SEXAGEM DE ESPERMATOZOIDES E EMBRIÕES

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BIOTECNOLOGIAS DA REPRODUÇÃO
Maria Eduarda Rocha 
TÉCNICAS DE SEXAGEM DE ESPERMATOZOIDES E EMBRIÕES 
O macho que dita o sexo do indivíduo, pois possui a capacidade de levar o cromossomo X ou o cromossomo Y, determinando então se será macho (XY) ou fêmea (XX). Então para determinar o sexo desejado, teoricamente o mais fácil é sexar o espermatozoide. 
Existe uma diferença de tamanho entre o cromossomo X (mais pesado e maior) e Y (mais leve e menor).
TÉCNICAS DE SEXAGEM DE ESPERMATOZOIDES:
- O sêmen sexado é capaz de produzir, propositalmente, descendentes machos ou fêmeas, atendendo o interesse do produtor, sendo formado quase que exclusivamente por espermatozóides portadores do cromossomo X ou Y (que darão origem ao sexo feminino ou masculino, respectivamente)
- Separação automatizada das populações de espermatozoides baseado no tipo de cromossomo da célula (X ou Y)
- Seleção do sexo na concepção (produção direcionada de machos ou fêmeas) 
- O sêmen sexado se tornou comercialmente disponível em 2006, utilizando-se o método de citometria de fluxo para a separação de células
- Vantagens na utilização do sêmen sexado: 
· A principal vantagem deriva da liberdade do pecuarista para escolher o sexo da cria em função dos interesses do seu negócio
· Gado de corte: aumentar o impacto na eficiência produtiva (macho)
· Gado de leite: aumentar o impacto na eficiência produtiva (fêmea)
· Matrizes potenciais: novilhas de reposição apenas de animais geneticamente superiores 
· Outras vantagens seriam uma maior intensidade de seleção (em razão do maior número de descendentes do sexo desejado), acelerando o melhoramento genético do rebanho
SEXAGEM ESPERMÁTICA POR CITOMETRIA DE FLUXO:
· Comercialmente é a única técnica aplicada 
· Marcação do DNA e separação pelo tamanho da cabeça do espermatozoide 
· Desenvolvida por Larry A. Johnson (1989) no USDA, conhecida mundialmente e patenteada por BeltsvilleSpermSexing Technology 
· Cromossomos do espermatozoide bovino:
· A variação de tamanho entre o cromossomo X e Y depende da espécie. 
· Na espécie bovina essa variação é de 3,8% (o cromossomo X é 3,8% maior que o cromossomo Y).
· A separação dos espermatozoides para a produção de machos (cromossomo Y) ou fêmeas (cromossomo X) é possível devido à diferença no conteúdo de DNA dessas células (o espermatozoide que gera fêmea possui 3,8% mais material genético que o espermatozoide que gera macho)
· Técnica:
· Com o uso da citometria de fluxo para separação de células é possível separar os dois tipos de espermatozoides com alta confiabilidade. O citômetro de fluxo associa a emissão de raios laser com coloração diferencial dos espermatozoides viáveis e não viáveis e com as forças hidrodinâmicas que direcionam o espermatozoide durante o processo de separação dos espermatozoides X e Y
· O método mais utilizado, atualmente, é por citometria de fluxo. A técnica consiste em separar os espermatozoides baseado na diferença de conteúdo de DNA dos cromossomos X e Y (o cromossomo bovino X contém 3,8% mais DNA do que o cromossomo Y). Os espermatozoides são submetidos a um corante fluorescente que adere ao DNA. Em seguida, passam em um aparelho (citômetro de fluxo) capaz de identificar e separar as células de acordo com o grau de fluorescência emitida
· O laser lê o tamanho da célula: tamanho maior; tamanho menor 
· O citômetro é capaz de separar o que é cromossomo X e Y, e também descartar as células lesionadas (os espermatozoides corados em vermelho serão descartados, pois significa que a membrana plasmática não está íntegra) 
· A leitura do laser na célula corada é muito precisa, então a confiabilidade da técnica é alta, o que a torna comercialmente viável e aplicável. 
· A máquina consegue separar em macho (Y) e fêmea (X) simultaneamente, mas pode-se programar também para separar apenas fêmea ou apenas macho (ex: se optar por separar apenas fêmea, os machos são descartados junto com as células lesionadas)
· Além de realizar a sexagem, essa técnica também seleciona as melhores células.
· Mas existem algumas limitações, como o preço e também o fato que o próprio processamento em si causa um dano mecânico na célula
· Se os dois picos de separação estiverem muito próximos, significa que a acurácia de separação está baixa. 
· Muito importante ter um técnico qualificado que entenda e fique o tempo todo calibrando e verificando se a máquina está calibrada, pois isso interfere no sucesso da técnica.
· Gargalos do sêmen sexado: 
· Menor fertilidade devido à injúria sofrida pelo espermatozoide no processamento e devido à menor concentração na dose do sêmen sexado (taxa de concepção entre 10 a 20% menor em relação ao sêmen não sexado) 
· CONCENTRAÇÃO: 
· Dose inseminante na palheta de sêmen de bovino convencional: 10 milhões de células 
· Dose do sêmen sexado normal: 2,1 milhões de células 
· Ou seja, a dose do sêmen sexado é bem menor, e aumentar a dose não é economicamente viável
· Particularidades do indivíduo (tem touro que não responde bem à sexagem, principalmente quando já não há sucesso no congelamento do sêmen desse animal)
· Alguns touros não produzem um ejaculado apto para a separação do sexo dos espermatozoides
· Efeitos da técnica de sexagem aos espermatozoides: 
· Alta pressão em velocidade 
· Força que sai do injetor
· Estiramento do espermatozoide para a formação da gota 
· Exposição ao laser UV 
· Carga elétrica na qual o espermatozoide é submetido 
· Desaceleração do espermatozoide ao chegar no fundo do tubo de coleta 
· Centrifugação após saída da máquina, para concentrar as células e depois congelar 
· Mudanças na composição dos diluidores (pH e osmolaridade)
· Alta diluição, baixa concentração e baixo contato com o plasma seminal
· Congelação (e todas as alterações celulares que ocorrem durante o processo) 
· A meia vida do sêmen é curta após a descongelação! Por isso, a inseminação com sêmen sexado deve ser “atrasada”, para ser feita o mais próximo possível da ovulação, em tempo diferente do que é feito com o sêmen convencional
· Resultados com o uso do sêmen sexado:
· 2,1 milhões de espermatozoides por palheta 
· Dose inseminante 
· Espermatozoides com membrana plasmática lesada são separados no momento da sexagem 
· Categoria animal (vacas x novilhas)
· Efeito do próprio animal (tem sêmen que não congela bem, e também não apresenta bom resultado na sexagem)
· Qual taxa de prenhez pode ser esperada com sêmen sexado em uma propriedade com bom manejo?
· Mesmo no sêmen convencional a resposta é complexa
· Sexado – 70 a 80% do controle 
· Ex: 70% sêmen convencional x 50% sêmen sexado 
· “Sexado Ultra – Sexed Ultra 4M”: 
- Aumento da dose de espermatozoide na palheta 
- Presença de um diluidor diferente 
- Melhor taxa de prenhez
· Em equinos:
· Tem a possibilidade! Mas não tem sêmen sexado comercialmente, pois já existe uma alta variabilidade no processo de congelação por si só, então ao sexar, não apresenta muito sucesso na congelação após a sexagem.
· Existem outras técnicas de tentativa de separação dos cromossomos, mas comercialmente não são aplicados (imunosexagem e gradiente de densidade) 
SEXAGEM ESPERMÁTICA POR IMUNOSEXAGEM:
· Antígeno HY (presente apenas no cromossomo Y)
· Separação por proteína de membrana 
· “Agride” menos as células 
· Não tão eficiente (aprox. 70%)
SEXAGEM ESPERMÁTICA POR CENTRIFUGAÇÃO EM GRADIENTE DE DENSIDADE: 
· Baseada no maior peso do espermatozoide X devido a maior quantidade de DNA 
· O sêmen é colocado num meio gradiente e é centrifugado (X fica no fundo porque é mais pesado; Y fica na superfície porque é mais leve)
· Método muito manual 
· Há separação, mas não tem acurácia tão alta quanto a citometria de fluxo 
· “Agride” menos os espermatozoides (quando comparado à citometria de fluxo)
· Recupera-se em média 5,5% dos espermatozoides descongelados submetidos ao processo de sexagem 
· Também seleciona as células com maior motilidade (batimento flagelar)
· Vantagem: possível realizar a campo (necessário apenas centrífuga e gradiente de densidade) 
· Não separa bem os espermatozoidesX e Y! 
TÉCNICAS DE SEXAGEM DE EMBRIÕES:
- Geralmente faz-se sexagem em embriões de FIV 
SEXAGEM EMBRIONÁRIA POR PCR: 
· Biópsia do blastocisto e PCR para identificação do sexo 
· Técnica utilizada comercialmente
· Possível realizar em pouco tempo (5 horas) e não precisa necessariamente congelar 
· Biópsias contendo 1 a 3 células, com 6 a 7 dias de desenvolvimento 
· Taxa de gestação de embriões biopsados é semelhante a de embriões não biopsados (variável)
SEXAGEM EMBRIONÁRIA POR ANÁLISE CITOGENÉTICA (CARIÓTIPO):
· Biópsia do blastocisto + cariotipagem (visualização dos cromossomos) 
· Demorado 
· Depende do estágio de divisão celular que a célula está 
· Métodos tentam aumentar o número de fêmeas ou machos 
durante a PIVE: 
· Velocidade de desenvolvimento 
· Alterações na concentração de glicose 
· DNP
· Atmosfera de oxigênio 
· Coloração com BCB 
· Expressão do gene G6PD durante o cultivo in vitro de embriões bovinos