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Microbiologia Geral 
e Clínica Aplicada 
à Farmácia
Responsável pelo Conteúdo:
Prof.ª Me. Camilla de Paula Pereira Uzam
Revisão Textual:
Prof.ª Dr.ª Luciene Oliveira da Costa Granadeiro
Coleta, Transporte, Estocagem e Contagem de Microrganismos
Coleta, Transporte, Estocagem 
e Contagem de Microrganismos
• Reconhecer toda a cadeia, desde a coleta até o cultivo e contagem dos microrganismos.
OBJETIVO DE APRENDIZADO 
• Coleta e Transporte de Amostras para Análise;
• Processamento das Amostras;
• Contagem Total de Microrganismos em Placas.
UNIDADE Coleta, Transporte, Estocagem e Contagem de Microrganismos
Coleta e Transporte de Amostras para Análise
O planejamento é a primeira etapa do processo de coleta de amostras. Auxilia 
tanto na ordenação do fluxo de trabalho como também na garantia da qualidade do 
material coletado.
Nessa etapa, avalia-se o risco envolvido na amostragem, a estabilidade da amos-
tra, o prazo necessário (e possível) para emissão do resultado e os custos envolvidos 
na coleta, transporte, conservação e armazenamento da amostra. 
Segundo o Guia n°19 de Laboratórios Analíticos, desenvolvido pela Anvisa, é 
necessário responder às seguintes perguntas no planejamento:
* Exemplos: programa de monitoramento, denúncias, demanda judicial, demanda policial.
O que coletar? Quando coletar? Por que coletar?* Quanto coletar?
Como coletar?Onde coletar?Quem vai coletar?
Figura 1
Fonte: Adaptado de Anvisa – Laboratórios Analíticos – Guia 19, p. 10
Importante!
Os vídeos disponibilizados no decorrer do conteúdo fazem parte da unidade e 
podem ser solicitados na avaliação.
Vale ressaltar que esta unidade não tem pretensão de substituir os manuais técni-
cos disponíveis, e sim sintetizar as principais regras adotadas. Além dessas técnicas, 
os laboratórios devem seguir as Boas Práticas de Laboratório, possuir procedimen-
tos operacionais que descrevam os meios de transporte e armazenamento adequa-
dos para cada tipo de coleta, para garantir que o analista execute adequadamente 
a atividade.
Seguir sempre o Regulamento Técnico para funcionamento de Laboratórios Clínicos, Reso-
lução Anvisa n° 302 de 13 de outubro de 2005 e suas atualizações.
Disponível em: https://bit.ly/2JJOoOO e https://bit.ly/34f4ppE
Fase Pré-analítica e Coleta de Amostras
A coleta de amostra pode ser considerada a etapa principal do processo analítico, 
pois a qualidade e confiabilidade dos resultados liberados por laboratório de micro-
biologia depende da qualidade da amostra recebida.
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Diversas são as fontes de amostras, que podem ser de origem biológica ou não. 
As amostras mais comuns são as biológicas, como sangue e secreções e os alimentos, 
mas a pesquisa de contaminantes pode ser explorada nos mais diversos materiais. 
Como todo processo amostral, esse deve ser representativo, ou seja, uma parte 
deve representar o todo. Ficou difícil de entender? Vamos pensar na seguinte situa-
ção. Estamos fazendo uma pesquisa sobre a automedicação da população brasileira 
e, como não é possível entrevistar toda a população, decidimos utilizar uma parte, 
ou seja, uma amostra dessa população.
Agora vamos pensar juntos: se entrevistarmos somente familiares e amigos, as 
respostas que vamos obter irão representar a população brasileira? Provavelmente 
não. Para ser uma amostra representativa, seria necessário entrevistar pessoas dos 
diferentes estados e municípios, considerar pessoas de todos os poderes aquisitivos, 
o acesso ao sistema de saúde e outras variáveis, sem esquecer que a quantidade de 
pessoas entrevistadas deve ser cuidadosamente definida, para não gerar um resulta-
do tendencioso ou falso em nossa entrevista.
O mesmo acontece com as amostras de material biológico: o material coletado 
deve representar o processo infeccioso e por isso é fundamental escolher adequa-
damente o local da coleta (sítio da lesão) e definir a quantidade de amostra. Se você 
está investigando uma infecção urinária, iria coletar secreção nasal para os exames? 
Esse é um exemplo bem simplório, mas que pode auxiliar no entendimento desse 
conceito de local de coleta.
Tubo simples, 
nenhum
anticoagulante.
Forma-se coagulo.
Geral Geral Geral
Glicemia
Coleta de
sangue arterial
CoagulgramaAnálise desangue total.
Lípdeos e
lipoproteínas
Tubo simples:
Contém gel
EDTA
Anticoagulante
Heoarina
Anticoagulante Flureto
Seringa
heparinizada Citrato
Figura 2 – Tubos para coleta de sangue e transporte até o laboratório
Fonte: Adaptado de socialboor.com
Falhas na coleta e transporte podem causar falhas no isolamento do agente, fa-
vorecer o desenvolvimento de contaminantes, interferindo no resultado da análise. 
Procedimentos adequados de coleta devem ser adotados para evitar o isolamento de 
um “falso” agente etiológico, entre eles:
• Observar que os materiais de coleta devem estar estéreis e devidamente arma-
zenados;
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UNIDADE Coleta, Transporte, Estocagem e Contagem de Microrganismos
• Escolher o melhor local para coleta, ou seja, aquele em que a probabilidade de 
isolamento do microrganismo seja maior;
• No caso de microrganismos patogênicos, para escolha do material é necessário 
considerar o estágio da doença, por exemplo: quando o agente patogênico é 
entérico, causadores de diarreia, são encontrados em maior quantidade e, por-
tanto, mais facilmente isolados durante a fase aguda (diarreica). Outro exemplo 
importante é nas suspeitas de febre tifoide, a coleta poderá ser de sangue ou 
fezes, dependendo da fase da doença;
• Tentar prever a quantidade necessária para a análise, para que seja suficiente 
para todos os testes necessários. Quando a quantidade de amostra for insufi-
ciente, priorizar os testes mais importantes;
• Observar que o pedido do exame deve conter, além da identificação do pacien-
te, dados como idade, doença de base e indicação do uso de antibióticos ou 
outros medicamentos;
• Evitar o contato dos microrganismos com os anestésicos utilizados durante a 
coleta, que poderão exercer atividade bactericida.
Figura 3 – Tubos para coleta de líquor e transporte até o laboratório
Fonte: socialboor.com
Como nos demais laboratórios, as regras de biossegurança devem ser observadas, 
especialmente os critérios de segurança biológica, como: 
• Utilizar as barreiras de proteção necessárias a cada procedimento;
• Independente da suspeita, sempre tratar a amostra como perigosa (potencial-
mente patogênica);
• Sempre escolher frascos e meios de transporte adequados ao material que 
será coletado;
• As amostras não devem ser manuseadas em trânsito. Sempre transportar em 
embalagens adequadas, de preferência, térmicas;
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• A superfície externa dos frascos de coleta deve estar limpa e bem fechada. Em 
caso de respingo ou contaminação na parte externa, descontaminar com álcool 
70% ou outra solução antisséptica disponível;
• Preservar a solicitação médica (guia ou receituário), para que não seja conta-
minado durante a coleta. É ideal que a guia de solicitação seja embalada em 
plástico antes do início do processo de coleta;
• Identificar as amostras com todos os dados sobre a amostra e paciente, inclusive 
hora da coleta (não colocar a identificação na tampa). Colocar as amostras em 
um saco plástico para o transporte;
• Armazenar em frasco adequado (de preferência térmico) e encaminhar o mais 
rápido possível para o laboratório.
Figura 4 – Tubos para coleta de fezes, urina, escarro e transporte até o laboratório
Fonte: Divulgação
O cuidado com esses critérios garante resultados confiáveis, evitando problemas 
básicos como a falta de identificação ou discrepância entre as informações na iden-
tificação da amostra e seu conteúdo, falta de dados como origem, ou amostra não 
condizente com o teste que será realizado.
Fase pré-clínica e coleta de sangue, disponibilizado pelo Conselho Regional de Farmácia 
do Paraná, com Dra. Ivana Regina Machado Stumm, acesse: https://youtu.be/Ega8I6rUhYk
São problemas comuns encontrados nas amostras recebidas pelos laboratórios:
•Material clínico recebido em solução de fixação inadequada;
• Presença da ponta de cateter de Foley;
• Conservação inadequada da amostra (temperatura errada, tempo de coleta su-
perior ao limite ou armazenadas em condições inadequadas, por exemplo, urina 
de duas horas devem ficar sob refrigeração, até no máximo 24 horas);
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UNIDADE Coleta, Transporte, Estocagem e Contagem de Microrganismos
• Frascos de amostra não estéreis;
• Vazamentos, frascos quebrados ou sem tampa, ou contaminações externas;
• Um único swab com diversas requisições de testes microbiológicos;
• Swab seco;
• Culturas recebidas em condições inadequadas.
Quando a amostra recebida não está adequada, ou existe suspeita de integridade 
da amostra que possa comprometer o resultado, é necessário realizar o contato com 
o solicitante para esclarecimentos, podendo chegar ao caso de se solicitar uma nova 
coleta de amostras.
Os Principais Erros Pré-Analíticos no Laboratório Clínico, disponibilizado pelo Conselho Regio-
nal de Farmácia do estado do Paraná, apresentado pela Drª. Ivana Regina Machado Stumm, 
disponível em: https://youtu.be/RLgfLW4BbpE
Tabela 1 – Exemplos de critérios de rejeição para amostras clínicas
Problemas de identificação Amostras inadequadas
• Desconexão entre a amostra recebida e o pedido do médico; 
• Falha de identificação da amostra;
• Falta de dados como: origem da amostra, tipo da amostra, 
hora da coleta, dados do paciente etc.;
• Falta de dados sobre a análise solicitada (teste não especificado, 
falha na nomenclatura, duplicidade de solicitação etc. 
• Frascos não estéreis;
• Amostras para anaeróbios sem condições de anaerobiose;
• swab de local que deveria ser biopsia (queimadura, perirretal, 
gangrena, úlcera de decúbito, lesão periodontal etc.);
• Falha na conservação (atraso no tempo de envio, 
temperatura inadequada, meio de cultura inadequado ou 
fora do meio de cultura, material fixado em formol etc.);
• Frascos/Materiais inadequados (swab não padronizado – 
“cotonete”, frasco não padronizado).
Fonte: Adaptado de ANVISA 
Transporte
A amostra coletada deve ser transportada do local de coleta ao laboratório. 
Quando temos a coleta sendo realizada no mesmo espaço físico dos laboratórios 
analíticos, o processo de transporte é mais simples, sendo necessário garantir so-
mente a conservação do produto do momento da coleta até o setor em que irá 
proceder as análises.
Uma preocupação maior ocorre quando a coleta é realizada em local distinto do 
laboratório de análise. A agilidade no transporte da amostra garante a integridade 
do microrganismo coletado, pois ele precisa estar viável para ser isolado. Outro 
ponto importante é que o microrganismo não pode crescer demais, situação que 
pode acarretar em erro de interpretação nas culturas quantitativas. A tabela a seguir 
apresenta algumas regras para o transporte de amostras.
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Tabela 2 – Tempo crítico para entrega da amostra ao laboratório e meios de transporte
Amostra Tempo crítico Temperatura Meio de transporte
Anaeróbicos 30 minutos Ambiente Fragmento ou aspirado em frasco estéril, meio de transporte semi-sólido
Fezes
1 hora Ambiente Frasco seco estéril
12 horas Ambiente Meio Cary Blair3
Fragmentos 
30 minutos Ambiente Frasco estéril
8 horas Ambiente Meio de transporte
Líquido Pleural Imediatamente Ambiente Tubo seco estéril
Líquor Imediatamente Ambiente Tubo seco estéril
Material respiratório 30 minutos Ambiente Tubo seco estéril
Sangue 1 hora Ambiente2 Passar para caldo nutriente imediata-mente após a coleta
Swab1 Até 8 horas Ambiente Meio semi-sólido (Stuart ou Amies)
Urina
1 hora Ambiente Frasco seco estéril
12 horas Refrigerada Frasco seco estéril
Fonte: ANVISA
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Montagem de caixa de transporte de amostras biológicas: https://youtu.be/cT_k6F1WLYA
Instruções gerais de coleta
Quando pensamos em coleta, subentende-se que o profissional envolvido já está 
treinado e conhece as características de estabilidade do material que será coletado e 
a importância do rápido transporte do material ao laboratório, tem consciência sobre 
os riscos biológicos envolvidos e a importância do uso adequado dos equipamentos 
de proteção individual e está treinado quanto aos procedimentos que devem ser ado-
tados em caso de acidente, tanto pessoal quanto no ambiente, lembrando que todo 
treinamento deve ser inicial e periódico (reciclagem).
Independentemente do tipo de material que será coletado para análises microbio-
lógicas, recomenda-se:
• Coletar antes do uso de antibióticos, ou imediatamente antes do horário da 
próxima medicação quando o paciente já estiver em uso com o medicamento;
• O paciente deve receber as instruções sobre o procedimento de coleta desde o 
preparo (cuidados que o paciente terá antes da coleta);
• Os materiais para coleta, armazenamento e transporte devem estar devidamen-
te higienizados e estéreis;
1 Evitar Swab transportado em tubo seo estéril pois o tempo de espera pode levar ao ressecamento excessivo do 
material e perda da viabilidade de alguns micro-organismos.
2 Para rotinas automatizadas, não incubar o frasco em estufa comum, deixar em temperatura amiente até incubação 
no equipamento.
3 Meio Cary Blair para transporte de fezes, com pH 8,4, apresenta boa recuperação para Vibrio sp. e Campylo-
bacter sp. Se a amostra não for entregue no laboratório em uma hora, conservar em geladeira de – 4 a 8°C, no 
máximo por um período de 12 horas. Marcar a data e horário da coleta.
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UNIDADE Coleta, Transporte, Estocagem e Contagem de Microrganismos
• Escolher o local de coleta que proporcione maior probabilidade de isolar o mi-
crorganismo, evitando tecidos necrosados ou secreções acumuladas no local da 
lesão. Lembrando que o estágio da doença poderá interferir no isolamento do 
microrganismo e, portanto, na escolha do material;
• Coletar quantidade suficiente para as análises;
• Nunca manusear as amostras durante o transporte.
A seguir, você encontrará o resumo de algumas recomendações para coletas. 
Para mais informações, consultar os guias ou manuais técnicos disponíveis. Muitos 
são disponibilizados pela Anvisa e outros pelas secretarias de saúde de cada estado, 
lembrando que podem ter pequenas alterações de métodos validados de acordo com 
o laboratório, sem interferir na qualidade do resultado, devendo o profissional conhe-
cer e se adequar aos procedimentos adotados pelo laboratório.
Hemoculturas
As técnicas para hemocultura apresentadas aqui são as determinadas no Manual 
de Procedimentos Básicos em microbiologia clínica para o controle de infecção hos-
pitalar do Ministério da Saúde. É possível encontrar pequenas variações de método, 
dependendo da referência adotada, por isso é importante cautela na escolha da refe-
rência para não comprometer o resultado apresentado.
A quantidade coletada também pode ser influenciada pela suspeita clínica, por exem-
plo, se for suspeita de endocardite bacteriana aguda, deve-se coletar 3 amostras de pun-
ções venosas distintas e com intervalo de 15 a 30 minutos entre elas, já para infecções 
sistêmicas como sepsis, meningite e pneumonia bacteriana, recomenda-se a coleta de 
dois pontos venosos diferentes, com intervalo de 5 minutos entre as coletas (10 – 20ml), 
para crianças, o volume de amostra pode oscilar de 0,5mL a 4mL de amostra. 
Hemocultura, disponibilizado pelo Conselho Regional de Farmácia do Estado do Paraná, 
Palestrante: Farmacêutica Dra. Laura Gogo. Disponível em: https://youtu.be/qkx-yz2W5yE
Técnicas de Coleta
• Higienizar mãos e antebraços;
• Retirar os lacres dos frascos de hemocultura e fazer assepsia prévia nas tampas 
com álcool 70%;
• Colocar o garrote no braço do paciente e palpar para selecionar a veia mais 
adequada;
• Higienizar a área definida com álcool 70%, de forma circular e de dentro para fora;
 Nota: É possível utilizar solução de iodo (tintura de iodo 1% a 2% ou PVPI 
10%) para higienizar a área. Aplicar do mesmo modo, movimentos circulares 
e de dentro para fora e aguardar o iodo secar pararealizar a coleta (um a 
dois minutos);
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• A quantidade coletada deverá ser suficiente para os testes que serão realizados; 
• Quando o iodo for utilizado, deve ser retirado do braço do paciente com álcool 70%; 
• Identificar cada frasco e enviar ao laboratório.
Observações:
• A guia de solicitação deve acompanhar todas as etapas, desde a coleta;
• O paciente deve ser orientado de todos os procedimentos que serão realizados;
• Sempre utilizar punções venosas para coletas (não se recomenda coleta através 
de cateteres ou cânulas);
• Não é recomendado trocar agulhas entre a punção de coleta e distribuição do 
sangue no frasco de hemocultura;
• O método de coleta do sangue e a quantidade coletada interferem na viabilidade 
do microrganismo e na interpretação adequada dos resultados.
Coleta de sangue venoso, disponibilizado pela Associação Paulista para o Desenvolvimento 
da Medicina com base na Referência: SBPC. Procedimentos de Coleta de Sangue Venoso. 
In: Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial para 
coleta de sangue venoso. 2. ed. Barueri, SP: Minhas Editora, 2010. p. 16-29.
Disponível em: https://youtu.be/T5oqEUOVYhk
Outros pontos a serem observados na coleta para hemoculturas
O volume ideal deve corresponder a 10% do volume total do frasco de coleta, ou 
seja, em um frasco de 40mL, deve-se coletar cerca de 4mL de sangue. Os frascos de 
10mL os mais indicados e o polianetolsulfonato de sódido (SPS) é o anticoagulante 
mais recomendado.
Quanto maior o volume de sangue inoculado no meio de cultura, por amos-
tra, melhor a recuperação do microrganismo, respeitando-se a proporção sangue/
meio citada, pois o sangue em desproporção com o meio pode inibir o crescimento 
de microrganismos.
Os frascos e o pedido médico devem estar identificados com o nome do paciente 
e hipótese diagnóstica (possível diagnóstico), e o frasco deve ser identificado com a 
hora e local da coleta.
As amostras de hemocultura não devem ser refrigeradas, devendo ser mantidas 
em temperatura ambiente e enviadas rapidamente ao laboratório.
Geralmente, três frascos são suficientes para testes de endocardite ou bacteremia, 
porém, a definição do número de frascos deve ser feita de acordo com a condição 
do paciente e tipo de exames solicitados. Não há necessidade nem benefício em se 
coletar mais de 4 amostras para o mesmo teste.
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UNIDADE Coleta, Transporte, Estocagem e Contagem de Microrganismos
Escarro
Nesse caso, é necessária a colaboração do paciente para a coleta do material, 
porém, sempre que possível, é interessante que o paciente esteja acompanhado por 
um enfermeiro ou fisioterapeuta.
Apesar de ser pouco utilizado, pois outras fontes apresentam resultados mais 
confiáveis, como hemocultura, lavado dos brônquios ou aspirado da traqueia, é im-
portante conhecer as recomendações para coleta ideal:
• Coletar escarro, de preferência de manhã, antes da refeição. Atenção, não co-
letar a saliva;
• O paciente deve escovar os dentes somente com água e enxaguar com água 
várias vezes a boca antes da coleta;
• Respirar profundamente e tossir vigorosamente;
• Recolher a amostra em um tubo estéril de boca larga;
• Caso a quantidade de amostra não seja suficiente, proceder à nebulização do 
paciente antes de realizar nova coleta (somente uma coleta ao dia);
• Se for suspeita de microbactérias ou fungos, coletar 3 dias seguidos.
Para pacientes que não conseguem escarrar, ou pacientes entubados, deve-se pro-
ceder à aspiração, que pode ser transtraqueal (ATT – aspirado transtraqueal) ou por 
sonda de aspiração. Um dos grandes problemas dessas coletas é o risco de o resultado 
refletir uma colonização do local de aspiração, podendo levar a um erro no tratamento.
O lavado broncoalveolar (BAL) é a técnica utilizada para pacientes submetidos à 
ventilação mecânica. É uma técnica mais confiável para investigações microbiológi-
cas do trato respiratório inferior.
Em todos os casos, recomenda-se o processamento da amostra em 30 minutos. 
Líquor
O exame realizado no líquido cefalorraquidiano é muito comum para pesquisas de 
microrganismos, especialmente os causadores de meningite. O líquido é coletado pela 
equipe médica especializada e deve ser imediatamente encaminhado ao laboratório, 
que procederá à sua análise. Caso somente um tubo de amostra seja coletado, essa 
amostra deve ser processada com prioridade. A amostra não pode ser refrigerada.
Feridas, abscessos e exsudatos
• Higienizar e descontaminar ao redor da lesão, utilizando soluções de iodo e 
solução fisiológica;
• Coletar o material na parte mais profunda da lesão, quando possível, aspirando 
com agulha;
• Somente utilizar o swab quando não for possível coletar com seringa.
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Tecidos
Os tecidos para análise podem ser extraídos de diversos locais, desde amostras de 
pele e tecido subcutâneo como amostras de feridas de queimaduras colonizadas ou 
não por microrganismos patogênicos, sendo biópsias mais profundas indicadas para 
evitar falsos resultados, ou outros, como tecido ósseo, lesões superficiais, mucosas, 
entre outros. Mas, para todos, é necessário preparar a superfície de forma adequada 
higienizando com preparações de iodo (tintura de iodo, PVP-I). 
Para mais detalhes sobre os processos de amostragem em diferentes tecidos, consulte o 
Guia da Microbiologia Clínica, p. 28 e 29. Disponível em: https://bit.ly/2UMyI3E
Fezes
Recomenda-se a coleta das fezes na fase aguda da doença e de preferência antes do uso 
de medicamentos. Após a coleta em frasco coletor apropriado, transferir o material para 
meio Cary Blair ou Salina tamponada para transporte. A quantidade equivalente a uma 
colher de sobremesa costuma ser suficiente para análise, sempre preferindo porções com 
mucosas ou com presença de sangue. A amostra que não for encaminhada imediatamente 
ao laboratório, deve ser conservada em refrigeração (4°C) por até 12 horas.
Há a possibilidade de realizar swab umedecido em solução fisiológica estéril na 
região do reto. O swab deve ser inserido na região do reto e a coleta feita em movi-
mentos circulares, certificando que existe coloração de fezes no swab. Encaminhar 
o material coletado ao laboratório ou adicionar em meio de transporte adequado.
Urina
É um exame não invasivo muito importante no diagnóstico de doenças renais e não 
renais. Coleta-se preferencialmente a primeira urina da manhã, desprezando o primeiro 
jato. Quando não é possível coletar a primeira urina, coletar após retenção e duas horas.
Técnicas de Coleta
• Higienizar mãos e antebraços;
• Higienizar a região genital com água e sabão, ou lenço umedecido antisséptico 
caso a coleta seja realizada no laboratório;
• Utilizar frasco coletor;
• Coletar cerca de 50mL de urina (no caso de mulheres, orientar a separar os 
grandes lábios para a coleta);
• O ideal é que os exames de rotina sejam realizados o mais rápido possível após 
a coleta, mas para os casos em que a coleta é feita em casa, orientar o pacien-
te para manter a amostra na geladeira e encaminhar o mais rápido possível 
ao laboratório.
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UNIDADE Coleta, Transporte, Estocagem e Contagem de Microrganismos
Para crianças que ainda não conseguem controlar a micção, utilizar sacos cole-
tores estéreis, fazendo a troca do saco a cada 30 minutos. Se, ainda assim, não for 
possível realizar a coleta, o médico pode proceder à punção vesical suprapúbica para 
retirada do material.
Secreções
As secreções são fluidos corporais produzidos de acordo com a necessidade, 
como a lágrima ou a saliva. É através da secreção que as células liberam ao meio 
externo as substâncias produzidas. Nas doenças, as secreções podem ser liberadas 
de forma alterada, e podem ser utilizadas como meio para investigação e diagnóstico 
dessas doenças.
As secreções oculares devem ser coletadas com swab, antes do uso de medica-
ção, na parte interna da pálpebra inferior, retirando antes a secreção superficial, já 
as secreções de ouvido são provenientes do ouvido externo e médioe a coleta tem 
algumas particularidades, de acordo como local da coleta.
Para coleta no ouvido externo, inicia-se retirando a secreção superficial com au-
xílio de swab umedecido em solução fisiológica estéril e a coleta realizada com outro 
swab, em movimentos de rotação. O material coletado deve ser inserido em meio de 
transporte (Stuart).
Quando for no ouvido interno, a coleta é feita com seringa para realizar a punção 
na membrana do tímpano ou outro sistema de aspiração. Caso a membrana esteja 
rompida, o médico pode coletar com espéculo ou cone do otoscópio. Em ambos os 
casos, realizar a limpeza da secreção superficial como descrito anteriormente. 
Tenha acesso aos procedimentos completos de coleta no material de Microbiologia Clínica – 
Módulo 4: Procedimentos Laboratoriais: da Requisição do Exame à Análise Microbiológica e 
Laudo Final, da página 19 até 40, disponível em: https://bit.ly/2UO6upm
Processamento das Amostras
Após o recebimento das amostras, elas serão separadas de acordo com sua carac-
terística. Algumas precisam ser coradas e outras podem ser analisadas diretamente, 
sem coloração.
Meio Direto sem Coloração
É possível realizar a análise direta sem coloração, para os meios de tipo salina, 
hidróxido de potássio, exame em campo escuro e tinta de China, conforme a tabela 
a seguir:
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Tabela 3
Meio Descrição Indicação
Salina
A amostra (colônia) é adicionada à lâmina com 1 a 2 
gotas de solução fisiológica e coberta por lamínula, 
para observação em 40x ou 100x. 
É possível observar morfologia bacteriana, motili-
dade celular. 
Indicada para pesquisas de Trichomonas, fungos leve-
duriformes e filamentosos. 
Hidróxido de 
 Potássio
A amostra é adicionada à lâmina com 1 a 2 gotas de so-
lução de hidróxido de potássio (10 – 20%) e coberta por 
lamínula. Após 30 minutos, deve-se aquecer a lamínula 
ligeiramente para agilizar o clareamento. Observar em 
aumento de 10x ou 40x, fechando o diafragma. 
Este processo auxilia a microscopia pois destaca estru-
turas ao dissolver a queratina e o muco. 
Indicada para pesquisa de fungos leveduriformes e fi-
lamentosos em amostras de muco, pele e tecido ósseo.
Campo escuro
Necessita de um microscópio com condensador de 
campo escuro, e o preparo já descrito para salina. 
A observação deve ser feita por imersão em 100x, de 
preferência objetiva 100x com íris. Observar as parti-
cularidades da coleta (exsudato, urina etc.). 
Utilizada para observar motilidade de bactérias que 
não são observadas com a salina, como a Leptospira sp., 
Campylobacter sp. e Treponema pallidum.
Tinta da China
A amostra de colônia ou sedimento do líquor deve ser 
misturado com 1 gota da tinta de china. O resultado 
desta mistura deve ser adicionado de forma que fique 
uma fina camada entre a lâmina e lamínula (pode se 
adicionar salina para deixar mais fina). Observar em 
aumento de 10x ou 40x. 
Utilizada para pesquisa no líquor de criptococos. 
O fundo negro permite a visualização da cápsula. 
Fonte: Adaptado de ANVISA
Coloração de GRAM
Método centenário mais utilizado em bacteriologia, a coloração de Gram é utiliza-
da na classificação bacteriana através do comportamento estrutural em relação aos 
corantes utilizados. Recebeu esse nome em homenagem ao seu desenvolvedor, o 
médico dinamarquês Hans Cristian Joaquim Gram. Permite caracterizar as bactérias 
de acordo com seu tamanho, formato celular e diferença de coloração. 
É um teste rápido e eficiente, proporcionando um acerto de cerca de 80% nos 
diagnósticos sem a necessidade de testes adicionais, além de baixo custo e instala-
ção simples.
Para sua execução, é necessário uma bancada com água corrente, um bico de 
Bunsen (que pode ser substituído por uma lamparina), microscópio com objetiva de 
imersão e os corantes específicos.
Outro ponto clínico importante dessa coloração é a diferenciação das bactérias 
em Gram-positivas e Gram-negativas, classificação obtida de acordo com a colo-
ração da parede celular bacterina e de extrema importância na escolha do agente 
antimicrobiano adequado.
Utiliza-se na coloração o cristal violeta (violeta de metila, ou em manuais mais 
antigos, a violeta genciana). A vantagem da violeta de metila é dispensar a chama 
para fixação. Como diferenciado, utilizamos o álcool etílico absoluto (99,5°GL), mas 
alguns métodos mais antigos indicam o uso da acetona, ou ainda, uma mistura de 
corantes, métodos que estão caindo em desuso. 
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UNIDADE Coleta, Transporte, Estocagem e Contagem de Microrganismos
O corante secundário utilizado atualmente é a safranina, que substitui a fucsina feni-
cada que apresenta uma coloração diferencial mais nítida e permite melhor diferencia-
ção das bactérias positivas das negativas. Outra grande diferença entre esses dois coran-
tes é a solubilidade, sendo a safranina solúvel em água enquanto a fucsina é insolúvel.
Saiba mais sobre o preparo dos corantes em “Técnica de Coloração de Gram”, 1997 – p. 17 
a 20, disponível em: https://bit.ly/2V8CVxO
Ácido Teicóico
Lipoteicóico
Lipoproteína
Peptidoglicano (mureína)
Peptidoglicano (mureína)
Parede celular
Poro Lipopolissacarídeo
Gram-negativa
Gram-positiva
Parede celular
Membrana celular
Membrana celular
Figura 5 – Estrutura básica da parede celular Gram-negativa e Gram-positiva
Fonte: Adaptado de epsjv.fiocruz.br, p. 1229
O processo de coloração consiste em corar um esfregaço por 1 minuto com o 
corante violeta (cristal violeta, violeta fenicada ou violenta genciana), podendo ou 
não lavar a lâmina após esta etapa (dependendo do autor). Após escorrer, cobre-se 
o esfregaço com uma solução de lugol, também por 1 minuto, seguida por lavagem 
(também opcional dependendo da referência). Após essas duas colorações iniciais, 
descora-se com álcool absoluto por cerca de 30 segundos e seguindo com lavagem 
com água. A última etapa da coloração é com safranina ou fucsina e lavar. Após 
secar, observar por imersão em aumento de 100x.
Após a coloração, as bactérias Gram-negativa irão corar-se de vermelho e as 
Gram-positivas em roxo. Você verá mais detalhes sobre a técnica de coloração no 
material de laboratório de microbiologia geral e clínica. 
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Figura 6 – Bactérias Gram-positivas e Gram-negativas após a coloração de Gram
F onte: Adaptado de Wikimedia Commons
Coloração de Gram , disponível em: https://youtu.be/30D1FUyTccU
Contagem Total de 
Microrganismos em Placas
É necessário saber o tamanho da população de microrganismos ou somente sua 
presença em determinados locais já indica uma condição de “perigo”? Em diversas 
situações, é importante conhecer o tamanho da população de microrganismos, por 
exemplo, ao se trabalhar com fermentações, no acompanhamento de tratamentos 
antimicrobianos, na pesquisa de novos agentes, no controle de qualidade de água e 
alimentos, nas avaliações de eficácia de métodos de higiene ou simplesmente para 
avaliar as condições clínicas de um paciente, pois a simples presença de um micror-
ganismo não indica que uma infecção está instalada.
Podemos quantificar o tamanho da colônia de forma direta, ou seja, através da 
contagem do número de células, ou de forma indireta, por análises como turbidez, 
peso seco ou concentração de marcadores químicos (determinadas proteínas, enzi-
mas ou intermediários metabólicos).
Contagem direta
A contagem direta é realizada com auxílio de câmaras de contagem, como a 
câmara de Neubauer e a de Petroff-Hauser. Em ambas, uma pequena quantidade 
da amostra em suspensão é adicionada ao dispositivo e o número de células, feita a 
contagem da parcela e o tamanho da cultura determinado matematicamente.
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UNIDADE Coleta, Transporte, Estocagem e Contagem de Microrganismos
É um método rápido, mas tem como desvantagem não diferenciar as células viá-
veis das células mortas e pouca sensibilidade para populações menores (com menos 
de 1 milhão de células).
Procedimento para contagem de células em câmara de Neubauer. 
Disponível em: https://bit.ly/2Xh7VhS
Figura 7 – Contagem microscópica diretade bactérias, 
utilizando um contador de células de Petroff-Hausser
Fonte: TORTORA, 2017, p. 171
O número médio de células no quadrado grande multiplicado pelo fator 
1.250.000 fornece o número de bactérias por mililitro.
Contagem eletrônica
 A contagem eletrônica é um processo mais rápido, no qual a amostra em sus-
pensão passa por um pequeno orifício que contém um fluxo de elétrons. As células, 
como moléculas orgânicas, não são boas condutoras e sua passagem altera a resis-
tência do fluído. Essa alteração do fluxo de elétrons é registrada, relacionando-a com 
o número de células que passam pelo orifício.
Assim como o método de contagem direta, também tem a mesma desvantagem 
de detectar células viáveis e não viáveis, ou ainda, outros contaminantes inertes pre-
sentes na amostra.
Análise espectrofotométrica ou método turbidimétrico
A análise espectrofotométrica é um método indireto, no qual a quantidade de 
microrganismos é estimada através da análise de turbidez da amostra. A turbidez 
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se relaciona à concentração de células na amostra, quanto maior o número de 
células, mais turva é a solução. Esse método mede a transmitância (luz transmi-
tida) no espectrofotômetro a 600ηm. A quantidade de luz que chega ao detector 
do espectrofotô metro é inversamente proporcional ao nú mero de bacté rias (quanto 
menos luz chega ao detector, mais células estão presentes na amostra). É possível 
realizar as leituras de absorba ̂ncia, em base logarítmica que podem ser ú teis para a 
montagem de gráficos.
Figura 8 – Determinação do nuḿero de bacteŕias por turbidimetria
Fonte: TORTORA, 2017, p. 171
Contagem em placas
A vantagem da contagem em placas é a possibilidade de quantificar as células 
viáveis, porém, demora no mínimo 24 horas para ocorrer a formação de colônias, 
o que podemos considerar uma desvantagem, especialmente quando não é possível 
esperar tanto para o resultado, por exemplo, no caso de controle de qualidade de 
produtos perecíveis como o leite. Esse método considera que cada bactéria cresce e 
se multiplica para formar uma colônia, apesar de não ser exatamente desse modo, 
pois algumas bactérias formam agregados ou cadeias. Esse conceito de que uma 
bactéria forma a colônia deu origem à unidade UFC (unidade formadora de colônias). 
Não se recomenda esse método para mais do que 250 colônias, devendo ser realiza-
das as diluições seriadas como nos outros métodos quando necessário. 
Filtração
Técnica utilizada quando a quantidade de bactérias a ser contada é muito peque-
na, como em análise de água. Utiliza-se microfiltração por membrana e as bactérias 
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UNIDADE Coleta, Transporte, Estocagem e Contagem de Microrganismos
retidas no filtro são transferidas para uma placa com meio de cultura para que pos-
sam se desenvolver.
Fora essas citadas, outros métodos ainda existem, como o método do número 
mais provável, que realiza diversas diluições até que não exista mais nenhuma bacté-
ria na diluição, ou ainda a contagem microscópica direta, onde um volume definido 
é adicionado a uma lâmina e a observação é feita por objetiva de imersão.
Todos esses métodos podem ser usados para contagem dos microrganismos. 
Alguns têm aplicações específicas, como a contagem do número de microrganismos 
no leite ou numa cultura pura, ou quando é necessário determinar a população de 
células viáveis. Sempre observar qual o método mais adequado, de acordo com as 
características da amostra.
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Material Complementar
Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade:
 Vídeos
Coleta – Análise Microbiológica e Fisíco-Química
Vale lembrar que análises microbiológicas não são realizadas somente em fluidos 
biológicos. O vídeo a seguir apresenta algumas informações sobre a coleta de água 
para análise microbiológica.
https://youtu.be/VH1aV1U8WLY
Laboratório Del Porto – M1 V47 – Centrifugação, alíquota e tubos de transporte de amostras
https://youtu.be/F5OMN5Hh4Wc
Guia Nacional de Coleta e Preservação de Amostras – Português
https://youtu.be/AhhatXAJIdo
Mini curso de interpretação de hemograma – Telessaúde Goiás
https://youtu.be/7ynU-v-KJTE
 Leitura
Farmacia e Controle das Infecções Hospitalares
https://bit.ly/2wjQ7aA
Controle Microbiológico do Ambiente Interno de Farmácias de Manipulação
https://bit.ly/2UNaF4E
Microbiologia aplicada – e-TEC
https://bit.ly/2yGRDo9
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UNIDADE Coleta, Transporte, Estocagem e Contagem de Microrganismos
Referências
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Microbiologia Clínica para o 
Controle de Infecção Relacionada à Assistência à Saúde. Módulo 4: Procedi-
mentos Laboratoriais: da requisição do exame à análise microbiológica e laudo final/
Agência Nacional de Vigilância Sanitária – Brasília: Anvisa, 2013. Disponível em: 
<http://www.saude.mt.gov.br/upload/controle-infeccoes/pasta13/modulo4.pdf>. 
Acesso em: fev. 2020.
_______. Ministério da Saúde. Programa Nacional de Doenças Sexualmente 
Transmissíveis e AIDS. Técnica de Coloração de Gram. Brasília: Ministério da Saú-
de, 1997. Disponível em: <http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/115_03gram.
pdf>. Acesso em fev. 2020.
HOITMAN, J.; TRAVASSOS, L. J. Tratado de microbiologia. V. 1. São Paulo: 
Manole, 1971. 
JAY, J. M. Microbiologia de alimentos. São Paulo: Artmed, 2005.
MOREIRA, J. L. B.; CARVALHO, C. V. M.; FROTA, C. C. Visualização bacteria-
na e colorações. Fortaleza: Imprensa Universitária, 2015. Disponível em: <http://
www.repositorio.ufc.br/bitstream/riufc/16672/1/2015_liv_jlbmoreira.pdf>. Acesso 
em: fev. 2020.
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 12. ed. Porto Alegre : 
Artmed, 2017.
TRABULSI, L. R.; TOLEDO, M. R. F. Microbiologia. 2. ed. São Paulo: Atheneu, 1991.
VIEIRA, D. A. P; FERNANDES, N. C. A. Q. Microbiologia Aplicada. Inhumas: 
IFG; Santa Maria: Universidade Federal de Santa Maria, 2012. Disponível em: 
<https://www.ufsm.br/unidades-universitarias/ctism/cte/wp-content/uploads/si-
tes/413/2018/12/04_microbiologia_aplicada.pdf>. Acesso em: fev. 2020.
Sites visitados
<http://www.epsjv.fiocruz.br/sites/default/files/cap3.pdf>.
<http://www.ufjf.br/nupis/files/2016/04/aula-10-Preparo-de-amostras.pdf>.
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