Critérios para identificação de leveduras

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Curso de Bacharelado em Biomedicina
CRITÉRIOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE
LEVEDURAS
Trabalho apresentado à unidade de
ensino Micologia e Virologia, do Curso de
Bacharelado em Biomedicina da
Faculdade de Minas – UNIFAMINAS,
como requisito parcial à sua
integralização.
Professora: Fernanda Mara
Acadêmicos (as): Douglas Cesso, Kayo
Moreira e Roberta Ramos.
Período: 8°
Muriaé-MG
19 de setembro de 2017
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO........................................................................................2
2. DESENVOLVIMENTO……………..…………………………..…………….3
2.1. Características macroscópicas e microscópicas das leveduras…….
2.2. Características bioquímicas das leveduras…………………………....
3. CONCLUSÃO..........................................................................................8
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................9
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1. INTRODUÇÃO
Os fungos são seres vivos eucariotos, que possuem um único núcleo.
Algumas formas, podem ser visualizados macroscópicamente (como os
cogumelos) e outras, microscópicas (como os bolores e as leveduras)
(FISHER; COOK, 2001).
Em relação as diferenças dos fungos, existem aqueles que são
extremamente prejudiciais a saúde humana, causando inúmeras enfermidades
e até intoxicação, conhecidos como micoses; alguns podem ser encontrados
na decomposição de materiais; outros podem ser utilizados na fabricação de
alimentos, medicamentos, etc. Os fungos, constituem um grupo de
microrganismos que afetam qrande parte da população, e são de grande
interesse na área de estudos e na área da saúde humana (KERN; BLEVINS,
1999).
Esses microorganismos, são classificados como filamentosos ou bolores
e fungos leveduriformes ou leveduras, formando diversas estruturas; sendo a
principal delas, os esporos. É através desta estrutura, que gera diversas vias
de dispersão dos fungos, sendo encontrados em toda a biosfera: no solo, na
água, no ar e nos hospedeiros (animais e vegetais). Quando os fungos
encontram um substrato com nutrientes adequados, eles crescem e se
colonizam. Dessa maneira, podem deteriorar diversos tipos de materiais e\ou,
ocasionar diversas micoses e outras doenças nos hospedeiros (SIDRIM;
ROCHA, 2010).
A principal via de dispersão dos fungos, é o ar atmosférico que ocorre
através dos ventos. Os fungos que se dispersam pelo ar atmosférico são
chamados de fungos anemófilos, sendo de grande importância em alergias que
ocorrem nos seres vivos e também possuem função de deterioração de
diversos materiais (FISHER; COOK, 2001).
Através de métodos de identificação específicos, os fungos podem ser
isolados em seu habitat, através das vias de dispersão, dos materiais
contaminados e dos diversos hospedeiros com micoses. A identificação de
leveduras ao nível de espécie, têm significância prognóstica e terapêutica, e
permitem o início precoce de terapia antifúngica nos casos de doença
sistêmica. Portanto, o objetivo deste estudo, foi mostrar os principais tipos de
identificação e detecção das leveduras, os fungos.
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2. DESENVOLVIMENTO
2.1. Características macroscópicas e microscópicas das leveduras:
A identificação dos fungos são baseadas, devido a sua morfologia
macroscópica e microscópica.
Quando falamos em identificação macroscópica, isso quer dizer que os
fungos podem apresentar vários tipos de morfologias, como: colônias
filamentosas, pulverulentas, bolores e cremosas (leveduras) e com diversos
tipos de colorações.
A unidade estrutural dos fungos é chamada de hifa, e o conjunto desses
elementos é denominado micélio. O micélio pode ser diferenciado em
vegetativo e reprodutivo. O micélio vegetativo, exerce funções de assimilação
de alimentos e fixação em substratos, podendo apresentar células redondas,
ovóides ou alongadas e podem se reproduzir por brotamento, cissiparidade ou
por outro processo. Já o micélio reprodutivo, como o próprio nome diz, serve
para a realização da reprodução dos fungos, podem ser hialinos, pigmentados,
simples, septados, apresentando várias formas que muitas vezes definem
gêneros ou espécies de fungos, sendo muito importantes para sua
identificação. As leveduras filamentosas, pode se apresentar-se com ou sem
septos.
O estudo morfológico dos fungos filamentosos contribui para a
identificação dos mesmos, inclusive no nível de gênero e espécie. Para exame
macroscópico, deve ser avaliada a morfologia da colônia, observando-se
tamanho, superfície, bordas e pigmentação, entre outras características. O
exame microscópico deve ser realizado, preferencialmente, empregando-se a
técnica de microcultivo de Ridell. Para o exame microscópico de fungos
leveduriformes, o preparo de esfregaços é realizado de maneira semelhante à
empregada para confecção de lâminas de bactérias.
● Leveduras do gênero Candida: Normalmente essas espécies atuam
nos seres humanos saudáveis em locais como a vagina, a boca e a
pele. Na boca, a candidíase se manifesta como placas brancas. A
infecção oral por Candida tem função marcadora no indivíduo
HIV-positivo em relação ao desenvolvimento da AIDS, sendo infecção
secundária comum em pacientes imunodeficientes. A doença, também
atinge áreas de dobras cutâneas, como região abaixo das mamas, entre
os dedos, virilhas e axilas. Em meio sólido, como o Sabouraud, as
colônias se apresentam cremosas de coloração branca ou bege. Na
microscopia, podem ser observados estruturas como blastoconídios com
ou sem brotamentos, clamidoconidios e pseudo-hifas – que se formam
quando os blastoconidios que nascem, se alongam e não se
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desprendem da célula que o originou.
● Leveduras do gênero Paracoccidioidomicose: é uma micose
profunda, com ampla gama de manifestações clínicas e patológicas. A
doença pode atingir os pulmões, predominantemente em adultos do
sexo masculino. Na boca, as lesões geralmente envolvem várias áreas,
com aspecto granular, eritematoso e ulcerado. O quadro microscópico,
caracteriza-se por hiperplasia pseudoepiteliomatosa, microabscessos
intraepiteliais, infiltrado inflamatório mono e polimorfonuclear, presença
de células gigantes e granulomas, além de quantidade variável do fungo
na forma de levedura. Suas células, podem ser encontradas na forma
arredondado, esférico ou oval. Na maioria das vezes exibem célula mãe
com brotamentos múltiplos, ligados por um pedúnculo, que é sua
característica mais evidente, também conhecido como cabeça de
mickey.
● Leveduras do gênero Rhodotorula: Este tipo de levedura, atinge
pulmões, vias urinárias, endocardite, meningite, fungemia, ceratite
micótica e peritonite. Para a identificação da espécie, pode-se utilizar
materiais de líquor, sangue, urina, secreções respiratórias, fragmentos
de tecidos da pele ou da córnea. Macroscopicamente, suas colônias
possuem coloração vermelho-alaranjado, com textura lisa e úmida ou
mucóide quando leveduras capsuladas. Microscopicamente, suas
células contêm paredes finas isoladas ou em cadeias curtas, sendo
encontrados na forma de blastoconídios.
● Leveduras do gênero Trichosporon: infecção fúngica superficial do
pêlo conhecida como “Piedra Branca”, devido a presença de nódulos
irregulares e macios aderidos ao pelo e visíveis a olho nu. Infecções
cutâneas e profundas causadas por este patógeno estão se tornando
mais comuns em pacientes severamente comprometidos.O gênero
Trichosporon é um fungo leveduriforme que se desenvolve rapidamente
em meio de cultivo formando colônia de coloração branco – amarelada,
inicialmente lisas, e com o tempo tornando – se rugosas. Este agente
possui septo em suas hifas. Os artroconídeos e blastoconídeos
capsulares estão presentes nos pelos parasitados. Microscopicamente,
observa-se micélio abundante, artroconídeos de tamanhos variados e
pseudomicélios.
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2.2. Características bioquímicas das leveduras
Bioquimicamente, são investigadas a capacidade que as leveduras
têm de utilizar determinados carboidratos e compostos nitrogenados como
fontes de carbono e nitrogênio (auxanograma utilizando meio C e m eio
N) e a capacidade de fermentar alguns carboidratos (zimograma). Podemser pesquisadas também a produção de urease ou fenoloxidase.
2.2.1. Prova do tubo germinativo
Método simples de triagem que permite a distinção presuntiva
entre Candida albicans ou C. dubliniensis (tubo germinativo positivo) de
outras espécies de levedura (tubo geminativo negativo).
O tubo germinativo é uma projeção alongada, que emerge da
levedura quando esta entra em contato com soro à temperatura de 37°C
durante 2 a 3 horas.
Retira-se uma alíquota da colônia de levedura inocula em um tubo
contendo soro de coelho, fetal bovino ou de cavalo suspensão é incubada
a 37°C durante 2 a 3 horas. Depois, é realizada a remoção de uma gota
da suspensão, que é examinada ao microscópio óptico.
Não se pode confundir tubos germinativos com pseudo -hifas; o
tubo germinativo é asseptado, sem constrição no ponto de inserção entre
a projeção crescente e o blastoconídio, enquanto a pseudo-hifa pode ser
septada ou não, e apresenta ponto de constrição em sua base.
Resultados falso-negativos podem ocorrer em portadores de
neoplasia submetidos a quimioterapia, ou no exame de pacientes tratados
com antifúngicos, ou quando o inóculo é pesado (alíquota muito grande
de levedura) ou, ainda, quando há refrigeração prolongada do soro.
O falso-positivo é observado raramente, quando a incubação se
prolonga por mais de 3 horas.
2.2.2. Prova do microcultivo (DALMAU, 1929)
Possibilita o estudo micromorfológico das leveduras em meio
ágar-fubá-Tween 80 ou ágar-arroz-Tween 80 incubação das leveduras em
meio com Tween 80 e sob baixa tensão de oxigênio estimula a produção de
conídios e filamentação, sendo possível sugerir o gênero, ou até mesmo
a espécie, através do estudo da presença e disposição dos blastoconídios,
artroconídios, hifas verdadeiras e pseudo-hifas.
A presença de clamidoconídios é característica de C. albicans ou
de C. dubliniensis, sendo seu melhor desenvolvimento no extrato de arroz,
enquanto o de blastoconídios é intensificado no fubá.
Presença de blastoconídios sem hifas ou pseudo-hifas, é indicativo de
Cryptococcus spp., Candida glabrata, Rhodotorula spp. ou Saccharomyces
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spp. Presença de artroconídios, blastoconídios e hifas, Trichosporon spp.
Presença apenas de hifas e artroconídios, é indicativo de Geotrichum
candidum.
Em geral é preciso realizar provas bioquímicas adicionais para confirmar
a identificação.
2.2.3. Uso de meio cromogênico
São meios de cultivo capazes de gerar o crescimento de colônias de
cores distintas, segundo a espécie de levedura.
O CHROMagar Candida, é um meio capaz de fazer a identificação
presuntiva das espécies de levedura mais comumente isoladas de
material clínico e de facilitar o reconhecimento de culturas mistas de
leveduras.
O seu princípio: é a produção de cor das colônias por reações
enzimáticas espécie-específicas, com um substrato cromogênico do meio.
Sensibilidade e especificidade do meio excede 99% para C. albicans,
C. tropicalis e C. krusei (colônias verde, azul e rosa-pálido, respectivamente).
2.2.4. Identificação de Candida dubliniensis
Primariamente associada com a colonização e infecção da
cavidade oral de pacientes HIV -soropositivos, sendo relatada também em
casos de infecção sistêmica associada à imunodeficiência.
Compartilha muitas características com C. albicans, o que torna difícil a
distinção.
Podem ser isolados de ambas as espécies crescem a 30 e 3 7°C,
produzem colônias de cor creme em ASD, produ zem tubo germinativo e
clamidoconídios e apresentam perfil bioquímico semelhante; a
discriminação baseia-se em métodos moleculares como PCR, RAPD e PFGE.
2.2.5. Assimilação de carboidratos
Testa a capacidade de crescimento da levedura em aerobiose
frente a uma fonte de carbonos: glicose, lactose, maltose, trealose,
xilose, dextrose (controle positivo) entre outros açúcares, fornecidos como
única fonte de energia (meio YNB ou meio “C”). É chamada de assimilação
em meio sólido auxanograma ou técnica auxanográfica.
Utiliza-se ágar destituído de qualquer fonte de carbono adiciona-se a
suspensão da levedura, que é distribuída na placa utilização de discos de
papel de filtro impregnados com os diferentes carboidratos positividade é
avaliada através da observação de halo de crescimento da levedura em
presença do carboidrato fornecido.
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2.2.6. Assimilação de nitrogênio
Testa a habilidade que uma levedura tem de crescer aerobiamente
na presença de um composto nitrogenado fornecido como única fonte de
energia.
Essa técnica auxanográfica emprega meio de ágar YCB ou YNB
destituído de qualquer fonte de nitrogênio, adicionado da suspensão da
levedura e distribuído em placa depois são aliquotados compostos
nitrogenados sobre o ágar a positividade é avaliada por meio do
crescimento da levedura em presença do composto fornecido (geralmente
peptona como controle positivo e nitrato de potássio).
2.2.7. Zimograma ou fermentação de carboidratos
Habilidade que uma levedura tem de crescer anaerobiamente na
presença de determinado açúcar fornecido como única fonte de energia,
observada através da produção de gás carbônico e alteração de pH.
Classicamente é realizada em meio líquido suspensão da levedura
é inoculada em tubo de ensaio contendo meio de cultura, solução do
açúcar a 2 % e um tubo de Durham invertido positividade é observada
através da produção de gás no interior do tubo de Durham e da mudança da
coloração do meio, quando se utiliza um indicador de pH.
2.3. Características sexuais das leveduras
Segundo Kreger-van Rij (1984), leveduras são fungos unicelulares que
se reproduzem por brotamento ou cissiparidade, incluindo Ascomicetos,
Basidiomicetos e Deuteromicetos. As chamadas leveduras imperfeitas ou
anascoporadas possuem afinidades com ambos os grupos.
Alguns micologistas restringem o termo levedura à fungos de
brotamento unicelular, com a possibilidade de reprodução sexuada, e a palavra
leveduriforme a fungos semelhantes ou afins, que se reproduzem
assexuadamente.
Segundo Kwon-Chung e Bennett (1992), as leveduras englobam
estruturas somáticas globosas, ovais ou alongadas, reproduzindo-se por
brotamento ou cissiparidade. Algumas vezes, as gêmulas formam cadeias de
células alongadas, denominadas pseudo-hifas. Assim, leveduras do gênero
Candida produzem pseudo-hifas e hifas verdadeiras, dependendo das
condições de crescimento, enquanto as células somáticas de Cryptococcus
reproduzem-se somente por brotamento. As espécies de Cryptococcus
produzem hifas somente em seu ciclo sexuado.
As leveduras reproduzem-se por brotamento único, fissão binária ou
cissiparidade e por brotamento-fissão. O brotamento pode ser unipolar, bipolar
e multilateral.
A reprodução sexuada efetua-se pela conjugação de duas células
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haploides, com núcleos compatíveis, seguindo-se os mecanismos de
plasmogamia, cariogamia e meiose, resultado uma célula diploide com a
quantidade dupla de cromossomos.
As leveduras são classificadas em:
2.3.1. Ascosporadas
Caracterizam-se pela formação de ascos e ascósporos em número
definido a cada espécie. Pertencem à classe Ascomycetes, famílias
Spermophthoracecae e Saccharomycetaceae. Várias leveduras no estado
anamorfo apresentam seus estados telemorfos na divisão Ascomycota.
Ex: Candida parapsilosis – Lodderomyces ellongisporus.
2.3.2. Anascoporadas
São aquelas que não apresentam ascos nem ascósporos, pertencendo
à subdivisão Deuteromycotina, classe Blastomycetes, família Cryptococcaceae.
Várias leveduras no estado anamorfo apresentam telemorfos nas classes
Ascomycetes e Basidiomycetes, como: Candida famata (fungo imperfeito) –
Debaryomyces basenii (ascomiceto); Candida japônica (fungo imperfeito) –
Filobasidium capsuligenum (basidiomiceto).
2.3.3. Balistosporadas
Caracterizam-se pela formação de balistosporos de formas variadas,
posteriormente expelidos de curtos dentículos das células vegetativas.
Pertencem à subdivisão Deuteromycotina, classe Blastomycetes e família
Sporobolomycetaceae, na qual estão incluídos os gêneros Buller e
Sporobolomyces. Sporobolomyces albo-rubescens é sinanamorfo de
Rhodotorularubra.
2.3.4. Basidiosporados
Estão incluídas as leveduras pertencentes à subdivisão
Basidiomycotina, ordens Ustilaginales e Tremellales, família Filobasidiaceae,
Sirobasidiaceae, Tremellaceae e as que formam teliosporos. As leveduras
basidiosporadas, conforme o gênero, possuem hifas septadas com ou sem
ansas (grampos de conexão), blastoconídios com brotamentos, basidióforos
com basídios e basidiósporos exógenos, teliosporos intercalares ou terminais,
promicélio e esporídios. Vários anamorfos como Candida e Cryptococcus
possuem teleomorfos na classe Basidiomycetes.
2.3.5. Provas para classificação de leveduras
As leveduras em seus estados anamorfos podem, quando apresentam
estados teleomorfos, serem classificadas como ascomiceto ou basidiomiceto,
pela utilização de várias provas como:
1. Reação dos blastoconídios em presença de azul de diazônio. Com
esse corante, os ascomicetos não são corados e os basidiomicetos
apresentam tonalidade vermelha;
2. A urease está geralmente ausente nos ascomicetos e quase sempre
presente nos basidiomicetos;
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3. A porcentagem de guanina e citosina do DNA é menor nos
ascomicetos e maior nos basidiomicetos;
4. A fermentação é frequente nos ascomicetos e infrequente nos
basidiomicetos;
5. Coenzimas Q-6 e Q-9 são detectadas nos ascomicetos e Q-8 e Q-10
nos basidiomicetos.
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3. CONCLUSÃO
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4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA
1. CORRÊA, B.; TABORDA, C. P.; BARROS, M. H.; Roteiro de aulas práticas
micologia. BMM 280- Microbiologia básica - MEDICINA.
2. VILLALBA, H. Características microscópicas da paracoccidioidomicose
bucal. Faculdade de odontologia de Piracicaba - UNICAMP, 1998.
3. FISHER, F.; COOK, N. B. Micologia: fundamentos e diagnóstico. Rio de
Janeiro: Revinter, 2001.
4. SIDRIM, J. J. C.; ROCHA, M. F. G. Micologia médica: à luz de autores
contemporâneos. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2010.
5. ARAÚJO, I. R. A.; MARQUES, S. G. Tricosporonose: etiologia,
manifestações clínicas, diagnósticos laboratoriais, epidemiologia e
tratamento. Disponível em:
<http://congressos.ifal.edu.br/index.php/connepi/CONNEPI2010/paper/viewFile/
1134/634>.
6. KERN, M. E.; BLEVINS, K. S. Micologia médica: texto e atlas. São Paulo:
Premier, 1999.
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Critérios para Identificação de Leveduras
1. Reação dos blastoconídios em presença de azul de diazônio. Com esse
corante, os ascomicetos não são corados e os basidiomicetos
apresentam tonalidade vermelha;
2. A uréase está geralmente ausente nos ascomicetos e quase sempre
presente nos basidiomicetos;
3. A porcentagem de guanina e citosina do DNA é menor nos ascomicetos
e maior nos basidiomicetos;
4. A fermentação é frequente nos ascomicetos e infrequente nos
basidiomicetos;
5. Coenzimas Q-6 e Q-9 são detectadas nos ascomicetos e Q-8 e Q-10
nos basidiomicetos.
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