TÉCNICAS MOLECULARES

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Técnicas
M�leculares
Utilizam os ácidos nucleicos -DNA ou
RNA- provenientes de amostras biológicas
como matéria-prima para a realização dos
mais variados procedimentos.
APLICABILIDADE
❖ Doenças genéticas.
❖ Doenças infecciosas.
❖ Investigação forense.
❖ Mapeamento genético.
❖ Teste de paternidade.
ONDE COLETAR AS CÉLULAS?
De diversos materiais biológicos, como:
sangue, mucosa, pele, saliva, raiz do
cabelo (presença de dna mitocondrial),
muco, etc.
EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DO DNA
Existem vários protocolos de extração:
❖ Molécula desejada (dna/rna), o
tipo de amostra.
❖ O grau de pureza e o rendimento
desejado.
❖ Disponibilidade de recursos para
sua realização.
CONSERVAÇÃO E PREPARAÇÃO
❖ Congelamento.
❖ Reagentes conservantes.
❖ Centrifugação de amostras
líquidas.
❖ Maceração de amostras sólidas.
primeira etapa de extração:
LISE CELULAR
Ocorre por meio de:
❖ Pressão osmótica.
❖ Aquecimento.
❖ Detergentes.
LISE POR DETERGENTES EM
SOLUÇÃO TAMPONADA
Uso de detergentes para romper as
membranas.
➔ tris-hidroximetil aminometano
(tris) mantém pH em 8.
➔ EDTA- agente quelante.
➔ NaCl - rompe ligações
polipeptídicas inativando as
enzimas e aglomerando o dna.
Auxiliam na inibição da atuação de DNase.
PURIFICAÇÃO DA AMOSTRA
Utilização de fenol/clorofórmio (solventes
orgânicos que dissolvem a solução).
➔ dna na fase aquosa (sobrenadante)
➔ compostos desnaturadas
(complexos insolúveis) na fase
orgânica
PRECIPITAÇÃO DO DNA
➔ Utilização do etanol absoluto
➔ Isopropanol ou soluções acetatos
de amônio ou de sódio
LAVAGEM E RESSUSPENSÃO
Lavagem com álcool 70% → ressuspensão
com água ou o tampão TE (tris-EDTA) em
menor volume.
PURIFICAÇÃO POR MEIO DA
COLUNA DE ADSORÇÃO DO DNA
Obtenção de um dna/rna mais puro que
fornece maior precisão em aplicações mais
sensíveis.
PCR
O PCR ocorre em três etapas de forma
automatizada em um equipamento
chamado de TERMOCICLADOR.
É um método de síntese enzimática de
fragmentos de DNA sem uso de
organismos vivos, que inclui as etapas:
1. Desnaturação.
2. Anelamento.
3. Extensão (ou polimerização).
O que é necessário para realizar um
PCR?
➔ Amostra de dna.
➔ Primers.
➔ Nucleotídeos para ocorrência de
novas cadeias de dna.
➔ Taq polimerase (enzima extraída
de bactéria com alta resistência à
temperaturas elevadas).
➔ Solução tampão.
➔ Tubo de pcr.
ETAPAS DO PCR
1. DESNATURAÇÃO
❖ Ocorre em 96°C.
❖ Quebra das pontes de hidrogênio,
separando as fitas do dna.
❖ As fitas ficam acessíveis para a
próxima etapa.
2. ANELAMENTO
❖ Ocorre em 54°C.
❖ Anelamento dos primers.
❖ A temperatura cai para que os
primers se liguem aos fragmentos
do DNA complementares a eles.
❖ Quando eles se ligam, os primers
comunicam a Taq polimerase para
que se inicie o ciclo.
3. POLIMERIZAÇÃO
❖ Ocorre em 72°C.
❖ A temperatura aumenta para que
novas fitas sejam polimerizadas.
❖ Finalizado o ciclo (3 etapas), ele se
repete para a multiplicação dessas
fitas.
existem vários tipos de pcr, DENTRE
ELES:
PCR multiplex
Mais de um par de primers - amplificação
de fragmentos de diferentes tamanhos em
um mesmo tubo.
RT-PCR:
Utiliza a transcriptase reversa na análise
da expressão de genes a partir de
moléculas de RNA mensageiro (RNAm).
PCR em tempo real
Sonda complementar à região do dna
localizada entre os dois primers onde a
emissão de fluorescência é emitida.
ELETROFORESE
Método de separação de macromoléculas,
como DNA, RNA e proteínas por aplicação
de corrente elétrica.
fundamento: a molécula de dna ser
carregada negativamente.
➔ Moléculas de mesmo tamanho
migram a mesma distância e se
concentram em uma determinada
região chamada de banda,
independente da sequência de seus
nucleotídeos.
➔ Fragmentos mais acesos na
eletroforese representam bandas
com fragmentos menores de dna.
➔ A eletroforese é utilizada para ler o
resultado obtido no PCR.
Componentes:
❖ Solução tampão ionizada.
❖ Corante.
❖ Gel de agarose ou em análises mais
específicas, gel de poliacrilamida.
Fatores que influenciam a mobilidade dos
fragmentos de dna:
❖ Voltagem.
❖ Tamanho dos fragmentos.
❖ Concentração do gel (gel mais
concentrado apresenta mais
obstáculos para a passagem dos
fragmentos).
O resultado da eletroforese é visualizado
pela adição ao gel ou as amostras de
corantes fluorescentes com alta afinidade
pelo DNA.
SEQUENCIAMENTO
É a determinação da sequência de
nucleotídeos de fragmentos de DNA ou
RNA.
Objetivos:
❖ Identificação do organismo.
❖ Diagnóstico de doença genética.
❖ Diferenciação de cepas de
microrganismos patogênicos.
O MÉTODO DE SEQUENCIAMENTO
DE SANGER
Produção de fragmentos de dna com
tamanhos que diferem em um
nucleotídeos, utilizando como molde uma
fita simples de dna. A utilização de um
primer complementar ao dna alvo
determina qual sequência será produzida.
MÉTODOS DE NOVA GERAÇÃO
Os métodos de nova geração (NGS)
tornam o sequenciamento de dna mais
rápido, mais barato, mantendo a
confiabilidade das sequências obtidas.
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Enzimas de restrição ou endonucleases do
tipo II- clivam moléculas de DNA por
meio da quebra da fita dupla.
Cada enzima reconhece uma sequência de
nucleotídeos, chamada de sítio de corte ou
sítio de restrição, e apenas moléculas de
DNA que apresentem essa sequência serão
cortadas.