de glicose E. coli metaboliza glicose na falta pode usar outro 
carboidrato. 
Na presença Lactose - ativação do operon genes indutíveis
Na ausência - desativaçãoNa ausência - desativação
Operon LacOperon Lac
É o controlador da síntese das enzimas metabolizadoras de
lactose a qual três enzimas fazem parte.
. BETA-GALACTOSIDASE:
Ela é capaz de clivar a lactose em glicose e galactose.Ela é capaz de clivar a lactose em glicose e galactose.
. PERMEASE:
É a enzima responsável pelo transporte de lactose do meio
extracelular para o meio intracelular.extracelular para o meio intracelular.
•Caso a bactéria esteja crescendo em meio rico em lactose, sua expressão será alta; •Caso a bactéria esteja crescendo em meio rico em lactose, sua expressão será alta; 
•Caso a fonte de carbono seja outro carboidrato, sua expressão será reduzida. 
O RNAm do operon lac é dito policistrônico ou poligênico, pois possui informação 
para codificar as 3 proteínas: beta-galactosidase, permease e transacetilasepara codificar as 3 proteínas: beta-galactosidase, permease e transacetilase
proteína ativadora do catabolismo (CAP)
Complexo - CAP + AMP cíclicoComplexo - CAP + AMP cíclico
Operon do triptofano – Trp
Sintetizam o aminoácido trp
Biossíntese do Trp 
Os cinco genes necessários para a síntese ativados em 
um ambiente pobre em triptofano.
Desativado em um ambiente rico em triptofano- repressão.
Operon do triptofano – Trp
Sintetizam o aminoácido trpSintetizam o aminoácido trp
Duas etapas de controle:
• No inicio da transcrição:
trp presente liga-se ao repressor alterando a 
conformação deste tornando-o capaz de se ligar ao 
promotor impedindo a transcrição.promotor impedindo a transcrição.
• Posterior a transcrição.
Operon do triptofano – Trp
Sintetizam o aminoácido trp
Regulação em etapas posteriores ao início 
da transcrição da transcrição 
Terminação prematura da transcrição
Região pareamentos 1-2; 2-3; 3-4Região pareamentos 1-2; 2-3; 3-4
3-4 promove uma mudança conformacional na RNA pol. Que resulta no termino 
da transcrição.
Na baixa concentração de tRNA trp – o ribossomo pára na região 1 eassim a Na baixa concentração de tRNA trp – o ribossomo pára na região 1 eassim a 
região 2-3 pareiam e a 3-4 não. Tradução continua.
Parte de um mRNA líder é
traduzido.traduzido.
. Esse mRNA líder possui 14
aminoácidos (triptofano na posiçãoaminoácidos (triptofano na posição
10 e 11) que exercem um papel na
regulação.
. Quando o triptofano é abundante,
o peptídeo completo é sintetizado
permitindo a formação de uma alça
que pára a transcrição.
. Quando há pouco triptofano, o
ribossomo pára nos códons UGG
repetidos. O ribossomo paradorepetidos. O ribossomo parado
altera a estrutura do mRNA de
modoque RNA polimerase que o
transcreve continua além do pontotranscreve continua além do ponto
atenuador.
Regulação Gênica em EucariotosRegulação Gênica em Eucariotos
Níveis:
• Ativação e repressão da transcrição na iniciação • Ativação e repressão da transcrição na iniciação 
da transcrição
• Processamento• Processamento
• Controle da estabilidade do mRNA
• splicing alternativo• splicing alternativo
• Controle pós-transcricional
• Tradução• Tradução
• Micro RNAs reprimem a tradução de mRNAs
específicos;específicos;
• RNA de interferência induz a degradação de 
mRNA.mRNA.
• Pós-tradução
Regulação Gênica em Eucariotos
Fatores de Transcrição
Os fatores gerais de transcrição são responsáveis:
 Pelo posicionamento correto da RNA polimerase no  Pelo posicionamento correto da RNA polimerase no 
promotor.
 Ajudam na separação das fitas de DNA para permitir o  Ajudam na separação das fitas de DNA para permitir o 
início da transcrição.
 Liberam a RNA polimerase do promotor quando a  Liberam a RNA polimerase do promotor quando a 
transcrição se inicia.
Regulação Gênica em Eucariotos
Seqüência chamada acentuadores ou reforçadores –Seqüência chamada acentuadores ou reforçadores –
•Atuam a distância relativamente grandes;
•Podem estar situados antes ou depois de um gene.•Podem estar situados antes ou depois de um gene.
Regulação Gênica em Eucariotos
Ativação e repressão da transcriçãoAtivação e repressão da transcrição
Regulação Gênica em EucariotosRegulação Gênica em Eucariotos
Se o reforçador ativa umSe o reforçador ativa um
determinando gene a
Vários bases de distância, o
que o impede de ativarque o impede de ativar
outros genes cujos os
promotores estão dentro
desta faixa de alcance?desta faixa de alcance?
Isoladores
Regulação Gênica 
em Eucariotosem Eucariotos
Ativação e repressão da 
transcriçãotranscrição
Regulação Gênica em EucariotosRegulação Gênica em Eucariotos
Epigenética pode ser entendida como a alteração doEpigenética pode ser entendida como a alteração do
genoma, herdável na divisão celular sem causar
modificações na sequência do DNA. Consiste nomodificações na sequência do DNA. Consiste no
estudo das mudanças hereditárias na expressão
gênica que independem de mudanças na sequencia
primária do DNA
Marcas epigenéticas
Regulação Gênica em Eucariotos
•Modificação no DNA
–Metilação do DNA–Metilação do DNA
Regulação Gênica em EucariotosRegulação Gênica em Eucariotos
Regulação Gênica em Eucariotos
Modificações nos nucleossomos
Dois tiposDois tipos
• a) Adicionam grupos químicos às caudas das histonas 
acetil transferases de histonas - HATs;acetil transferases de histonas - HATs;
•Adição de grupos acetila também auxilia a ligação da maquinaria 
transcricional
•B) Os que remodelam o nuclelossomo- deslocam os octâmeros 
de histonas ao longo do DNA.de histonas ao longo do DNA.
•Podem expor sítios de ligação
•Podem levar ao sileciamento
Regulação Gênica em Eucariotos
Ativação e repressão da transcriçãoAtivação e repressão da transcrição
Regulação Gênica em EucariotosRegulação Gênica em Eucariotos
Exemplo
Butirato de sódio
Especificamente, o tratamento das células com butirato resulta na
hiperacetilação da histona, e o butirato inibe a atividade de deacetilase.
Butirato tem sido um veículo essencial para determinar o papel da acetilação daButirato tem sido um veículo essencial para determinar o papel da acetilação da
histona na estrutura e função a cromatina.
Regulação Gênica em Eucariotos
Splicing alternativo
Regulação Gênica em Eucariotos
Splicing alternativoSplicing alternativo
Regulação Gênica Regulação Gênica 
em Eucariotos
RNA de interferênciaRNA de interferência
e MicroRNAs (RNAi, 
siRNA 
São seqüências curtas (70 
siRNA (short interfering RNAs)
São seqüências curtas (70 
são cortadas em 23) que 
não são traduzidas em 
proteínas e hibridizam com 
RNAm, causando seu 
silenciamento.silenciamento.
Enzimas de restrição
– Estas enzimas são proteínas que clivam o – Estas enzimas são proteínas que clivam o 
DNA
• Também conhecidas como endonucleases de • Também conhecidas como endonucleases de 
restrição
• Denominadas• Denominadas
– Duas primeiras letras da espécie
– Ex. EcoRI – produzida em Escherichia coli– Ex. EcoRI – produzida em Escherichia coli
Foram descobertas nos anos de 1970,Foram descobertas nos anos de 1970,
Hamilton Smith e Daniel Nathans- Dividiram o 
premio Nobel em fisiologia com Werner Arber.premio Nobel em fisiologia com Werner Arber.
Enzimas de restrição
• Função Biológica• Função Biológica
– É proteger o material genético de bactérias da – É proteger o material genético de bactérias da 
invasão por materiais exógenos
– Referidas como sistema imunológico em – Referidas como sistema imunológico em 
procariotos.
Enzimas de restrição
– Reconhece e cliva uma sequência curta e – Reconhece e cliva uma sequência curta e 
específica
– Proporcionaram um grande salto na biologia – Proporcionaram um grande salto na biologia 
molecular, pois permitiram a manipulação de 
genesgenes
• Permitindo a construção a inserção de uma • Permitindo a construção a inserção de uma 
fragmento específico de DNA
– Um grande número destas enzimas (cerca de – Um grande número destas enzimas (cerca de 
400) já foi descrito, cada uma digerindo uma 
região específica-região específica-
• A enzima reconhece o • A enzima reconhece o 
sítio (normalmente um 
PALíNDROMO)
• 4- 8 pb• 4- 8 pb
• AMOR = ROMA
• Cliva o DNA no local
• Pode gerar • Pode gerar 
– Extremidade lisa
– Extremidade coesiva
•• Fazem cortes desencontrados – produzem segmentos de DNA 
com pontas unifilamentares
– Forma extremidades coesivas
– No exemplo, EcoRI
Como a enzima não cliva seu próprio DNA Como a enzima não cliva seu próprio DNA 
nas seqüência especificas?
Proteção de locais Proteção de locais 
de clivagem 
endógena obtida 
por metilação de 
um ou mais de um ou mais de 
seus nucleotídeos 
em cada seqüência 
reconhecida. reconhecida. 
• O emprego de enzimas de restrição• O emprego de enzimas de restrição
 Figura 1 
 
EletroforeseEletroforese
• Eletroforese
– Método de separação de moléculas– Método de separação de moléculas
– Ácidos nucléicos (DNA e RNA) e proteínas
• Separa DNA e RNA de acordo com tamanho• Separa DNA e RNA de acordo com tamanho
– Matriz em gel é um material poroso
• Poliacrilamida – maior resolução
• Agarose
• DNA possui carga negativa• DNA possui carga negativa
– Por isto migra para o pólo positivo
• A velocidade de migração é dependente • A velocidade de migração é dependente 
do tamanho do fragmento
 Cuba de 
eletroforese
 Solução tampão
 Eletrodo
 fonte de energia
• Eletroforese• Eletroforese
– Tampão
– T – 2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol
– B – ácido bórico
– E - ácido etilenodiamino tetra-acético
– Corante
• Brometo de etídeo
• Syber Green
• Corantes• Corantes
• Eletroforese• Eletroforese
Tecnologia do DNA recombinanteTecnologia do DNA recombinante
• Eletroforese
• Eletroforese• Eletroforese
• Enzimas de restrição + GEL agarose• Enzimas de restrição + GEL agarose
 Figura 1 
 
• Como fica o gel se digerir no sítio 1?
 
• Como fica o gel se digerir no sítio 1?
• Como fica o gel se digerir no sítio 2?
• Como fica o gel se digerir no sítio 1 + 2?