Microbiologia Clínica Portfólio

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Microbiologia Clínica
Portfólio
 (
cadeias
)Morfologia e arranjos bacterianos
cocos	diplococos
 (
cachos
)tétrades
Características morfológicas: Cocos Característica tintorial: Gram positivo Arranjo: Cachos
Exemplos: Staphylococcus aureus; Staphylococcus epidermidis; Staphylococcus saprophyticus.
Características morfológicas: Cocos Característica tintorial: Gram negativo Arranjo: Cadeias
Exemplos: N. meningitidis; N. gonorrhoeae.
paliçadas
bacilos	diplobacilos
cadeias
Características morfológicas: Bacilos Característica tintorial: Gram positivo Arranjo: Bacilos e diplobacilos Exemplos: Clostridium spp; Bacillus spp.
Características morfológicas: Bacilos Característica tintorial: Gram negativo Arranjo: Diplobacilos
Exemplos: Enterobacteriaceae (Escherichia coli; Klebsiella pneumoniae; Salmonella spp.
Características morfológicas: Bacilos Característica tintorial: Gram-positivos (BGP) Exemplos: Lactobacillus sppp.; Clostridium spp.; Bacillus spp.; Lysteria monocitogenes
Características morfológicas: Cocosbacilos Característica tintorial: Gram negativa Exemplos: Gardnerella vaginalis; Haemophylus influenzae
Espiralados
espiroquetas
Cultura de urina
Amostra - Coleta
· Fazer a higienização e coletar o jato médio da primeira urina da manhã ou o jato médio de qualquer urina com intervalo de 3-4 horas após a última micção.
· Colher no mínimo 20 mL, no máximo 1 mL.
· Coletar preferencialmente antes de iniciar o uso de antibióticos.
Cultura de urina
Armazenamento e transporte
· Colocar a urina coletada no refrigerador a 2-8°C até enviar ao laboratório, caso não seja analisada de imediato, deverá ser refrigerada por até 24 horas.
· O tempo de coleta e entrega do material não deve exceder 2 horas.
Meio de cultura
Ágar CLED
· Cistina-lactose-eletrólito-deficiente
· Azul de brometimol
· Não seletivo
Procedimento
1. Identificar a placa com nome, data e número de amostra;
2. Homogeneizar a urina e introduzir a alça de forma vertical de 2 a 3 vezes (através da chama);
3. A amostra deve ser semeada de forma central - do centro para cima e do centro para baixo, e vertical - formando “zig-zag” até cobrir todo o ágar;
4. Incubar na estufa de 35 a 37°C por 18 a 24 horas.
Preparo de lâminas
1. Colheita de uma colônia pura e isolada com a alça descartável;
2. Passar na lâmina a alça em movimento de círculo para boa espalhabilidade da amostra;
3. Colocar uma gota de solução salina e espalhar com o mesmo movimento;
4. Levar para secagem na estufa.
Avaliação dos resultados
Após o período de incubação deve-se analisar os seguintes pontos: pureza da cultura, o aspecto do meio (se há fermentação ou não da lactose), as características das colônias (pequenas, grandes, mucoides, etc.), o número e tipos de colônias e correlacionar o resultado da cultura com o do Gram da gota de urina e da cultura.
Lâminas
Gota de urina
 	 Bacilo
Gram Negativo
Urina Com cultura
Cocos em cachos Gram Positivo
Coloração de Gram
Reagentes:
· Cristal Violeta ou Violeta de Metila (Corante primário);
· Lugol - Iodo metálico e iodeto de potássio;
· Álcool absoluto (Descorante);
· Fucsina ou safranina (Corante secundário-cora as bactérias Gram negativas).
Procedimento:
Coloração de Gram
· Cobrir a lâmina com cristal violeta;
· Após 1 minuto lavar com água destilada;
· Cobrir o esfregaço com lugol;
· Após 1 minuto, descorar com álcool absoluto até que a cor violeta não seja mais arrastada;
· Lavar com água destilada;
· Cobrir com fucsina por 1 minuto;
· Lavar com água destilada;
· Secar cuidadosamente a lâmina.
Provas Bioquímicas
O estudo de características bioquímicas é importante para a identificação das bactérias, pois através das provas bioquímicas pode ser detectadas características do metabolismo bacteriano, referente a capacidade de utilizar de alguns substratos como açúcares, proteínas e lipídios.
Prova da catalase
A presença da catalase permite separar os estreptococos catalase negativa de outros cocos Gram-positivos produtores de catalase, por exemplo, estafilococos. A enzima catalase converte o peróxido de hidrogênio em oxigênio e água. A liberação do oxigênio se observa pela formação de bolhas.
Procedimento
· Com uma agulha ou alça bacteriológica, transferir 2-3 colônias bem isoladas para o centro de uma lâmina de vidro previamente limpa e desengordurada fazendo movimentos circulares;
· Adicionar uma a duas gotas de peróxido de hidrogênio 3% e observar a produção de bolhas. - Caso seja usada alça ou agulha descartável, o reagente pode ser adicionado primeiro, seguido pelas colônias.
Entretanto, se a alça ou agulha contiver ferro, esta não deve tocar no reagente porque pode produzir reações falso-positivas.
· Se a bactéria tiver sido cultivada em agar sangue, ter o cuidado para não retirar partes do meio junto com a colônia, pois pode resultar em uma reação falso positiva fraca, já que o sangue tem atividade de catalase.
Reagente: Peróxido de hidrogênio a 3% mantido sob refrigeração. A produção de bolhas indica reação positiva.
Prova da oxidase
O teste de oxidase é um procedimento qualitativo para determinar a presença ou ausência de atividade de oxidase no citocromo C nas bactérias. A prova da oxidase utiliza um reativo corante, o dicloridrato de p-fenilenodiamina, que é incolor no estado reduzido, mas na presença da enzima citocromo-oxidase, é oxidado, formando um composto de cor que varia do rosa a roxo chamado indofenol.
Procedimento
· Pode ser realizada usando tiras de papel impregnadas com o reativo: Umedecer o papel reagente levemente com água destilada estéril;
· Com uma alça descartável ou de platina, transferir uma alçada da colônia suspeita na zona reagente do papel;
· Pode-se saturar um pedaço de papel de filtro com o reagente líquido e passar a alça com a colônia suspeita;
· As colônias bacterianas que produzem oxidase desenvolvem, em menos de 15 segundos, uma cor azul escura no local de inoculação. Burkholderia cepacia e Stenotrophomonas maltofilia podem apresentar reação fraca e lenta de até 1 minuto.
Não deve ser usada alça de níquel-cromo porque os produtos de oxidação formados na superfície ao serem esterilizados na chama, podem produzir reações falso- positivas.
Reagente: Dicloridrato de Tetrametil-p-fenilenodiamina, 1% (reativo de Kovacs); Dicloridrato de Dimetil-p-fenilenodiamina 1%, (reativo de Gordon e Macleod); Discos e tiras comerciais (Difco, BBL,etc).
Prova TSI
É usado para a diferenciação de bacilos entéricos gram-negativos baseados na fermentação dos carboidratos e produção de sulfeto de hidrogênio.
Reações TSI/KIA
Prova SIM
Objetivos: Produção de Sulfeto de hidrogênio, Indol e Motilidade.
Indol:Algumas bactérias possuem a enzima triptofanase que degrada o triptofano contido no meio com produção de indol, ácido pirúvico e amônia (NH3). O indol é detectado por meio do desenvolvimento de cor vermelha após adição de 5 gotas de uma solução contendo pdimetilaminobenzaldeído (reativo de kovacs). Ex. Escherichia coli; Klebsiella oxytoca, Proteus vulgaris.
Produção de sulfeto de Hidrogênio (H2S): O meio contém uma fonte de enxofre, o tiossulfato de sódio e citrato férrico. Bactérias que apresentam o sistema enzimático para retirar enxofre do tiossulfato e transferir para ions H+ produzem H2S. Este, reage com os sais de ferro formando um precipitado negro caracterizando prova positiva. Ex. Salmonella spp., Proteus spp., Citrobacter freundii, Edwardsiella tarda.
Motilidade:As bactérias movem-se por meio de seus flagelos que estão presentes mais frequentemente nos bacilos Gram-negativos. Os cocos raramente os contêm. A bactéria que se movimenta a partir da linha inicial de inoculação deixa o meio turvo e o local da picada difuso, evidenciando a presença de flagelos e consequentemente, de motilidade.Os meios para prova de motilidade são semissólidos.
Shigella e Klebsiella são tipicamente imóveis.
Prova Citrato
Objetivo: Pesquisa se a bactéria utiliza o citrato como única fonte de carbono no seu metabolismo.É utilizado o meio Citrato de Simmons que contém citrato de sódio, fosfato de amônia e azul de bromotimol como indicador de pH. O meio deve ser isento de qualquer outra fonte de carbono. Bactérias que utilizam o citrato utilizam também o fosfato de amônia resultando na formação de hidróxido de amônia que alcaliniza o meio e vira a cor do indicar de pH para azul. Diferencia bactérias citrato positivas como Klebsiella spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Salmonella spp., Providencia spp., de bactérias que não conseguem usar o citrato como a Escherichia coli. O desenvolvimento de cor azul ou crescimento de colônias ao longo da estria de inoculação significa prova positiva.
Prova Urease
O teste da urease é um exame laboratorial que pesquisa a produção da enzima urease por algumas bactérias, auxiliando no processo de identificação.
Prova usada para diferenciar bactérias que apresentam a enzima urease como Proteus spp. (reação rápida em todo o meio) e Klebsiella spp. (degradação lenta no ápice e gradualmente no restante do meio), Morganella morganii e Providencia spp., e bacilos Gram negativos não fermentadores de outras que não apresentam.
Podem ser usados os meios: Ureia de Stuart e Ureia de Christensen.
Prova da Fenilalanina Desaminase
Objetivo:Pesquisa a produção da enzima fenilalanina desaminase.
Bactérias que produzem essa enzima desaminam a fenilalanina, formando ácido fenilpirúvico, que se evidencia na adição de 5 gotas de cloreto férrico 10%, formando uma coloração verde-bandeira.
Prova das Descarboxilases
Objetivo: Pesquisa a produção de enzimas descarboxilases dos aminoácidos Arginina, Lisina e Ornitina.
Procedimento:
- Os meios contendo os respectivos aminoácidos e um tubo controle que contém somente o meio-base são inoculados com o auxílio de uma alça ou agulha. Adicionar aproximadamente 10 gotas de óleo mineral para que a reação ocorra na ausência de oxigênio.
– Incubar a 36 ± 1 ºC por 24 a 48 horas.
Primeiramente ocorre a fermentação da pequena quantidade de glicose presente no meio com produção de ácido e viragem do indicador de pH púrpura de bromocresol para amarelo. Se a bactéria produzir a enzima, o aminoácido será descarboxilado, formando-se amina, que sendo alcalina, mudará a cor do indicador de pH para púrpura novamente. Se ela não produzir a enzima, não haverá descarboxilação e o tubo permanecerá amarelo, assim como o controle, que não tem aminoácido para ser descarboxilado.