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Universidade Federal do Rio de Janeiro – Campus Duque de Caxias Geraldo Cidade Bacharelado em Ciências Biológicas: Biofísica Matheus Alves de Moura Alterações no metabolismo muscular in vitro induzidas por selenito de sódio Orientação: Professora Dra. Luisa Andrea Ketzer Duque de Caxias 2019 Universidade Federal do Rio de Janeiro – Campus Duque de Caxias Geraldo Cidade Bacharelado em Ciências Biológicas: Biofísica Matheus Alves de Moura Alterações no metabolismo muscular in vitro induzidas por selenito de sódio Monografia apresentada ao curso de Ciências Biológicas: Biofísica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, Campus Duque de Caxias Geraldo Cidade, como requisito necessário para obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas: Biofísica. Orientadora: Dra. Luisa Andrea Ketzer. Duque de Caxias 2019 Matheus Alves de Moura Alterações no metabolismo muscular in vitro induzidas por selenito de sódio Monografia apresentada ao curso de Ciências Biológicas: Biofísica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, Campus Duque de Caxias Geraldo Cidade, como requisito necessário para obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas: Biofísica. Aprovada em ___ de _______ de 2019. BANCA EXAMINADORA: _________________________ Profa. Dra. Luisa Andrea Ketzer (orientadora) Professora Adjunta Campus Duque de Caxias – UFRJ _________________________ Profa. Dra. Ana Paula Santos da Silva de Oliveira (Membro interno da banca) Professora Adjunta Campus Duque de Caxias – UFRJ _________________________ Dr. Leandro Silva da Costa (Membro externo da banca) Pesquisador Associado, Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis – UFRJ _________________________ Profa. Dra. Fabiana Avila Carneiro (Revisora e suplente) Professora Adjunta Campus Duque de Caxias – UFRJ Dedico este trabalho à Fátima e ao Fábio, meus pais. Por todo amor que a mim foi dado. Agradecimentos À toda minha família, pelo apoio e amor que a mim foram indispensáveis. Sem vocês este trabalho não seria possível. Aos meus pais, que me ajudaram a chegar até aqui. Sem vocês, nada disso teria acontecido. A minha tia Zelda, por todo o carinho e ajuda na minha mudança de casa. A minha tia Zê pela preocupação e pelas mensagens de carinho e motivação. A professora Bianca Pizzorno, pelo imenso carinho e preocupação com minha saúde mental. Educadores como a senhora são de extrema importância para a formação de um bom pesquisador. A todos os professores que me motivaram a chegar até aqui, em especial ao Alexandre, Carolina e Marisa. O trabalho de vocês dentro e fora de sala de aula mostra que a docência é linda. A professora Luisa Ketzer, pela oportunidade de realizar este projeto e pelos conhecimentos que a mim foram passados. Sua dedicação e carrinho por mim serão lembrados para sempre. As minhas companheiras de bancada, pela alegria compartilhada. As meninas que dividiram casa comigo, em especial a Flávia, Julia e Sabrina. Obrigado pela paciência e carinho. Morar com vocês foi muito especial para mim. A Heloise e a Jéssica, pelo carinho e ajuda neste trabalho. Suas dicas fizeram com que este trabalho fizesse mais sentido. Ao Pablo, um grande amigo que, mesmo com a distância, se faz presente na minha caminhada. Aos meus amigos que me acompanharam até aqui, em especial a Eliana e Thamires que tanto me ajudaram na faculdade. Ao amor da minha vida, Amora. Sua felicidade ao me ver chegando em casa aquece meu coração em dias frios. Aos técnicos do Numpex-Bio. O trabalho que vocês desenvolvem no laboratório é lindo e possibilitou que os experimentos deste trabalho fossem realizados. Obrigado de coração. Ao CNPq pela bolsa de iniciação científica. A Faperj por financiar este projeto. RESUMO O metabolismo energético é um processo indispensável à vida, sendo a respiração celular uma das principais vias de síntese de energia. Grande parte dessa energia produzida em forma de ATP é consumida pelo músculo, que em atividade exaustiva, pode gerar moléculas que causam estresse oxidativo, ocasionando dano celular e alterações metabólicas prejudiciais a vida. Para tal, diversas moléculas antioxidantes têm sido estudadas a fim de prevenir o dano causado durante o exercício físico intenso. O objetivo deste trabalho foi avaliar as alterações metabólicas geradas pelo selenito de sódio (Na2SeO3) no músculo e o possível papel antioxidante da suplementação com selênio (Se), em contraste ao dano causado por peróxido de hidrogênio (H2O2) in vitro. Para verificar a influência do tratamento com Na2SeO3, experimentos de viabilidade celular, respirometria e atividade de enzimas específicas foram realizados utilizando como modelo experimental mioblastos murinos (C2C12) cultivados em DMEM na ausência e presença deNa2SeO3 (50, 100 ou 200 nM) por 24 horas.A viabilidade celular foi mensurada por azul de tripan 0,4% em condição controle e na presença de H2O2 (0,25, 0,5 e 1 mM) por 6 horas. A respirometria foi realizada em mioblastos intactos e permeabilizados, no oxígrafo de alta resolução (OROBOROS). As enzimas creatina quinase (CQ) e citrato sintase (CS) tiveram suas atividades biológicas avaliadas através de extratos da fração citosólica de células controle e tratada.Os resultados mostraram queo H2O2 promoveu a perda da viabilidade de mioblastos de maneira dependente da concentração, onde 0,250 mM de H2O2 foi suficiente para inviabilizar cerca de 50% das células. Entretanto, o pré-tratamento dos mioblastos com Na2SeO3 (200 nM) por 24 horas preveniu o dano causado pelo estresse oxidativo.O Na2SeO3 promoveu um aumento de 11,6 ± 0,01% na atividade da CQ em comparação ao controle e ainda preveniu a redução da atividade induzida por H2O2(0,250 mM). O ensaio de respirometria de células intactas mostrou que o tratamento com Na2SeO3 aumentou a capacidade respiratória máxima induzida por p−trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP) em 97,5± 7,1%. Este aumento também foi observado em mioblastos permeabilizados, na presença de substratos respiratórios (piruvato, malato, succinato e ADP). A fim de avaliar a contribuição de cada complexo mitocondrial para este perfil respiratório, o consumo de oxigênio nos mioblastos foi medido na presença de substratos e inibidores específicos de cada complexo.O resultado mostrou que não houve diferença significativa na atividade dos complexos mitocondriais entre as células controle e tratadas.A avaliação da atividade da CS mostrou um aumento de 23,6 ± 9,1% na função desta enzima na fração de células tratadas. Os resultados mostraram que o tratamento com Na2SeO3 (200 nM) por 24 horas protege os mioblastos de danos induzidos pelo H2O2 e aumenta a capacidade respiratória máxima. O mecanismo para estes efeitos não está esclarecido, necessitando de análises experimentais adicionais. Entretanto, pode estar relacionado a um aumento da capacidade antioxidante da célula. ABSTRACT Energy metabolism is an indispensable process for life, with cellular respiration being one of the main routes of energetic synthesis. Much of this energy in the form of ATP is consumed by the muscle, which in exhaustive activity can generate molecules that cause oxidative stress, causing cell damage and metabolic changes that are life-threatening. In this way, various antioxidants have been studied to avoid the damage generated during intense physical exercise. The objective of this study was to evaluate the metabolic changes generated by sodium selenite (Na2SeO3) in muscle and the possible antioxidantrole of selenium (Se) supplementation in contrast to the damage caused by hydrogen peroxide (H2O2) in vitro. In order to verify the influence of Na2SeO3 treatment, experiments of cell viability, respirometry and specific ezymes activity were performed using murine myoblasts (C2C12) cultivated in DMEM medium in the absence and presence of Na2SeO3 (50, 100 or 200 nM) for 24 hours. Cell viability was measured by trypan blue 0.4% in control condition and in the presence of H2O2 (0.25, 0.5 and 1 mM) for 6 hours. Respirometry was performed in intact and permeabilized myoblasts on the high resolution oxygraph (OROBOROS). The enzymes creatine kinase (CQ) and citrate synthase (CS) had their biological activities evaluated by extracts of the cytosolic fraction of the control and treated cells. The results showed that H2O2 promoted loss of myoblast viability in a concentration-dependent manner, where 0.250 mM H2O2 was sufficient to render about 50% of the cells unviable. However, pretreatment of myoblasts with Na2SeO3 (200 nM) for 24 hours prevented the damage generated by oxidative stress. Na2SeO3 promoted an increase of 11.6 ± 0.01% in the CQ activity at the control and prevented the reduction of the activity induced by H2O2 (0.250 mM). The intact cell respirometry assay showed that treatment with Na2SeO3 increased the maximal respiratory capacity induced by p- trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) in 97.5 ± 7.1%. This increase was also observed in permeabilized myoblasts, in the presence of respiratory substrates (pyruvate, malate, succinate and ADP). In order to evaluate the contribution of each mitochondrial complex to this respiratory profile, the oxygen consumption in the myoblasts was measured in the presence of substrates and specific inhibitors of each complex. The results showed that there was no significant difference in the activity of mitochondrial complexes between control and treated cells. The evaluation of CS activity resulted in an increase of 23.6 ± 9.1% in the function of the enzyme in the fraction of treated cells. The results showed that treatment with Na2SeO3 (200 nM) for 24 hours protects the myoblasts from damage induced by H2O2 and increases the maximum respiratory capacity. The mechanism for these effects is not clear, requiring additional experimental analysis. However, it may be related to an increase in the antioxidant capacity of the cell. LISTA DE FIGURAS: Figura 1: Associação entre anabolismo e catabolismo, seus produtos e precursores.................................................................................................................14 Figura 2: Representação esquemática da Respiração celular...................................15 Figura 3:Representação gráfica do modelo quimiosmótico......................................17 Figura 4: Complexo ATP-sintase mitocondrial...........................................................18 Figura 5: Desenho esquemático dos 3 tipos de tecidos musculares.........................19 Figura 6: Reação da enzima creatina quinase...........................................................21 Figura 7: Percentual por classe de alimentos de acordo com o consumo de Selênio........................................................................................................................24 Figura 8: Atividade enzimática da glutationa-peroxidase...........................................25 Figura 9: Esquema do metabolismo do Se................................................................26 Figura 10: Ensaio de viabilidade celular de mioblastos (C2C12) tratados com peróxido de hidrogênio (H2O2)...................................................................................33 Figura 11: Viabilidade de mioblastos (C2C12) tratados com selenito de sódio (Na2SeO3) na ausência (barra preta) ou presença de 250 M deH2O2 (barra cinza)..........................................................................................................................34 Figura 12: Atividade da enzima creatina quinase (CQ) na fração citosólica de mioblastos controle e tratados com Na2SeO3............................................................36 Figura 13: Gráfico representativo da taxa de consumo de oxigênio de mioblastos intactos controle (linha vermelha) e tratados com Na2SeO3 (200 nM) por 24 horas (linha verde)................................................................................................................37 Figura 14: Consumo de oxigênio de mioblastos intactos controle (barra preta) e tratados com Na2SeO3 (200 nM) por 24 horas (barra cinza)......................................38 Figura 15: Gráfico representativo da taxa de consumo de oxigênio de mioblastos permeabilizados controle (linha vermelha) e tratados com Na2SeO3 (200 nM) por 24 horas (linha verde)......................................................................................................39 Figura 16: Consumo de oxigênio de mioblastos permeabilizados controle (barra preta) e tratados com Na2SeO3 (200 nM) por 24 horas (barra cinza)........................40 Figura 17: Gráfico representativo da taxa de consumo de oxigênio de mioblastos permeabilizados controle (linha vermelha) e tratados com Na2SeO3 (200 nM) por 24 horas (linha verde)......................................................................................................41 Figura 18: Atividade específica dos complexos mitocondriais...................................41 Figura 19: Atividade da enzima citrato sintase...........................................................42 LISTA DE SIGLAS: ADP: Adenosina difosfato ATP: Adenosina trifosfato BSA: Albumina bovina sérica CO2: Dióxido de carbônico CoA: Coenzima A CQ: Creatina quinase CS: Citrato sintase DIG: Digitonina DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium DTNB: 5,5′-Dithiobis(2-ácido nitrobenzóico) EGTA: Ácido etileno glicoamino tetra-acético ERNs: Espécies reativas de nitrogênio EROs: Espécies reativas de oxigêno FADH2: Flavina adenina dinucleotídeo reduzido FCCP: P−trifluorometoxifenilhidrazona FDA: Administração de comidas e drogas, do inglês Food and Drug Administration GPx: Glutationa peroxidase GSH: Glutationa reduzida GSSG: Glutationa oxidada H+: Próton de hidrogênio H2O: Água H2O2: Peróxido de hidrogênio H2Se: Seleneto de hidrogênio HCl: Ácido Clorídrico KCN: Cianeto de potássio KH2PO4: Fosfato de potássio monobárico LSH: Lípase sensível a hormônio MgCl2.6H2O:Cloreto de magnésio hexahidratado Na2SeO3: Selenito de sódio NAC: N-acetilcisteína NADH: Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido NADPH: Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido NO: Óxido nítrico NUMPEX-BIO: Núcleo Multidisciplinar de Pesquisa e Extensão da UFRJ – Xerém em Biologia O2: Gás oxigênio Oligo: Oligomicina P/M: Piruvato+malato P/V: Peso/volume PBS: Tampão fosfato-salino, do inglês PhosphateBufferedSaline Pi: Fosfato inorgânico PMSF: Fluoreto de fenilmetanosulfonil ROT: Rotenona S: Enxofre Se: Selênio Se-cis: Selenocisteína Se-met: Selenometionina SeO2 −₄: Selenato SeO3 -: Selenito SFB: Soro fetal bovino TCA: Ácido tricloroacético TMPD: N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediaminedihydrochloride Tris: Trisaminometano Tris-HCl: Hidroximetilaminometano cloridrato tRNA: Ácido ribonucléico transportado TXNRD: Tiorredoxina redutase Índice 1. Introdução..........................................................................................................13 1.1. Metabolismo bioenergético...............................................................13 1.2. Respiração celular..............................................................................14 1.2.1. Complexos mitocondriais.......................................................16 1.3. Tecido Muscular..................................................................................181.3.1. Contração..................................................................................20 1.3.2. Metabolismo.............................................................................21 1.3.3. Exercício físico e o estresse oxidativo..................................22 1.4. Selênio.................................................................................................23 2. Objetivos............................................................................................................27 2.1. Objetivos específicos.........................................................................27 3. Materiais e métodos..........................................................................................28 3.1. Cultura celular e tratamento experimental.......................................28 3.2. Viabilidade celular..............................................................................28 3.3. Consumo de oxigênio........................................................................28 3.4. Extração da fração citosólica celular................................................30 3.5. Dosagem de proteína..........................................................................30 3.6. Atividades Enzimáticas......................................................................30 3.6.1. Creatina quinase (CQ)..............................................................30 3.6.2. Citrato sintase (CS)..................................................................31 3.7. Análise estatística...............................................................................32 4. Resultados e Discussão...................................................................................32 4.1. Viabilidade celular..............................................................................32 4.2. Atividade da enzima creatina quinase (CQ).....................................35 4.3. Consumo de oxigênio mitocondrial..................................................36 4.4. Atividade dos complexos mitocondriais..........................................40 4.5. Atividade da enzima citrato sintase (CS)..........................................42 5. Conclusão..........................................................................................................44 6. Referências........................................................................................................45 13 1. Introdução 1.1. Metabolismo energético Todos os organismos vivos dependem de energia para sobreviver, independente da fonte energética. A maioria dos microrganismos e de animais multicelulares obtém energia a partir de moléculas orgânicas e, deste modo, são chamados de heterotróficos. Já os organismos que conseguem obter energia a partir de dióxido de carbono atmosférico são chamados de autotróficos, visto que não dependem de nenhuma outra molécula orgânica para sintetizar todas as suas biomoléculas carbônicas (NELSON e COX, 2019). Seja por fontes orgânicas ou inorgânicas, todas as fontes energéticas precisam ser convertidas em uma molécula onde a energia será propriamente armazenada. O conjunto das reações químicas que convertem a fonte energética até o aceptor final é chamado de metabolismo bioenergético. Essas conversões são na maioria das vezes realizadas por enzimas, e os diferentes aceptores divergem por diferentes vias metabólicas (NELSON e COX, 2019). A fase de degradação do metabolismo energético é chamada de catabolismo, sendo caracterizada por reações exergônicas onde parte da energia liberada é armazenada na forma de adenosina trifosfato (ATP) e nos carreadores de elétrons reduzidos, como dinucleotídeo de adenina e nicotinamida (NADH), dinucleotídeo de flavina e adenina (FADH2) e fosfato de dinucleotídeo de adenina e nitocinamida (NADPH). Parte da energia liberada pelas vias catabólicas é perdida na forma de calor (NELSON e COX, 2019). Também há formação de moléculas simples, sem valor energético, como CO2, H2O e NH3. Na Figura 1, a seta vermelha representa como ocorre esta degradação (NELSON e COX, 2019). A energia produzida no catabolismo é utilizada no processo chamado anabolismo. O anabolismo consiste na biossíntese de macromoléculas celulares com gasto de ATP e carreadores de elétrons reduzidos. Nesta via, precursores menores são utilizados para a produção de moléculas complexas, como proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos. Ainda na Figura 1, observa-se a relação entre anabolismo e o gasto energético, onde os precursores são convertidos a moléculas complexas com a oxidação concomitante de moléculas energéticas produzidas na fase catabólica. A relação entre catabolismo e anabolismo é a ponte para a síntese de todas as moléculas dos organismos(NELSON e COX, 2019). 14 Figura 1: Associação entre anabolismo e catabolismo, seus produtos e precursores. Representação esquemática do metabolismo energético: o catabolismo de nutrientes gera produtos mais simples e, neste processo, há a formação de moléculas energéticas que são utilizadas no anabolismo de moléculas complexas essenciais a vida. Fonte: NELSON e COX (2019). 1.2 Respiração celular A respiração celular é o termo utilizado para referir-se ao processo molecular pelo qual as células consomem O2 e produzem dióxido de carbono (CO2). Como mostra a Figura 2, este processo é dividido em três estágios: no primeiro, moléculas ingeridas na alimentação (proteínas, gorduras e açúcares) são digeridas com o intuito de produzir uma pequena molécula de dois carbonos, o acetil-CoA. No segundo estágio, o esqueleto carbônico do acetil-CoA entra noCiclo de Krebs, sendo oxidado a CO2 e a energia liberada neste processo é armazenada nos transportadores de elétrons reduzidos NADH e FADH2. O último estágio consiste na oxidação dos transportadores de elétrons, direcionando prótons (H+) para fora da matriz mitocondrial e elétrons ao oxigênio (O2). No processo de transferência de cargas elétricas, a energia liberada é armazenada na forma de ATP (NELSON e COX, 2019). 15 Figura 2: Representação esquemática da Respiração celular. Via oxidativa onde moléculas orgânicas percorrem 3 estágios definidos até que sejam incorporadas em uma molécula altamente energética, o ATP. Fonte: NELSON e COX (2019). O metabolismo de aminoácidos contribui significativamente para a produção da energia metabólica, tendo sua degradação como produto final o acetil-CoA. Os aminoácidos podem ser oxidados em três circunstâncias diferentes: i) durante o processo natural de degradação de proteínas celulares; ii) em dietas ricas em proteínas; iii) durante o jejum prolongado ou no diabetes mellitus não tratado, onde há uma prejuízo no metabolismo de carboidratos (NELSON e COX, 2019). Os ácidos graxos, em alguns tecidos, são a principal fonte de energia. Como exemplo, o tecido muscular do coração e o tecido hepático utilizam cerca de 80% das demandas energéticas de gorduras de cadeias longas, na maior parte das situações fisiológicas. A oxidação de ácidos graxos, ou β-oxidação,é realizada a partir da quebra de ácido graxo em moléculasde acetil-CoA, que podem ser direcionadasao Ciclo do Ácido Cítrico ou à produção de corpos cetônicos no fígado (NELSON e COX, 2019). A glicose é uma das principais fontes de energia para as plantas, animais e muitos dos microrganismos encontrados na natureza. Além de seu potencial 16 energético, a glicose ainda pode ser facilmente armazenada nos organismos na forma de polímeros de alta massa molecular, fazendo com que mais glicose fique prontamente disponível para ser metabolizada a partir do aumento da demanda.Uma vez no interior das células, a glicose é oxidada em uma sequência de reações enzimáticas produzindo duas moléculas de piruvato, duas de ATP e dois NADH+, em uma via chamada de glicólise.Em situações aeróbias, o piruvato formado a partir da glicose é rapidamente oxidado à acetil-CoA (NELSON e COX, 2019). O acetil-CoA é precursor do Ciclo do Ácido Cítrico, também conhecido como Ciclo de Krebs, sendo a segunda etapa da respiração celular, como representadona Figura 2. O Ciclo começa com a condensação de acetil-CoA e oxaloacetato para formação de citrato. Uma vez formado, o citrato passa por sete reações sequenciais, liberando duas moléculas de gás carbônico (CO2). Nas etapas de oxidação, a energia liberada é conservada de maneira eficiente nas coenzimas transportadoras de elétrons NADH e FADH2. Esta via é cíclica, de modo que os produtos intermediários não são exauridos, sendo que para cada molécula de oxaloacetato consumida, uma é regenerada(NELSON e COX, 2019). Por fim, o último estágio da respiração celular é a fosforilação oxidativa, onde o metabolismo energético culmina e os processos oxidativos geram energia, que é armazenada na forma de ATP. Os carreadores de elétrons reduzidos são oxidados e doam elétrons para complexos proteicos localizados na membrana interna mitocondrial. Este processo está associado à passagem de prótons (H+) da matriz para o espaço intermembrana, formando um gradiente quimiosmótico. Os prótons podem retornar para a matriz mitocondrial pela enzima ATP-sintase, que utiliza da força próton-motriz gerada pela diferença eletroquímica de H+ para sintetizar ATP (NELSON e COX, 2019). 1.2.1 Complexos mitocondriais A Figura 3 ilustra como os quatro complexos mitocondriais somados a ATP- sintase conseguem juntos, gerar ATP. Os complexos I e II realizam a transferência de elétrons para a ubiquinona a partir de NADH e succinato, gerando ubiquinona reduzida. O complexo III transfere os elétrons da ubiquinona reduzida para o citocromo c, que uma vez reduzido, é oxidado pelo complexo IV que neste processo reduz O2 à água (NELSON e COX, 2019). 17 O Complexo I ilustrado na Figura 3 é conhecido como Ubiquinona- oxidoredutase ou NADH-desidrogenase e catalisa a oxidação de NADH e a redução de Ubiquinona, associado ao bombeamento de prótons para o espaço intermembrana mitocondrial. Este complexo possui ao menos oito centros férricos que auxiliam no transporte de elétrons. A transferência do íon hidreto do NADH para a ubiquinona é exergônica e esta energia é utilizada para realizar o bombeamento simultâneo de um próton do espaço da matriz mitocondrial para o espaço intermembrana (NELSON e COX, 2019). O Complexo II é conhecido como succinato desidrogenase, e é também uma enzima do ciclo do ácido cítrico, que possui cinco grupos prostéticos e promove a conversão de succinato a fumarato, recebendo elétrons do FADH2. Assim como o Complexo I, este também reduz a ubiquinona, gerando ubiquinona reduzida (NELSON e COX, 2019). O complexo III, ou ubiquinona citocromo c oxirredutase transfere os elétrons da ubiquinona reduzida para o citocromo c e, além disso, promove o bombeamento de prótons da matriz mitocondrial para o espaço intermembrana, aumentando o gradiente de H+(NELSON e COX, 2019). O complexo IV, ou citocromo c oxidase realiza a oxidação do citocromo c, transferindo dois elétrons ao oxigênio (½O2), reduzindo-o a água. Neste processo, dois prótons são bombeados da matriz mitocondrial para o espaço intermembrana. Caso ocorra a redução incompleta do oxigênio, espécies reativas como o peróxido de hidrogênio podem ser formadas, gerando dano celular (NELSON e COX, 2019). Figura 3: Representação gráfica do modelo quimiosmótico. As moléculas de NADH e FADH2 são continuamente oxidadas pelos complexos mitocondriais, fazendo com que prótons sejam transferidos para o espaço intermembrana, criando assim um gradiente químico. Este gradiente gera uma força próton-motriz que é utilizada pela ATP-sintase para sintetizar ATP a partir de ADP+Pi e do retorno dos prótons para a matriz mitocondrial. Fonte: (NELSON e COX, 2019). 18 Enfim, o gradiente de H+ entre o espaço intermembrana e a matriz mitocondrial gera um potencial eletroquímico (força próton-motriz) necessário para a enzima ATP-sintase catalisar a formação de ATP a partir de ADP+Pi, realizando o processo chamado de fosforilação oxidativa. Esta proteína possui dois domínios funcionais, F1/Fo-ATPase, como mostra a Figura 4. Os prótons no espaço intermembrana não são permeáveis a membrana interna, deste modo eles passam pela porção (Fo) da ATP-sintase gerando energia suficiente para girar a porção F1 e promover a síntese de ATP (NELSON e COX, 2019). Figura 4. Complexo ATP-sintase mitocondrial. Em (A), uma ilustração da ATP-sintase, onde é possível observar as subunidades α, β e δ. Em (B), reconstrução a partir de resultados cristalografia, mostrando as porções F1/Fo, o sítio de ligação de ADP e o de formação de ATP. Fonte: (NELSON e COX, 2019). 1.1 Tecido Muscular O tecido muscular é um tecido que evolutivamente se desenvolveu para realizar atividades relacionadas ao movimento que necessitam de força. Esta característica é atribuída devido a sua capacidade de degradar ATP, gerando energia para o trabalho mecânico (POIAN e CASTANHO, 2015). O músculo tem como principal função a locomoção e a contração, e está dividido em três tipos de fibras, sendo esta divisão associada ao tipo de movimento realizado. O músculo esquelético é responsável pelo movimento do corpo e também por manter a postura corporal, sendo seu movimento realizado voluntariamente. O músculo cardíaco e o músculo liso possuem, respectivamente, a função de manter o (B) (A) 19 ritmo do coração e de realizar movimentos autônomos a fim de manter a função de outros órgãos, sendo esse tipo de movimento involuntário. A Figura 5 representa os três tipos de tecidos musculares, onde é possível também observar microscopias dos diferentes tecidos, assim como sua localização no corpo humano (POIAN e CASTANHO, 2015). Estruturalmente, as células do músculo esquelético são grandes e multinucleadas, apresentando um aspecto estriado. Já as células do músculo cardíaco são menores, mononucleares e entre elas existem junções específicas, conhecidas como discos intercalares. As fibras do músculo liso são pequenas e não apresentam estriações. A membrana das fibras é conhecida como sarcolema, enquanto o citosol é chamado de sarcoplasma. Outra estrutura importante a este tecido é a miofibrila, que consiste em feixes proteicos organizados, elásticos e contráteis. No músculo esquelético existe uma estrutura chamada de retículo sarcoplasmático, estrutura esta que está envolvida no processo de contração (BELLÓ et al., 2017). Figura 5. Desenho esquemático dos 3 tipos de tecidos musculares. Representação da localização e microscopia de lâminas histológicas dos tipos de tecidos musculares. Adaptado de (POIAN E CASTANHO, 2015). Músculo liso Músculo cardíaco Músculo esquelético 20 Cada fibra muscular possui miofibrilas compostas por diversos tipos de proteínas organizadas na forma de estruturas contráteis repetidas chamadas de sarcômero. As principais proteínas que compõem uma miofibrila são a miosina, os microfilamentos de actina, tropomiosina e troponina (BELLÓ et al., 2017). A miosina é uma proteína motora, que tem a capacidade de produzir movimento. Cada molécula desta proteína contém uma parte caudal longa e entrelaçada que se liga a actina, e outra parte com um par de cabeças. Cada cabeça possui uma cadeia pesada que se liga ao ATP. No músculo esquelético, cerca de 250 moléculas de miosina se unem e formam os filamentos grossos, que se organizam de forma que as cabeças fiquem agrupadas na extremidade do filamento (BELLÓ et al., 2017). A actina se encontra na forma polimerizada na fibra muscular, e no músculo esquelético, dois filamentos de actina se enrolam um ao outro, formando um colar, gerando os filamentos finos da miofibrila(BELLÓ et al., 2017). A troponina é um complexo ligante de cálcio, e a função desta proteína é controlar o posicionamento da tropomiosina. No músculo esquelético em repouso, a tropomiosina enrola-se ao redor dos filamentos de actina cobrindo-o de forma parcial, de modo a inibir a ligação miosina-actina (BELLÓ et al., 2017). 1.3.1 Contração muscular A contração muscular tem início quando há um estimulo nervoso, favorecendo a liberação do íon Ca2+ do retículo sarcoplasmático para o sarcoplasma. A proteína responsável pelo fluxo de cálcio durante a contração é a Ca2+-ATPase do retículo sarcoplasmático (SERCA). O retículo sarcoplasmático é a organela responsável também pela recaptura de cálcio durante o processo de relaxamento. Este íon se liga a troponina, promovendo o deslocamento da tropomiosina e a exposição do sítio de interação actina-miosina, possibilitando assim o processo de contração (BELLÓ et al., 2017). Uma vez que o sítio de ligação actina-miosina está exposto, o ATP que se liga à cabeça da miosina é hidrolisado em ADP+Pi. Neste processo, a energia liberada é utilizada para engatilhar a miosina, que em seguida desloca-se pelo filamento de actina, fazendo com que a fibra se contraia (BELLÓ et al., 2017). 21 1.3.2 Metabolismo O tecido muscular está constantemente em funcionamento e é completamente dependente de energia. O músculo esquelético, por exemplo, compõe cerca de 30% de todo o metabolismo energético do corpo humano e 80% da glicose é destinada a este tecido em situações de estimulação por insulina (EGAN e ZIERATH, 2012). As principais fontes de energia para o tecido muscular são: glicose, ácidos graxos, glicogênio e creatina fosfato (POIAN e CASTANHO, 2015). Em situações de exercício físico intenso, o aporte de O2 é precário, fazendo com o que tecido muscular necessite de adaptações para que consiga manter seu funcionamento adequado. Uma das primeiras adaptações é o metabolismo anaeróbico de glicose, conhecido como fermentação. Em mamíferos a fermentação é láctica, onde o piruvato é desviado do Ciclo de Krebs para a produção de lactato pela enzima lactato-desidrogenase, oxidando NADH + H+ em NAD+, que é essencial para a via glicolítica.Este processo possibilita que a glicose seja continuamente metabolizada e o ATP sintetizado, mesmo em situações de baixa concentração de oxigênio (NELSON e COX, 2019; POIAN e CASTANHO, 2015). Outra adaptação ao exercício é a formação de ATP a partir da molécula de fosfocreatina, como mostra a Figura 6. Durante o repouso, o ATP doa um grupamento fosfato para uma molécula de creatina, formando fosfocreatina e ADP. Adaptando-se à atividade física intensa, o tecido muscular realiza a reação inversa, adicionando o grupamento fosfato da fosfocreatina ao ADP, gerando creatina e ATP. Estas reações são reversíveis e são catalisadas pela enzima creatina quinase (CQ), (POIAN e CASTANHO, 2015). Figura 6. Reação da enzima creatina quinase. O sistema creatina-fosfocreatina é uma adaptação do tecido muscular para suprir a demanda de ATP. Creatina recebe o grupamento fosfato do ATP durante o repouso (seta verde), gerando fosfocreatina e ADP. Na atividade física (seta vermelha), a 22 creatina quinase (CQ) catalisa a conversão de fosfocreatina e ADP em creatina e ATP, favorecendo o balanço de ATP. Adaptado de POIAN e CASTANHO(2015). A adrenalina é um hormônio excretado em situações onde o sistema nervoso simpático é ativado, como por exemplo, o exercício físico intenso. Uma enzima que é ativada neste processo é a lipase sensível a hormônio (LSH), sendo esta responsável por fazer com que ácidos graxos fiquem na forma livre no tecido adiposo, sendo assim carreados para o músculo. Os ácidos graxos são a principal fonte energética para o músculo cardíaco, onde estes são constantemente oxidados a acetil-CoA (BELLÓ et al., 2017; POIAN e CASTANHO, 2015). 1.3.3 Exercício físico e o estresse oxidativo Algumas etapas da fosforilação oxidativa podem produzir radicais livres altamente reativos, que podem ocasionar dano celular (FERREIRA e REID, 2008). A formação de ubiquinona reduzida envolve um intermediário que pode reduzir o O2 e formar radical superóxido. A produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) é impulsionada quando não é possível gerar ATP pela falta de O2 (NELSON e COX, 2019). Cerca de 4% de todo o oxigênio consumido por mitocôndrias formam EROs que causam dano celular. Estas espécies reagem com enzimas, lipídeos de membranas e ácidos nucleicos, fazendo com que estas moléculas tenham suas funções alteradas (DAVIES et al., 1982; NELSON e COX, 2019). O músculo é um tecido que acaba sendo afetado pelo estresse oxidativo devido à sua alta atividade metabólica. Pouco se sabe sobre qual o papel das EROs, mas sabe-se que elas são indispensáveis para a adaptação do músculo, principalmente o esquelético, durante o exercício intenso. Outra questão ainda não esclarecida é o balanço entre a concentração que gera dano ao tecido e a quantidade de EROS que é necessária para adaptar o músculo à atividade física intensa (FERREIRA e REID, 2008; POWERS et al., 2011). Davies et al.(1982) foi o primeiro grupo a demonstrar que o aumento da atividade do músculo esquelético e do fígado promove a formação de EROs. A extinção de EROs pelos sistemas antioxidantes das fibras musculares esqueléticas resulta em uma redução na geração da força muscular, demonstrando a importância das EROs em baixas concentrações para este tecido (COOMBES et al., 2001; FERREIRA e REID, 2008; REID et al. 1993; REID et al., 1998). 23 A fadiga muscular é um processo adaptativo pouco conhecido, no entanto sabe-se que este envolve a presença de EROs (FERREIRA e REID, 2008). Shindohet al. (1990) demonstraram que, se suplementado com N-acetilcisteína (NAC), o músculo consegue trabalhar por mais tempo sem alcançar a fadiga, demonstrando que altas concentrações de EROs promovem a parada do exercício por causar fadiga muscular. O NAC é um promotor do sistema antioxidante glutationa (SHINDOH et al., 1990). Além das EROs, existem também as espécies reativas de nitrogênio (ERNs), sendo a principal delas, o óxido nítrico (NO). Esta espécie reativa é gerada principalmente no metabolismo de L-arginina, que acontece quando os estoques energéticos musculares estão muito baixos e estes começam a metabolizar aminoácidos que compõe o próprio tecido. Uma particularidade das ERNs no exercício é que o NO promove a inibição do complexo IV mitocondrial e da enzima creatina quinase, debilitando a geração de ATP (BRUNORI et al., 2004; BRUTON et al., 2008). As ERNs também inibem uma enzima que está envolvida no processo de conversão de glicogênio à glicose, limitando o aporte de acetil-CoA (MOHR et al., 1996; MOLINA Y VEDIA et al., 1992). 1.4 Selênio O selênio (Se) faz parte da família 4A (calcogênios) da tabela periódica, sendo seu número atômico igual a 34. Schwarz e Foltz (1957) descreveram o Se como elemento traço, ou seja, desempenha um papel crucial em diversos aspectos da saúde humana e animal. A média de Se que deve ser ingerida, segundo a Food and Drug Administration (FDA), é de 45 µg por dia para homens adultos (PRABHU e LI, 2016). Na natureza, o selênio pode ser encontrado conjugado a moléculas orgânicas ou inorgânicas (FAIRWEATHER-TAIT et al., 2011). O Se faz parte do mesmo grupo da tabela periódica que o enxofre (S), desta forma pode ser um substituto do S nos aminoácidos sulfídricos, formando assim análogos de metionina e cisteína (DANIELS, 1996). Na forma orgânica, o Se aparece na forma de γ-glutamil-Se- metiolselenocisteina, Se-metilselenocisteina, selenocisteina (Se-cis) e selenometionina (Se-met) (BIERLA et al., 2008; KOTREBA et al., 2000; WOLF e GOLDSCHMIDT, 2007). Na forma inorgânica, o Se pode ser encontrado na forma de 24 selenito (SeO3 -),seleneto(H2Se) e selenato (SeO2 −₄). Alguns alimentos são ricos em Se, como as castanhas brasileiras que podem chegar a uma concentração de 0,03 mg à 512 mg/kg da oleaginosa fresca (RAYMAN et al., 2008). Alimentos como alho e trigo possuem mais de 50% da concentração de Se na forma orgânica, o que interfere diretamente na taxa de absorção de Se pelo organismo. A Figura 7ilustra qual a contribuição de cada alimento na ingestão de Se (STOTZKY, 1987; LOCKITEH, 1989; RAYMAN, 2000;). Figura 7. Percentual por classe de alimentos de acordo com o consumo de Selênio. Os setores coloridos representam a parcela de cada alimento na taxa de consumo de O2Adaptado de:FAIRWEATHER-TAIT et al.(2011). A absorção de Se está estritamente correlacionada com a forma química que este se encontra (BLEYS et al., 2008). Em geral, as formas orgânicas são mais facilmente absorvidas, visto que como são conjugadas a aminoácidos, podem ser transportadas para o interior das células do trato gastrointestinal pelos mesmos transportadores dos aminoácidos sulfridrílicos (BRIGELIUS-FLOHÉ e MAIORINO, 2013; BROADLEY et al., 2010). O selenito é rapidamente absorvido, de forma passiva, pelas células e estudos em animais demonstraram que as vitaminas A e C promovem ainda mais a absorção de selenito (BLEYS et al., 2007; TREIS et al., 2002). Pães e cereais 26% Carne 26% Peixe 10%Ovos 4% Leite, produtos lácteos e derivados 21% Vegetais e frutas 7% Outros 6% Ingestão de Selênio 25 As selenoproteínas compõem uma classe de proteínas que possuem o Se em algum de seus aminoácidos, sendo a Se-cis encontrada em muitos desses sítios. A função do Se nas selenoproteínas é de compor centros redox que em grande maioria culmina na função da proteína. Cerca de 35 selenoproteínas foram identificadas, onde algumas delas ainda não foram completamente elucidadas (BEHNE et al., 2000). A primeira selenoproteína a ser descrita foi a glutationa-peroxidase (GPx). Esta enzima reduz peróxido de hidrogênio (H2O2) e outros hidroperóxidos orgânicos, como por exemplo, lipídeos, esteroides, ácidos nucleicos e membrana celular(DANIELS, 1996). A atividade da GPx é baseada na oxidação de duas moléculas de glutationa reduzida (GSH) gerando uma molécula de glutationa oxidada (GSSG), a partir do consumo de uma molécula de peróxido de hidrogênio(NELSON e COX, 2019). A Figura 8 ilustra o funcionamento desta enzima. Oito tipos de GPx foram descritas, sendo 5 selenoproteínas, onde cada uma tem a capacidade de reduzir diferentes espécimes químicas com diversos substratos, caracterizando o maior sistema de defesa antioxidante humano (BRIGELIUS-FLOHÉ e MAIORINO, 2013). Figura 8. Atividade enzimática da glutationa-peroxidase. Adaptado de: NELSON e COX (2019). Outra selenoproteína que compõe um sistema antioxidante é a tiorredoxina- redutase (TXNRD) (FAIRWEATHER-TAITet al., 2010). TXNRDs estão envolvidas em diversos fenômenos biológicos como, por exemplo, a proliferação celular e taxa de sobrevivência celular (LU et al., 2009). Por manter o controle da tiorredoxina, a TXNRD tem papel crucial à resposta ao estresse oxidativo, visto que a oxidação da tiorredoxina leva a redução de um substrato previamente oxidado (FAIRWEATHER- TAIT et al., 2011) A assimilação dietética de Se, como mostra a Figura 9, ocorre através de uma série de interconversõesque ainda não foram completamente esclarecidas (DRAKE, 2006). Sabe-se que seleneto de hidrogênio (H2Se) é um ponto central do metabolismo, pois está envolvido com a incorporação do Se em selenoproteínas ou Glutationa- peroxidase GSSH 2GSH 2H2O H2O2 26 a excreção como dimetil selênio. As selenometioninas ingeridas na alimentação são convertidas a selenocisteína (Se-cis) pela enzima cistationa-β-sintase e em seguida pela cistationa-γ-liase. A enzima selenocisteina-β-lyase libera seleneto a partir da Se-cis, que será convertida a selenofosfato que, por conseguinte, será utilizada por enzimas tRNA para a incorporação na síntese de selenoaminoácidos. O selenito ingerido pode ser reduzido pela enzima tioredoxina-redutase (que é uma selenoproteína) e assim, gerar seleneto de hidrogênio, podendo ser tanto excretado, como utilizado na síntese de selenoproteínas (FAIRWEATHER-TAIT et al., 2011). Figura 9. Esquema do metabolismo do Se. Via percorrida pelo Se desde a dieta até as selenoproteínas. A selenodiglutationa (GS-SeH) é um dos intermediários da transformação das formas inorgânicas de Se da dieta até o seleneto. Adaptado de: FAIRWEATHER-TAIT et al.(2011). A ingestão de Se é de extrema importância, visto que este elemento faz parte de diversos processos fisiológicos que culminam na homeostase corporal. A influência do Se está desde a modulação do sistema imune a diversos sistemas antioxidantes que as selenoproteínas fazem parte (DANIELS, 1996; FAIRWEATHER-TAIT et al., 2011). A deficiência de Se pode causar algumas disfunções fisiológicas, que culminam em desordens médicas. Algumas doenças são associadas à depleção de Se a partir da ingestão de alimentos, como por exemplo, a Doença de Keshan (LU et al., 2009), que é uma cardiomiopatia comum em uma região da China e a doença de 27 Kashin-Beck, uma doença caracterizada pela atrofia óssea presente em áreas do mundo que são Se deficientes (PRABHU e LEI, 2016). Alguns estudos correlacionaram à baixa ingestão de Se ao risco de câncer, onde a suplementação na dieta pode contribuir para a diminuição a este risco (CLARK et al., 1996). Alguns autores relacionam a proteção ao câncer à atividade GPx, que é uma das selenoproteínas mais afetadas pelos níveis de Se no organismo (CLARK et al., 1996; COMBS, 2004; LUBOS et al., 2011). A distrofia muscular nutricional é uma síndrome caracterizada pela atrofia muscular causada pela depleção de Se no organismo, tanto em humanos como em outros animais (CANTOR et al., 1982; PATTERSON et al., 1957; POSTON et al., 1976; SCI-IWAKZ et al., 1957). Um estudo demonstrou que uma menor atividade da glutationa peroxidase (GPx) é associada à dor e fraqueza muscular e nestes casos, os pacientes afetados responderam favoravelmente à administração de selênio (BAPTISTA et al., 1984). 2. Objetivo O objetivo deste trabalho é avaliar as alterações metabólicas no tecido muscular in vitro induzidas por selenito de sódio. 2.1 Objetivos específicos 1. Avaliar o dano causado por H2O2 em células C2C12 e sua reversibilidade com o tratamento com Na2SeO3; 2. Avaliar etapas no processo de respiração celular no tratamento com Na2SeO3. 3. Avaliar a atividade da enzima creatina quinase e citrato sintase. 3. Materiais e métodos 3.1 Cultura celular e tratamento experimental Os mioblastos murinos C2C12 foram cultivados em DMEM (Cultilab) 5 mM de glicose, contendo 10% de soro fetal bovino (SFB), 200 mM de estreptomicina e ampicilina. As células foram mantidas na estufa a 90-95 % de umidade e 5% de CO2 28 à 37ºC. A cada dois dias as células foram lavadas duas vezes com PBS (Sigma) e receberam um novo meio de cultura. As células C2C12 são precursores de miotubos e, para que a diferenciação não ocorresse, a cultura passou por um processo de repique ao alcançar 85% de confluência, respeitando a densidade de 5x103 por cm2. O tratamento com selenito de sódio (Na2SeO3) (ISOFAR) diluído em PBS foi realizado por 24 horas em todos os experimentos. Em um experimento inicial, foram utilizadas as concentrações de 50, 100 e 200 nM de Na2SeO3 e posteriormente a concentração de 200 nM foi determinada como padrão de tratamento (grupo tratado). Todos os experimentos foram comparados com o grupo controle, que não recebeu suplementação de Na2SeO3. 3.2 Viabilidade Celular Em uma placa 24 poços, 5 x 104 células controle e tratadas foram adicionadas em cada poço, diluídas em 1 mL de meio de cultura. Após uma hora paraa aderência das células, 250 μM de H2O2 foi adicionado, permanecendo por 6 horas na cultura. Depois deste tempo, as células foram lavadas com PBS e em seguida soltas pela ação da tripsina por 5 minutos, ou até que todas as células não estivessem mais aderidas. Imediatamente, DMEM suplementado com SFB foi adicionado para parar a ação da tripsina. Uma vez em suspensão, as células podem ter sua viabilidade quantificada. A viabilidade celular foi mensurada a partir da coloração por azul de tripan 0,4 % (SIGMA), onde 10 μL da suspensão de células foram adicionadas no mesmo volume de tripan. Em seguida, as células viáveis foram quantificadas na câmara de Neubauer. Para controle positivo, uma condição com triton 1% foi feita. 3.3 Consumo de Oxigênio A taxa de consumo de oxigênio foi medida por respirometria de alta resolução (OROBOROS, oxygraph 2K). O aparelho funciona baseado na verificação polarográfica da dinâmica de oxigênio, com um fino controle de temperatura, permitindo a medição da função respiratória das células. Monocamadas de células C2C12 foram tripsinizadas, centrifugadas e ressuspendidas a uma concentração de 5x105 células/mL em meio DMEM sem SFB. 29 O meio sem SFB foi utilizado neste momento devido à quantidade de bolhas de ar geradas no interior da cubeta, podendo ocasionar interferências na leitura do aparelho. Em cada uma das cubetas foi adicionado 2 mL da solução com as células ressuspensas. O consumo mitocondrial de oxigênio foi medido em células intactas, onde foi adicionado em cada cubeta 0,4 μg de oligomicina, sendo este um inibidor da ATP-sintase. Em seguida, uma titulação de carbonilcianida p−trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP) foi realizada até que não houvesse mais resposta do fluxo de oxigênio à adição da substância, respeitando a concentração máxima de 1 mM. Para as células permeabilizadas, as células foram ressuspensas em meio MIR05, que continha sacarose 110 mM, lactobionato de potássio 60 mM, EGTA 0,5 mM, MgCl2.6H2O 3 mM, taurina 20 mM, KH2PO4 10 mM,20 mM e albumina bovina (BSA) 2 mg/mL (pH 7.1). Já na cubeta, 106 células foram permeabilizadas com 10 μg de digitonina, esperando-se em seguida alguns minutos até que o perfil do consumo de oxigênio se estabilizasse. A respiração mitocondrial no estado fosforilativo máximo foi medida em mioblastos permeabilizados, ao qual os substratos dos complexos mitocondriais e ADP 1mM foram adicionados. Para mensurar a atividade do complexo I, foi adicionado piruvato/malato (P/M) 5 mM, que geram NADH quando oxidados. O complexo II foi estimulado com a adição de succinato 10 mM, onde a adição está atrelada a produção de FADH2 no Ciclo de Krebs, favorecendo a oxidação no complexo II. Quando NADH e FADH2 são oxidados, moléculas de ubiquinona são reduzidas, formando ubiquinol, que por sua vez doa elétrons para o complexo III e IV. Para o complexo IV, também foi adicionado N,N,N’,N’-tetramethyl-p- phenylenediaminedihydrochloride (TMPD) 0,5 mM e ascorbato 2 mM. Após alcançar o estado fosforilativo máximo, foi feita a medida de respiração. A atividade dos complexos mitocondriais foi realizada adicionando-se os substratos como na respiração de máxima, porém neste experimento houve também a adição dos inibidores dos respectivos complexos, sendo a atividade do complexo atribuída pela diferença entre a respiração com o substrato e a respiração com o inibidor. Neste experimento, os mioblastos foram previamente permeabilizados. Os inibidores utilizados para este experimento foram: rotenona 0,5 μM para o complexo 30 I, antimicina 2,5 μM para os complexos II e III e cianeto de potássio (KCN) 1 mM para o complexo IV. 3.4 Extração da fração citosólica celular A extração da fração citosólica celular foi realizada em tampão de extração contendo Tris-HCl 10 mM pH 7.4, sacarose 0,25 M, fluoreto de sódio 20 mM, ditiotreitol 5 mM, EDTA 5 mM e fluoreto de fenilmetanosulfonil (PMSF) 1 mM. O procedimento foi realizado após a centrifugação das células, onde o precipitado foi ressuspendido no tampão de extração e homogeneizado em homogeneizador de vidro do tipo Potter-Elvehjem por 3 minutos no gelo. Posteriormente, a mistura foi centrifugada durante 10 minutos à 1.000 g (4oC). O sobrenadante, que corresponde a fração citosólica, foi aliquotado em tubo tipo eppendorf e armazenado à -20oC para análises posteriores. 3.5 Dosagem de proteínas A dosagem de proteínas das frações citosólicas foram realizadas pelo método de Folin-Lowry (LOWRY et al., 1951). O princípio deste método baseia-se na utilização de uma solução contendo molibdato, tugstato e ácido fosfórico, chamada de solução de Folin-Ciocalteau. Esta solução sofre redução quando reage com proteínas com a participação do catalisador cobre (II), tendo sua cor amarelada alterada para um tom azul de acordo com a quantidade de reduções que ocorrem na mistura com as proteínas. Os padrões de absorbância foram analisados no espectrofotômetro a 660 nm. Para a quantificação, uma curva com albumina bovina sérica foi realizada, criando-se uma curva padrão de concentração conhecidas de proteínas, sendo esta comparada com a amostra de concentração desconhecida, sendo possível determinar a concentração de proteínas totais na amostra da fração. 3.6 Atividades enzimáticas 3.6.1Creatina quinase (CQ) A atividade da enzima CQ foi medida na fração citosólica de mioblastos (C2C12) controle e tratados com Na2SeO3 200 nM por 24 horas. Este experimento se baseia na oxidação/redução de α-naftol-diacetil (EGGLETON et al., 1943). 31 O meio para a reação enzimática continha cloreto de potássio (10 mM), tris- HCl (20 mM) pH 7,4, cloreto de magnésio (5 mM), EGTA (1 mM), ADP (0,5 mM), e fosfocreatina (0,2 mM). As condições deste experimento foram: i) Controle sem H2O2; ii) Tratado sem H2O2; iii) Controle com H2O2(0,250 mM); iv) Tratado com H2O2(0,250 mM). O meio foi pré-incubado a 35 ºC por 2 minutos e em seguida 0,1 mg/mL de proteínas das frações citosólicas foram adicionadas, iniciando a reação. Rapidamente após a adição da proteína, 0,250 mM de H2O2 foi adicionado. Após 1 hora de reação, alíquotas foram retiradas e adicionadas em tubos no gelo contendo ácido tricloroacético (TCA) 50%, para inibir a reação. Para a etapa colorimétrica, α- naftol 1% (p/v) e diacetil 0,05 % foram adicionados nas amostras que, após 20 minutos de reação, foram lidas a 520 nm no espectrofotômetro. Os valores de absorbância das amostras e da curva padrão de creatina foram comparados para a realização do cálculo da atividade enzimática. 3.6.2 Citrato sintase (CS) A enzima citrato sintase (CS) é uma enzima do Ciclo de Krebs, responsável pela conversão de oxaloacetato a citrato, utilizando acetil-CoA como substrato. Localizada na matriz mitocondrial, é frequentemente utilizada como marcador quantitativo de mitocôndrias (EIGENTLERet al.2015). A atividade da enzima CS foi medida na fração citosólica de mioblastos (C2C12) controle e tratados com Na2SeO3 200 nM por 24 horas. As amostras (concentração proteica de 0,1 mg/mL) foram incubadas em meio contendo tampão tris-HCl 50 mM, pH 8,0 à25 °C, Triton X-100 0,25 %, oxaloacetato 500 μM, 5,5′-Dithiobis(2-ácido nitrobenzóico) (DTNB) 100 μM e acetil-CoA 250μM, de acordo como descrito por Eigentleret al.(2015). As leituras da absorbância foram realizadas em espectrofotômetro a 412 nm (time scan) para detectar o TNB formado, conforme a reação abaixo: Acetil-CoA + oxalacetato + H2O citrato + CoA-SH CoA-SH + DTNB TNB + CoA-S-S-TNB Os cálculos foram realizados considerando o coeficiente de extinção milimolar do TNB 13,6 mM-1 × cm- 1, a concentração final de proteína na reação e a velocidade máxima da reação. 32 3.7 Análise estatística A análise estatística dos resultados foi feita no programa GraphPad Prisma Versão 6 (GraphPad Software,inc.). Os resultados são apresentados como Média ± Erro Padrão da Média. O tratamento estatístico foi feito através do Teste One-Way ANOVA seguido de um test t de Tukey para um valor de significância menor ou igual que 0,05 (p value). 4 Resultados e Discussão 4.1 Viabilidade celular O tecido muscular, quando em atividade intensa, produz normalmente EROs e ERNs, que já foram descritas como fundamentais para a adaptação deste tecido ao exercício de alta intensidade (POWERS et al., 2011). No entanto, EROs podem causar dano tecidual através de vários meios, dentre eles a peroxidação de lipídeos e a inativação de algumas proteínas importantes, podendo levar à morte celular (FERREIRA; REID, 2008). Para induzir o estresse muscular, os mioblastos (C2C12) foram expostos a diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio (H2O2) durante 6 horas (Figura 10). A viabilidade celular foi mensurada utilizando azul de tripan 0,4%, um corante vital que quando em contato com células saudáveis, é repelido devido a sua alta impermeabilidade a membrana celular. Uma vez que as células estejam inviáveis, o corante é permeável a membrana celular, marcando as células em um tom de azul escuro (STROBER, 2015). As concentrações de H2O2 utilizadas no experimento foram de 0,25 mM, 0,5 mM e 1 mM. A condição controle (sem adição de H2O2) foi considerada como 100 % de viabilidade celular. Observa-se uma perda da viabilidade celular de acordo com o aumento da concentração de H2O2, chegando a 20,49 ± 8,08 % de mioblastos viáveis em 1 mM de H2O2(Figura 10). Como controle positivo, foi utilizado o detergente Triton X-100 1 %, que promoveu a morte celular em 100 % por induzir a permeabilização da membrana. Para os próximos experimentos, foi escolhida a concentração de 0,25 mM de H2O2por ter reduzido a viabilidade celular em cerca de 50 %. O H2O2é uma EROs com alta capacidade oxidativa, estando atrelada a diversas patologias clínicas (POWERS et al., 2011). No músculo esquelético, o 33 estresse oxidativo causa disfunção mitocondrial e alterações na função da membrana celular (CHOI et al., 2016). A integridade de membrana é o fator que define a permeabilidade da célula, sendo assim, o estresse causado por H2O2(Figura 10) possibilita que o azul de tripan permeie do meio extracelular para o citosol, indicando perda da viabilidade celular. Figura 10.Ensaio deviabilidade celular de mioblastos (C2C12) tratados com peróxido de hidrogênio (H2O2).As células foram incubadas na presença de H2O2 (0,25 mM, 0,5 mM ou 1 mM) ou Triton 1 % por 6 horas. A porcentagem de células coradas (inviáveis) foi comparada com a condição controle (barra preta), sem tratamento com H2O2. Os valores representam média ± erro padrão da média (n = 3). *p<0,05 e **p<0,001 em comparação com a condição controle. Diversas evidências indicam que a distrofia muscular é causada por estresse oxidativo (CHOI et al., 2016).No entanto, ensaios clínicos usando antioxidantes como a nicotinamida (vitamina B) etocoferóis (vitamina E) não resultaram em melhora significativa à esta patologia (RANDO, 2002). Por conseguinte, testamos in vitro se o tratamento com Na2SeO3 previne o dano causado aos mioblastos por EROs, visto seu papel como antioxidante (FAIRWEATHER-TAIT et al., 2011). Com o intuito de caracterizar o possível papel protetor do selênio frente ao dano oxidativo promovido pelo H2O2, os mioblastos foram tratados com diferentes concentrações de Na2SeO3 (50, 100 e 200 nM) por 24 horas, sendo que nas últimas 6 horas foi adicionado 0,250 mM de H2O2 (Figura 11).As concentrações de Na2SeO3 utilizadas no experimento foram baseadas em um artigo recente publicado por Ma et al. (2015), onde foi demonstrado que o tratamento de neurônios com Na2SeO3 diminuiu o estresse oxidativo causado por nanopartículas de prata (MA et al., 34 2015).Assim como qualquer elemento traço, o Se em concentrações elevadas(na ordem de μM) pode acarretar uma série de problemas fisiológicos (RAYMAN, 2000), inclusive é um possível alvo terapêutico para o tratamento de câncer, visto que o radical selenito é pró-oxidante (FANG et al., 2010). A Figura 11 mostra que o tratamento com Na2SeO3 (barra preta, sem H2O2) promoveu um discreto aumento na viabilidade celular na concentração de 200 nM.Quando expostas à 0,250 mM deH2O2por 6 horas (barra cinza), a viabilidade dos mioblastos foi reduzida em 50 % na ausência de Na2SeO3. Entretanto, a viabilidade celular aumentou na presença de concentrações crescentes de Na2SeO3, indicando que esta forma de selênio inorgânico foi capaz de prevenir o dano causado por H2O2. A concentração de 200 nM de Na2SeO3reverteu significativamente este dano. % d e cé lu la s vi áv ei s (n o rm al iz ad o p el o c o n tr o le ) Co nt ro le 50 10 0 20 0 Figura 11. Ensaio de viabilidade de mioblastos (C2C12) tratados com selenito de sódio (Na2SeO3) na ausência (barra preta) ou presença de 250 M deH2O2(barra cinza). Os mioblastos foram tratados com diferentes concentrações de Na2SeO3 (50, 100 e 200 nM) por 24 horas e expostos a 250 M de H2O2 nas últimas 6 horas de tratamento. A viabilidade foi medida pelo corante vital azul de tripan. Os valores representam média ± erro padrão da média (n = 3). * = p<0,05 em comparação com a mesma condição controle (sem H2O2). 35 4.2 Atividade da enzima creatina quinase (CQ) Uma das principais adaptações que o músculo esquelético realiza durante o exercício físico é o aumento da atividade da enzima creatina quinase, uma enzima responsável por regenerar o ATP a partir de creatina fosfato e ADP, mesmo em condições anaeróbicas (POIAN e CASTANHO, 2015). A Figura 12 mostra o resultado da atividade desta enzima na fração citosólica de mioblastos (C2C12) em condições controle e tratado com Na2SeO3 (200 nM) por 24 horas.O tratamento com Na2SeO3aumentou significativamente a atividade da CQ (Figura 10, barras pretas)comparado com os mioblastos controle (1,7 ± 0,15mmol creatina/mg proteína versus 1,5 ± 0,15 mmol creatina/mg, respectivamente). Para a indução do estresse oxidativo, nas frações citosólicas foram adicionados 0,250 mM de H2O2(0,250 mM), ficando em contato com a fração durante toda a atividade (Figura 10, barras cinzas), conforme descrito anteriormente. Observa-se que o H2O2 reduziu em 60 % a atividade da CQ na fração celular derivada de mioblastos controle, enquanto que o Na2SeO3 foi capaz de prevenir este efeito (Figura 12). A CQ possui resíduos de cisteínas em seu centro ativo, sendo este aminoácido sensível à oxidação por EROs (UEDA et al., 1999). Uma vez oxidados, os resíduos de cisteína promovem a inibição da atividade da enzima, fato este que pode explicar a baixa da atividade da CQ mostrada na barra cinza (Figura 12). O aumento da atividade da CQ no tratamento com Na2SeO3 pode ter ocorrido devido ao aumento da atividade da glutationa peroxidase. Esta enzima catalisa a reação de uma EROs ouERNs em espécies não oxidativas (FAIRWEATHER-TAIT et al., 2011; NELSON e COX, 2019). Ueda et al. (1998) demonstraram que baixas concentrações de Se implicam na redução da atividade da CQ, e que o processo de diferenciação de mioblastos é impactado negativamente em baixas doses deste elemento traço. Ardite et al. (2004)mostraram que células C2C12 aumentam os níveis de GSH quando estimuladas à diferenciação celular. Com isso, acredita-se que o tratamento com Na2SeO3 esteja aumentando o conteúdo de glutationa reduzida (GSH), o que aumentaria a atividade da glutationa peroxidase, diminuindo espécies reativas que afetam negativamente a atividade da CQ. 36 Figura 12. Atividade da enzima creatina quinase (CQ) na fração citosólica de mioblastos controle e tratados com Na2SeO3. As frações citosólicas foram incubadas durante 1 hora à 35 oC em meio de reação contendo KCl (10 mM), Tris-HCl (20 mM) pH 7,4,MgCl2 (5 mM), EGTA (1 mM), ADP (0,5 mM) e fosfocreatina (0,2 mM), na ausência ou presença de H2O2 (0,250 mM). Os valores representam média ± erro padrão da média (n = 3).*p<0,05 comparado com o controle (sem H2O2). # p<0,05 comparado com o controle (com 0,250 mM de H2O2). O aumento da atividade da CQ indica uma possível melhoria na capacidade do exercício físico, visto que a atividade desta enzima está relacionada com a diminuição da fadiga muscular(FERREIRA e REID, 2008). Uma metanálise de HAGSTROM et al.(2018) demonstrou que, em humanos, há uma correlação entre o aumento da atividade da CQ e o aumento do desempenho na atividade física. Mesmo que in vitro, o resultado da atividade da CQ é um possível indicador de que a suplementação com Se pode estar envolvida na capacidade física de adaptação ao exercício intenso. 4.3 Consumo de oxigênio mitocondrial O consumo de oxigênio em mioblastos controle e tratados com Na2SeO3 (200 nM) por 24 horas foi medido através de respirometria de alta resolução (OROBOROS, oxygraph 2K). Nesta técnica, 106 células foram colocadas em uma câmara hermética que contém um sensor polarográfico de oxigênio de alta sensibilidade. Acoplado a um computador com o software Oroboros O2k, as variações de concentração de oxigênio na câmara foram medidas em tempo real e a 37 taxa de consumo de oxigênio pela amostra foi calculada pela diferença ao longo do tempo. A Figura 13 mostra um gráfico representativo do oxígrafo, indicando a taxa de consumo de oxigênio em função do tempo de mioblastos intactos controle (linha vermelha) e tratados com Na2SeO3 (200 nM) por 24 horas (linha verde). Durante os 15 minutos iniciais, o fluxo de O2 foi estabilizado para avaliar o estado respiratório basal, onde os substratos mitocondriais endógenos produzidos pela célula estão sendo consumidos. Em seguida, foi adicionado oligomicina, um inibidor da porção Fo da ATP-sintase, o que reduziu o fluxo de oxigênio em razão da inibição da síntese de ATP. Dessa maneira, é possível estimar a taxa do consumo de oxigênio relacionada à síntese de ATP e também ao vazamento de prótons. Por último, foi realizada uma titulação com um desacoplador mitocondrial (FCCP) para avaliar a capacidade máxima respiratória. O FCCP é um protonóforo que interrompe a síntese de ATP ao transportar íons de hidrogênio pela membrana mitocondrial, ao invés do canal de prótons da ATP sintase. Isso causa um colapso no potencial da membrana mitocondrial, o que leva a um rápido consumo de energia e oxigênio sem a geração de ATP (NICHOLLS et al., 2010). Figura 13. Gráfico representativo da taxa de consumo de oxigênio de mioblastos intactos controle (linha vermelha) e tratados com Na2SeO3 (200 nM) por 24 horas (linha verde). As linhas azuis (horizontais) representam eventos de adição de oligomicina (inibidor da ATP sintase) e FCCP (desacoplador mitocondrial). Os valores estão representados em pmolO2/s*10 6 células. 38 O tratamento com Na2SeO3 (200 nM) por 24 horas promoveu um discreto aumento no consumo de oxigênio basal de mioblastos e elevou significativamente a capacidade respiratória máxima após a adição de FCCP, comparado com a condição controle (Figura 14). Estes efeitos poderiam estar associados ao aumento da atividade de complexos respiratórios específicos ou à um aumento da defesa antioxidante promovido pelo tratamento com Na2SeO3. Quispeet al. (2019) demonstraram que o tratamento com Se promove a proteção do dano causado pelo estresse oxidativo e que o tratamento aumenta a função mitocondrial. Neste mesmo trabalho, a linhagem de neurônios tratados com Se aumentou significativamente o consumo de O2 em comparação aos neurônios não tratados (QUISPE et al., 2019). No presente estudo, confirmou-se a hipótese de que células musculares tratadas com Se aumentam o consumo de O2, como observado na Figura 14. Figura 14. Consumo de oxigênio de mioblastos intactos controle (barra preta) e tratados com Na2SeO3 (200 nM) por 24 horas (barra cinza). As células foram ressuspendidas em meio DMEN sem SFB e o fluxo de O2 avaliado na condição basal e após as adições sucessivas de 0,4 μg de oligomicina (inibidor da ATP sintase) e no máximo 1 mM de FCCP (desacoplador mitocondrial). Os valores representam média ± erro padrão da média (n = 6). *p<0,05 em comparação com a mesma condição no grupo controle. Para compreender melhor o efeito do Na2SeO3 na respiração mitocondrial, os mioblastos foram permeabilizados com digitonina. A digitonina é uma saponina esteroidal, que interage com lipídeos de membrana, fazendo com que eles precipitem, promovendo pequenas perfurações na membrana, que culmina na degradação da mesma. Estruturas como núcleo e mitocôndrias no interior da célula permanecem intactas (PITHA e SZENTE, 1984). Desta maneira, substratos 39 respiratórios hidrofílicos têm acesso à mitocôndria e pode-se avaliar melhor o perfil de consumo de oxigênio de acordo com o substrato adicionado. A Figura 15 mostra um gráfico representativo do fluxo de oxigênio em mioblastos controle (linha vermelha) e tratados com Na2SeO3(linha verde) em resposta às adições sucessivas de digitonina (dig), piruvato e malato (P/M), succinato, ADP, oligomicina e FCCP. Quando P/M são adicionados, o Ciclo de Krebs é estimulado, o que leva a maior produção de NADH, gerando uma maior passagem de elétrons pelo complexo I, que são direcionados a ubiquinona, que posteriormente interage com os complexos III e IV. Figura 15. Gráfico representativo da taxa de consumo de oxigênio de mioblastos permeabilizados controle (linha vermelha) e tratados com Na2SeO3 (200 nM) por 24 horas (linha verde). As linhas azuis (horizontais) representam eventos de digitonina (dig), piruvato e malato (P/M), succinato, ADP, oligomicina e FCCP.Os valores estão representados em pmol O2/s*10 6 células. O succinato também é um intermediário do Ciclo de Krebs e a conversão deste a fumarato leva a produção de FADH2, substrato do complexo II que, assim como o complexo I, reduz a ubiquinona. O ADP é o substrato da ATP-sintase, que bombeia os prótons do espaço intermembranar para a matriz mitocondrial, estimulando a atividade dos complexos respiratórios e o consumo de oxigênio. Neste cenário, é possível medir a capacidade máxima fosforilativa. Como observado na Figura 16, tanto os mioblastos controle como os tratados com Na2SeO3, aumentaram drasticamente o consumo de O2 com a adição de ADP de forma semelhante. No entanto, a titulação com FCCP fez com que as células tratadas (linha verde) aumentassem o consumo de O2 desacoplado. Este efeito é semelhante ao encontrado anteriormente em células intactas (Figura 12) e confirma que as células tratadas possuem uma maior capacidade respiratória máxima. Para 40 melhor visualização do resultado, os valores do fluxo de oxigênio da Figura 15 foram extraídos e representados na Figura 16. Figura 16. Consumo de oxigênio de mioblastos permeabilizados controle (barra preta) e tratados com Na2SeO3 (200 nM) por 24 horas (barra cinza). O fluxo de O2 foi avaliado na condição basal e após as adições sucessivas piruvato e malato (P/M), succinato, ADP, oligomicina e FCCP.Os valores estão representados em pmol O2/s*10 6 células (n = 1). 4.4 Atividade dos complexos mitocondriais Mehtaet. al. (2012) demonstraram que o tratamento com Na2SeO3 em células HT22 em situação de hipóxia, possuem capacidade de restabelecer o perfil de consumo de O2 dos complexos I e IV após o dano causado por este estresse (MEHTA et al., 2012). Desta forma, a atividade dos complexos mitocondriais foi avaliada utilizando inibidores específicos. A Figura 17 mostra o gráfico representativo do consumo de oxigênio em mioblastos permeabilizados com digitonina (dig). Para avaliação da atividade do Complexo I, foram adicionados os substratos Piruvato/Malato, ADP eo inibidor rotenona. Para avaliação da atividade dos Complexos II + III, foram adicionados o substrato do complexo II succinato e o inibidor do complexo IIIantimicina. Para avaliação da atividade do complexo IV, foram adicionados TMPD e ascorbato, doadores de elétrons artificiais para o citocromo c. 41 Figura 17. Gráfico representativo da taxa de consumo de oxigênio de mioblastos permeabilizados controle (linha vermelha) e tratados com Na2SeO3 (200 nM) por 24 horas (linha verde). As linhas azuis (horizontais) representam eventos de digitonina (dig), piruvato e malato (P/M), ADP, rotenona (ROT), succinato, antimicina, TMPD e Ascorbato. Os valores estão representados empmol O2/s*10 6 células. A Figura 18 mostra as atividades específicas dos complexos mitocondriais. Aparentemente, não foram observadas diferenças na atividade dos complexos entre os grupos controle e tratado com Na2SeO3. Entretanto, é necessário confirmar este resultado devido ao reduzido número de experimentos (n = 2). Ba sa l Co m pl ex o I Co m pl ex o II + III Co m pl ex o IV Figura 18. Atividade específica dos complexos mitocondriais. A atividade do complexo I foi medida adicionando piruvato/malato e rotenona. Para o complexo II e III foi adicionado succinato e antimicina. O complexo IV foi estimulado com TMPD/ascorbado, porém a inibição por KCN promoveu um efeito não esperado, sendo o valor mostrado o consumo de O2 após a adição dos substratos. (n=2). 42 4.5 Atividade da enzima citrato sintase (CS) A enzima citrato sintase é uma enzima que faz parte do Ciclo de Krebs, que participa da conversão de oxaloacetato à citrato e é utilizada como marcador quantitativo de mitocôndrias (EIGENTLER et al., 2015; NELSON e COX, 2019). O aumento da atividade da enzima citrato sintase é um possível indicador de biogênese mitocondrial, visto que esta proteína mitocondrial é codificada por DNA nuclear (ANNEX et al., 1991). Para este experimento, o corante DTNB foi utilizado. Este reagente é oxidado concomitantemente a síntese de citrato. O resultado indica um possível aumento da atividade da CS no fracionamento citosólico das células tratadas com Na2SeO3(Figura 19). Entretanto, é necessário confirmar este resultado devido ao reduzido número de experimentos com grande variabilidade (n = 3). Figura 19.Atividade da enzima citrato sintase. Este experimento foi realizado com frações celulares de C2C12 controle e tratadas com Na2SeO3. Os valores representam média ± erro padrão da média (n = 3). A hipótese deste trabalho é que o tratamento com selenito de sódio previne o dano oxidativo muscular causado por EROs. A glutationa peroxidase e a tiorredoxina redutase são exemplos de selenoproteínas que estão envolvidas na redução de espécies reativas que geram estresse oxidativo, sendo a presença de selenocisteínas uma característica em comum dessas proteínas. A selenocisteína é sintetizada a partir do códon de parada UGA, um mRNA específico para selenoproteínas que utiliza selenocisteina-tRNA para produzir este aminoácido (DANIELS, 1996). Isto significa que um gene específico codifica a síntese de cada selenoproteína, e que de algum modo, o estado fisiológico de Se pode ser 43 geneticamente controlado (ARTUT, 1992; BÖCK et al., 1991; BURK e HILL, 1993; SUNDE, 1990; YOSHIDAet al., 1982). Acredita-se que o aumento da atividade antioxidante esteja relacionado à expressão de selenoproteínas maiores, com mais resíduos de selenocisteína, visto que o códon de parada da tradução de DNA passa a ser o códon de adição de um resíduo de aminoácido que dá a função da mesma proteína. A capacidade máxima respiratória em mioblastos tratados com Na2SeO3 foi significativamente maior em comparação com os mioblastos controle. Isso sugere que o Na2SeO3 está aumentando o suprimento de substratos para os complexos respiratórios e evitando uma disfunção no potencial mitocondrial. A adição de FCCP é uma condição artificial de estímulo de respiração mitocondrial que não resulta na síntese de ATP. Outra hipótese sobre este resultado é que a suplementação com Na2SeO3 esteja estimulando a síntese de mais mitocondrias, que consomem mais O2 em situações de demanda energética. Khera et al. (2015) demonstraram que a suplementação com Se induz a biogênese mitocondrial em trofoblastos, o que corrobora com o resultado obtido neste trabalho. A diferença da atividade da enzima citrato sintase nas células tratadas em comparação com as células controle, mesmo que não significativa, sugere que a biogênese mitocondrial esteja sendo estimulada. Mais experimentos precisam ser realizados a fim de confirmar esta hipótese. Os resultados obtidos neste trabalho corroboram com a literatura, visto que a suplementação com selênio está relacionada com o aumento da capacidade celular de reduzir os danos causados pelo estresse oxidativo (RAYMAN, 2012). Ma et al. (2015) demonstraram que o tratamento com Na2SeO3 faz com que neurônios em situação de estresse clivem menos caspase 3, uma via clássica de morte por estresse oxidativo. Isso pode estar ocorrendo nos mioblastos tratados, visto que as células permanecem viáveis mesmo na presença de peróxido de hidrogênio. Como a atividade física intensa causa danos ao organismo por meio do estresse oxidativo, a suplementação com selenito de sódio indica um possível alvo farmacológico a patologias causadas pelo exercício físico exaustivo. 44 5. Conclusão A viabilidade celular de mioblastos murinos (C2C12) é sensível ao H2O2. A dose necessária para reduzir aproximadamente 50% a viabilidade celular é de 0,250 mM por 6 horas; O tratamento com 200 nM de Na2SeO3por 24 horas demonstrou ser eficaz em manter as células viáveis em situação de estresse oxidativo causado por 0,250 mM de H2O2 durante 6 horas; A atividade da quinase aumentou na fração citosólica de células tratadas com Na2SeO3 (200 nM) durante 24 horas em comparação com a fração celular que não recebeu tratamento. Em situações de estresse oxidativo, o tratamento preveniu a redução da atividade creatina quinase significativamente, em comparação com o controle; As mitocôndrias de células tratadas com Na2SeO3 (200 nM)durante 24 horas possuem maior capacidade de consumir oxigênio, possivelmente sem alterar a atividade de um complexo mitocondrial específico; As células tratadas com Na2SeO3 (200 nM) por 24 horas mostram um pequeno aumento na atividade da citrato sintase em comparação com as células controle, embora não significativo. 45 6. Referencias ANNEX, B. H. et al. Mitochondrial biogenesis in striated muscles: rapid induction of citrate synthase mRNA by nerve stimulation. The journal of American Society, v. 260, p. 266–270, 1991. ARTUT, J. R. Selenium Metabolism and Function. Proceedings of the Nutrition Society of Australia, v. 17, p. 91–98, 1992. BAPTISTA, R. J. et al. Suboptimal Selenium Status in Home Parenteral Nutrition Patients with Small Bowel Resections. Journal of Parental and Enteral Nutrition, v. 8, n. 5, p. 542–545, 1984. BEHNE, D. et al. Cellular and Subcellular Distribution of Selenium and Selenium- Containing Proteins in the Rat. Trace Elements in Man and Animals, v. 10, p. 29– 34, 2000. BELLÓ, A. et al. Fisiologia Humana: Uma Abordagem Integrada. São Paulo: 2017. BIERLA, K. et al. Determination of selenocysteine and selenomethionine in edible animal tissues by 2D size-exclusion reversed-phase HPLC-ICP MS following carbamidomethylation and proteolytic extraction. Anal Bioanal Chem, v. 390, p. 1789–1798, 2008. BLEYS, J.; NAVAS-ACIEN, A.; GUALLAR, E. Serum Selenium and Diabetes in U.S. Adults. Diabetes Care, v. 30, n. 4, p. 829–834, 2007. BLEYS, J.; NAVAS-ACIEN, A.; GUALLAR, E. Serum Selenium Levels and All-Cause, Cancer, and Cardiovascular
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