GUIA CROMATOGRAFIA pub1 2019

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QUÍMICA ANALÍTICA II 
GUÍA DE ESTUDIO 
CROMATOGRAFÍA 
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA 
FAC. DE CIENCIAS BIOQUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS 
2019
2 
1. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
1) Realice una clasificación general de los diferentes mecanismos de separación cromatográficos,
indique la naturaleza del las fases y el tipo de interacción que tiene lugar en cada caso. Dé algunos 
ejemplos de los métodos comprendidos 
1.1 CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS 
 A. Equipamiento 
1) Dibuje un diagrama de bloques e identifique los componentes fundamentales de un cromatógrafo
de líquidos de alto rendimiento. 
2) Explique la diferencia en realizar una cromatografía líquida en modo isocrático y en gradiente de
elución. Indique las ventajas y desventajas de cada modo de trabajo. 
 B. Modos de la Cromatografía Líquida (se puede utilizar el cuadro del item 1). 
1) Justificar las siguientes aseveraciones:
a- Las moléculas de baja polaridad se separan fácilmente en una cromatografía de fase reversa. 
b- El tiempo de retención de los solutos en cromatografía de exclusión no se puede modificar 
cambiando la polaridad de la fase móvil. 
2) Si el tiempo de retención de un componente A es mucho mayor que el de un componente B, qué
conclusión obtiene acerca de la naturaleza de los analitos en: 
a-Una cromatografía de permeación en gel b-Una cromatografía de fase reversa. Justifique 
3) a- Realice una clasificación de tipos de resinas de intercambio iónico, indicando grupo iónico
fijo y contra ión (ión intercambiado). 
b-Indicar los efectos de aumentar el entrecruzamiento en las columnas de intercambio iónico 
 C. Variables termodinámicas y cinéticas. Su incidencia en la CL 
1) Discutir las siguientes aseveraciones:
a- La posición de las bandas de los compuestos en un cromatograma es función de sus constantes 
termodinámicas. 
b- La modificación de parámetros cinéticos (N y H) impacta en el ancho de las bandas del 
cromatograma y no en su posición. 
2) En un análisis por HPLC (High Performance Liquid Chromatography: Cromatografía líquida de
alto resolución) con detección UV, en columna de 15 cm, se analizan múltiples contaminantes. Dos 
de ellos (carbaril y 1-naftol) registran tiempos de retención de 3,4 y 3,8 minutos, con ancho de base 
de 0,4 minutos en ambas bandas. El pico de un compuesto no retenido ocurre a 1 minuto de la 
inyección. Calcular: 
- los factores de retención (k’), indicando qué miden y justificar si en este caso sus valores son 
adecuados. 
- el factor de separación (α) indicando qué mide este parámetro. 
- el n° promedio de platos teóricos. 
- la altura promedio del plato (en mm). 
- la resolución entre ambos picos, justificando si la separación es o no completa. 
3 
3) Los siguientes datos corresponden a una cromatografía L-L de fase ligada (250 mm de empaque)
Compuesto Tiempo de retención (min) Ancho de base (min) 
compuesto no retenido 0.5 
sacarina 3.8 0.2 
cafeína 5.9 0.7 
Calcular el número promedio de platos teóricos (N), la altura promedio del plato (H) y la resolución 
para dichos compuestos indicando si se separan. 
4) Una mezcla de cafeína y fosfato de piridoxal (vitamina B6) se separa en una columna C18 con
una fase móvil metanol:agua 30:70 (v/v). En estas condiciones indicar: 
a- El orden de elución, sabiendo que el fosfato de piridoxal es más polar que la cafeína (ver 
estructuras químicas). 
b- Si el tiempo de retención del analito más retenido fuera muy alto (factor de capacidad mucho 
mayor a 5), cómo procedería para disminuirlo si dispone solamente de esa columna. 
 c-Discuta los ítems 4a y 4b si se hubiera resuelto la mezcla con una cromatografía de fase normal 
 d- ¿Qué término de Van Deemter incide más en el valor H en una cromatografía líquida de alto 
rendimiento con fase estacionaria líquida? 
Cafeína Fosfato de piridoxal 
 D. Análisis Experimental. Cuantificación 
1) Discutir el impacto de las siguientes situaciones en el desarrollo del análisis cromatográfico:
a- El analista utiliza una fase móvil a la que no desgasificó suficientemente por lo tanto sigue 
teniendo burbujas. Justifique su respuesta, incluyendo los distintos modos de desgasificación. 
b- El analista inyecta una muestra de suero (matriz compleja) y no utiliza una columna guarda. 
c- El analista realiza una cromatografía usando como fase móvil metanol: buffer acetato de 
sodio/ácido acético pH=5. Cuando finaliza el trabajo, lava la columna durante una hora directamente 
con metanol. ¿Qué problema puede acarrear este procedimiento? Discuta las condiciones óptimas de 
lavado y guardado de una columna 
2) Para cuáles de los siguientes casos aplicar HPLC será una buena opción de análisis, justifique: 
a- Estudio de la composición del humo del cigarrillo 
b- Determinación de ácido ascórbico (vitamina C) en tabletas 
c- Determinación de cafeína en bebidas 
d- Determinación de azúcares 
3) Una mezcla conocida de los compuestos C y D produce los siguientes resultados en HPLC:
Compuesto Concentración (mg mL-1) en la mezcla Área del pico (cm2) 
C 1.03 10.86 
D 1.16 4.37 
4 
Se prepara una solución mezclando 12.49 mg de D más 10,00 mL de una solución que sólo contiene 
C y se diluye a 25,00 mL. La áreas de los picos son de 5.97 y 6.38 cm2 para C y D respectivamente. 
Hallar la concentración de C (mg mL-1) en el problema 
4) Se desea corroborar el contenido del antiinflamatorio piroxicam en un comprimido (valor
nominal: 10 mg por comprimido). Para ello, se pesan 12.9 mg del comprimido (peso promedio del 
comprimido 632 mg), se agrega HCl metanólico, se filtra y se enrasa con HCl metanólico en matraz 
de 5.00 mL. Se inyectan 25 uL de esta solución en el cromatógrafo (HPLC con detector 
fluorescente) y se obtiene una señal cuya altura equivale a 3.08 unidades de fluorescencia. Se 
prepara también un testigo disolviendo 6.8 mg de patrón en 25.00 mL de HCl metanólico. Se toman 
10.00 mL de esta solución y se diluyen a 50.00 mL con HCl metanólico. Se inyectan en el 
cromatógrafo 25 uL de este testigo produciendo una señal de 4.10 unidades de fluorescencia. 
Calcular el contenido de antiinflamatorio en el comprimido 
1.2 CROMATOGRAFÍA DE GASES 
A. Equipamiento 
1) Dibuje un diagrama de bloques e identifique los componentes fundamentales de un cromatógrafo
de gases. 
2) Describir los distintos tipos de columnas utilizadas en cromatografía de gases, indicando en cada
caso la disposición de la fase estacionaria dentro de la columna. 
3) Comparar las propiedades de una columna tubular abierta con las de una columna empaquetada.
4) ¿Qué ventajas tiene una fase estacionaria ligada en CG?
5) ¿Por qué el detector de conductividad térmica responde a todos los analitos excepto al gas
portador? 
 B. Variables termodinámicas y cinéticas 
1) Los siguientes datos fueron obtenidos por medio de un cromatograma gas líquido, en una
columna de 1.50 m., cuya fase estacionaria es de escualeno (no polar). 
Compuesto tr (min) w (min) 
no retenido 3 – 
benceno (PE 80 °C) 10 1.1 
hexano (PE 68 °C) 11 1.4 
Calcular: 
a- El tiempo de retención corregido (tr') para cada compuesto. 
b- El número promedio de platos (N prom.). 
c- La resolución (R) entre ambos picos y decir si se logra la separación. 
d- En base a los datos obtenidos grafique un cromatograma, respetando las escalas. Considere que el 
hexano es el compuesto que está en mayor concentración. 
e- ¿Cómo se puede mejorar la resolución entre dos picos próximos en CG? 
2) Los siguientes tiempos de retención y ancho de picos fueron observados en una columna gas-
líquido de 1,50 m, rellena con FE muy polar, de composición química del tipo del etilen glicol. 
5 
Compuesto tr (min) w (min) 
no retenido 0.40 - 
hexano – PE 68 °C 4.60 0.35 
1-metiletil metanoato (MEM) – PE 68 °C 5.00 0.37 
Calcular: 
a- El factor de capacidad (k) para cada sustrato. 
b- El factor de selectividad (α). 
c- La altura equivalente del plato teórico (AEPT o H). 
3) Para determinar la op de una CGL,se procede a inyectar alícuotas iguales de una misma
muestra, a distintas velocidades de flujo cada vez y se registra en cada caso el tiempo de retención 
(tr) y los anchos de pico (w). Los datos obtenidos son los siguientes: 
Alícuota tr (min) w (min)  (cm/seg) 
1 5.53 0.70 5 
2 8.58 0.85 10 
3 11.33 0.80 20 
4 11.64 0.85 30 
5 11.92 0.90 40 
6 12.16 1.00 50 
7 6.9 0.70 70 
a- Con esta información dibuje la curva de Van Deemter, indicando en la gráfica la op y la Hmin. 
La longitud de la columna es de 90 cm. 
b- ¿Qué proceso dispersivo está incluido en cada término de la ecuación de Van Deemter? 
c- ¿Por qué la difusión longitudinal (término B) es un problema más serio en CG que en CL? 
d- ¿El término A de Van Deemter se presenta en una columna capilar abierta? Justifique. 
 C. Análisis experimental. Cuantificación 
1) ¿En qué casos es conveniente derivatizar un analito antes de realizar un análisis por CG?
2) Justifique en qué casos es conveniente trabajar en condiciones isotérmicas y qué significa hacerlo
en gradiente de temperaturas. Compare ambos procedimientos, indicando cuándo se eligen y qué 
ventajas y desventajas poseen. 
3) Se desea determinar la concentración de etanol en sangre mediante un método cromatográfico
utilizando patrón interno. Para ello se procesan, de la misma manera, una serie de soluciones 
acuosas patrón de etanol y una muestra de suero: una alícuota de 0.01 mL de cada solución se 
diluyen con 0.1 mL de una solución patrón de 2-propanol 0.1mg/mL. Se inyectan 0.1 uL de cada 
solución en un CG provisto de un detector FID (ionización de llama), un integrador y una columna 
PEG-400 (polietilenglicol) a 80 °C. Los resultados obtenidos fueron los siguientes: 
6 
Patrones de etanol 
(mg/mL) 
Medida del integrador 
Pico del etanol Pico del propanol 
0.5 5518 12754 
0.75 7563 11893 
1.0 10350 12084 
1.25 13935 12870 
1.5 15628 12314 
Muestra de sangre 9862 12604 
a- Construir el gráfico de calibración correspondiente y a partir de este gráfico determinar la 
concentración de etanol en la muestra de sangre. 
b- ¿Qué ventajas tiene emplear las áreas integradas de los picos en vez de sus alturas para realizar la 
cuantificación 
c- Qué se entiende por patrón interno en CG; cuál es el objetivo de su uso y en qué casos se indica 
utilizarlo. 
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RESPUESTAS 
1. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
1) 
MECANISMO DE 
SEPARACIÓN 
NATURALEZA DE LA FASE INTERACCIÓN 
F. MÓVIL F. ESTACIONARIA 
Partición Líquida o gaseosa Líquida convencional y fase 
ligada 
Solubilidad (ver 
interacciones en fase normal 
y fase reversa) 
Adsorción Líquida o gaseosa Sólida Fuerzas de Van der Waals y 
enlaces hidrógeno 
Intercambio iónico Líquida Resina Fuerzas electrostáticas 
Exclusión molecular Líquida Gel poroso Tamizado 
Afinidad Líquida Sólido Reacción especifica 
Ejemplos de métodos: 
Partición. Planar (papel, HPTLC) – Columna (LLC clásica, HPLC, GLC) 
Adsorción. Planar (TLC, HPTLC) – Columna (LSC clásica, HPLC, GSC) 
Intercambio iónico. Columna (IEC) 
Exclusión molecular. Columna (MEC) 
Afinidad. Columna (AC) 
Siendo: 
HPTLC= High Performance Thin Layer Chromatography; Cromatografía de Capa Delgada de Alta 
Resolución. 
LLC= Liquid-Liquid Chromatography; Cromatografía Líquida -Líquida. 
HPLC=High Performance Liquid Chromatography; Cromatografía Líquida de Alta Resolución. 
GLC= Gas- Liquid Chromatography ; Cromatografía Gas - Líquido. 
TLC=Thin Layer Chromatography; Cromatografía de Capa Delgada. 
LSC= Liquid -Solid Chromatography; Cromatografía Líquido - Sólido. 
GSC= Gas - Solid Chromatography; Croamtografía Gas - Sólido. 
IEC= Ion Exchange Chromatography; Cromatografía de Intercambio Iónico. 
MEC: Molecular Exclusion Chromatography ; Cromatografía de Exclusión Molecular. 
AC= Affinity Chromatography; Cromatografía de afinidad 
1.1 CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS 
A. Equipamiento 
1) Buscar información en la bibliografía sugerida y clases de teoría
2) En la cromatografía líquida en modo isocrático la composición de la fase móvil se mantiene
constante durante todo el desarrollo cromatográfico. En el modo gradiente de elución la 
composición de la fase móvil se modifica en forma continua o escalonada con el fin de optimizar las 
separaciones. Se selecciona el modo isocrático si los tiempos de retención son tales que garantizan 
valores adecuados de k y α. Este modo es más sencillo de implementar porque requiere 
equipamiento más simple (bomba isocrática) y, en general, es menos contaminante porque limita el 
uso de solventes orgánicos. Como desventaja, no es útil en sistemas que incluyen compuestos con 
8 
polaridades muy disímiles (algunos compuestos saldrían cercanos a la inyección y otros saldrían a 
tiempos experimentales impracticables). Trabajar con gradiente de elución tiene la ventaja de 
resolver exitosamente y en tiempos apropiados sistemas constituidos por analitos de distinta 
polaridad, pero posee la desventaja de requerir un instrumental más sofisticado (necesita al menos 
una bomba binaria). Por otro lado, al poder combinar distintos solventes orgánicos y/o aumentar su 
proporción durante el desarrollo cromatográfico aumenta, en general, la generación de desechos 
tóxicos, considerándose menos "verde". 
B. Modos de la Cromatografía Líquida (se puede utilizar el cuadro del item 1). 
1) a- Al elegir una columna para una separación cromatográfica de reparto, la polaridad de la fase
estacionaria debe ser similar a la de los analitos, y para la elución se utiliza una fase móvil con una 
polaridad considerablemente distinta (pero que disuelva los analitos). 
b- En cromatografía de exclusión, un cambio en la polaridad de la fase móvil no tiene efecto 
significativo sobre los tiempos de retención ya que la retención está determinada por el tamaño y la 
forma de la molécula en relación con el tamaño y forma de los poros de la fase estacionaria. En este 
caso la fase móvil es no-interactiva. 
2) a- En permeación en gel: A es de menor tamaño que B. 
b- En fase reversa: A es menos polar que B. 
3) 
a- 
Tipo de resina Grupo iónico fijo Contraión 
catiónica fuerte sulfonato (–SO3
-) catión 
catiónica débil carboxilato (–COO-) catión 
aniónica fuerte amonio cuaternario 
–N(CH3)3
+
anión 
aniónica débil amonio terciario 
–NH(CH3)2
+ 
–NH3
+
anión 
b- Remitirse a la bibliografía sugerida y clases de teoría. 
C. Variables termodinámicas y cinéticas. Su incidencia en la CL 
1) Remitirse a la bibliografía sugerida y clases de teoría.
2) k’ carbaril = 2.4 k’ naftol = 2.8 α=1.16 
N carbari= 1156 N naftol= 1444 N prom= 1300
H prom = 0.11 mm Rs = 1
3) N prom= 3456 H prom = 0.007 cm R = 4.6
 4)
a- El fosfato de piridoxal es más polar que la cafeína y saldrá antes.
b- Aumentando el poder de elución de la fase móvil, aumentando la proporción de metanol y 
disminuyendo la de agua. 
c y d– Para reflexionar y discutir en clase (ver teoría). 
9 
D. Análisis Experimental. Cuantificación 
1) a- Las burbujas pueden obstruir el sistema aumentando la presión. Además, al llegar al detector
pueden dar alteraciones en la línea de base y a veces altos registros de absorbancia cuando se utiliza 
un detector UV-visible. 
b- Distintos componentes del suero como las proteínas pueden obturar los tubos del sistema 
aumentando la presión y también dañar la columna. 
c- En presencia de metanol precipitarán los iones del buffer, formando sales que quedarán 
depositadas en la tubería. El analista debe lavar primero con agua calidad HPLC y luego con 
metanol hasta estabilizar la presión habitual de la columna para el flujo de trabajo. 
2) a-La composición corresponde a una mezcla de hidrocarburos y sería un claro caso para GC que
dará una rápida, fácil y económica separación respecto de HPLC. 
b-La determinación puede hacerse por HPLC pero resulta más fácil determinar vitamina C por 
volumetría y por métodos electroquímicos. 
c-La cafeína debe ser separada de colorantes, aditivos y otroscomponentes presentes en las bebidas 
y HPLC es la técnica adecuada de elección. 
d-Los azúcares pueden ser determinados por GC o HPLC; pero la última es la técnica de elección ya 
que los azúcares no son volátiles y deben ser derivatizados con trimetilsilano si se elige CG 
haciendo más complicada la determinación 
3) En cromatografía en columna, en general, ocurren fluctuaciones relativas al instrumental utilizado
y al método; como consecuencia de esto, la respuesta del detector no es reproducible para la misma 
cantidad de un compuesto dado. Para subsanar el inconveniente se inyecta junto con el analito un 
patrón interno y se mide, empíricamente, el factor de respuesta (F); el procedimiento se basa en que 
ambas señales responderán proporcionalmente, independizándose de estas variaciones. 
Cálculo de F 
CC / CD = F AC / AD
= CC . AD / CD . AC = 4.37 cm2 x 1.03 mg.mL-1 / 10.86 cm2 x 1.16 mg.mL-1 = 0.357 
 Cálculo de C en la solución problema 
 Para conocer la concentración de D: 25.00 mL de solución --------- 12.49 mg de D 
 1.00mL --------- x = 0.499 mg 
C = F CD AC / AD = 0.357 x 0.499 mg.mL-1 x 5.97 cm2 / 6.38 cm2 = 0.167 mg.mL-1
1.00 m L -------- 0.167 mg 
25.00 mL ------- x = 4.17 mg 
10.00 mL -------- 4.17 mg 
1.00 mL ---------- x = 0.417 mg → C = 0.417 mg mL-1 
4) 10.0 mg de piroxicam por comprimido
10 
1.2 CROMATOGRAFÍA DE GASES 
A. Equipamiento 
1) Consultar la bibliografía sugerida y clases de teoría.
2) Ver bibliografía 
3) Las columnas tubulares abiertas se caracterizan por: mayor resolución, debido a que la longitud
de la columna es mayor; menor tiempo de análisis, debido a que al contener menos fase estacionaria 
retienen menos a los solutos; mayor sensibilidad, por las características que le son propias. Tienen 
menor capacidad de muestra, es decir, se puede aplicar menos muestra que a una columna empacada 
4) Reduce la tendencia de la fase estacionaria a sangrar cuando la columna es expuesta a elevadas
temperaturas. 
5) El detector de conductividad térmica “compara” la conductividad térmica del eluato con la del
gas portador. 
B. Variables termodinámicas y cinéticas 
1) a- tr' = tr - tm 
tr'(Benceno) = 10 min - 3 min = 7 min 
tr'(Hexano) = 11 min - 3 min = 8 min 
b- N = 16 (tr/w)2
N (Benceno)= 16 (10/1.1)2 = 1322 
N (Hexano) = 16 (11/1.4)2 = 988 
Nprom = (1322 + 988) / 2 = 1155 
c- R = 2 (tr(H) - tr(B)) / (W(B) + W(H)) 
R = 2 ( 11 min - 10 min ) / ( 1.1 min + 1.4 min) = 0.8 
Para una separación completa R debe ser mayor o igual a 1.5. En este caso la separación no es 
completa. 
d- 
 
e- Para mejorar la resolución entre dos bandas cromatográficas se debe aumentar la separación entre 
bandas (Δtr) y disminuir su ancho. La separación se puede lograr modificando las variables 
termodinámicas (K, k y α) modificando fase móvil, fase estacionaria y/o temperatura. Las bandas se 
afinan modificando las variables que permiten disminuir H y aumentar el N (ver ecuación de van 
Deemter modificada. Es decir, usar una columna de menor diámetro, una fase estacionaria con 
menor espesor- película de fase estacionaria más delgada, partículas de fase estacionaria muy 
t r ( A ) 
3 1 0 1 1
W A W B 
t i e m p o 
s e ñ a l 
 Z 
11 
pequeñas, etc.)
2) a- k' = (tr - tm) / tm
k'hexano = (4.60 min – 0.40 min)/0.40 min = 0.5 k'MEM = (5 min – 0.40 min) / 0.40 min = 1.5 
b- α = k'(y) / k'(x) = k'MEM/ k'hexano = 11.5/10.5 = 1.09 
c- Nhexano = 16 (4.60 min/ 0.355 min)
2 = 2687 NMEM = 16 (5.00 min/0.372 min)
2 = 2890 
 Nprom = 2788 
H = L/Nprom H = 150 cm/2788 = 0.054 cm 
3) a- N = 16 ( tr / w )2 H = L / N 
b- A: difusión en remolino, B: difusión longitudinal, C: resistencia a la transferencia de masa 
transversal del analito en la fase móvil y entre las fases móvil y estacionaria. 
c- Porque los coeficientes de difusión de los analitos son más grandes en fase gaseosa que en líquida. 
d- No. Porque no tiene empaque y por lo tanto no existe factor de empaque y entonces no se 
considera A que está relacionado con este parámetro. 
 C. Análisis experimental. Cuantificación 
1) En cromatografía de gases es necesario derivatizar algunos compuestos, principalmente los que
tienen grupos funcionales polares. Es decir, transformarlos en un producto similar pero con 
propiedades adecuadas con el fin de mejorar su volatilidad, su estabilidad térmica y en algunos casos 
la sensibilidad en la detección. 
2) Trabajar en condiciones isotérmicas significa trabajar a una única temperatura durante todo el
desarrollo cromatográfico, mientras que hacerlo en gradiente de temperatura implica un aumento de 
temperatura programado y generalmente en rampa durante la separación cromatográfica. Trabajar a 
una única temperatura implica un proceso más simple y se elige cuando los analitos salen a tiempos 
de retención razonables y con una buena resolución. Trabajar en gradiente es más complejo pero 
puede ser la solución a cromatogramas que presentan bandas no resueltas en condiciones isotérmicas, 
o una gran amplitud en los tiempos de retención. Recordar que los tiempos de retención deben ser
 Alicuota N H 
 1 998 0.090 
 2 1630 0.055 
 3 3209 0.028 
 4 3000 0.029 
 5 2807 0.032 
 6 2366 0.038 
 7 1555 0.058 
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0 15 30 45 60 75
 (cm/seg)
H
 (
c
m
)
µop
Hmin 
https://es.wikipedia.org/wiki/Producto_%28qu%C3%ADmica%29
12 
tales que aseguren razonables valores de las constantes termodinámicas factor de capacidad y 
factor de selectividad 
3) a-
 
y = 0,8316x + 0,028
R2 = 0,9986
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 0,5 1 1,5 2
[EtOH] / [PropOH]
a
re
a
E
tO
H
/a
re
a
P
ro
p
O
H
R = 0.91 mg/mL 
b- Si varían ligeramente las condiciones de una columna, el tr de un compuesto y la altura del pico 
pueden modificarse. Pero el ancho y la altura varían simultáneamente y el área correspondiente se 
mantiene constante. 
c- En cromatografía existen ciertos parámetros difíciles de reproducir de experimento en 
experimento, entre los que pueden mencionarse las variaciones del caudal del gas transportador y del 
volumen de muestra que se inyecta en el cromatógrafo. La reproducibilidad de la inyección es una de 
las limitaciones más importantes de la croamatografia. 
Por otra parte, una curva de calibración es válida para la determinación de muestras incógnita si se 
mantiene el conjunto de condiciones experimentales bajo las cuales se obtuvo. Por lo tanto, para 
eliminar el efecto producido en la señal debido a estas pequeñas variaciones involuntarias, se recurre 
al método de patrón interno. 
Se llama patrón interno al compuesto, diferente del analito, que se agrega en una cantidad 
exactamente conocida a la muestra incógnita y a cada estándar de la curva de calibración. Este 
compuesto debe reunir ciertas características: tener una estructura química similar a la del analito y 
que los tr entre ambos sean cercanos. De este modo, la relación de las áreas entre analito y patrón 
interno sirve como parámetro analítico. Esto se debe a que la respuesta relativa del detector, tanto 
para el analito como para el patrón interno, es prácticamente constante en un amplio intervalo de 
condiciones. 
13 
PREGUNTAS Y CUESTIONES ADICIONALES 
1) Dibujar el cromatograma para una sustancia X y marcar los siguientes parámetros:
–tiempo muerto 
–tiempo de retención del compuesto X 
–tiempo de retención corregido del compuesto X 
Definir cada uno de los parámetros anteriores e indicar qué representan 
2) Indicar qué parámetros termodinámicos se relacionan con la posición de las bandas en un
cromatograma, definir cada uno ellos y justificar cuáles son las variables que los modifican y que el 
analista puede cambiar para lograr mejores separaciones. 
3) Definir los parámetros cromatográficosnúmero (N) y altura (H) de platos teóricos. Indicar con qué
característica del pico cromatográfico se relacionan y justificar a través de qué variables pueden ser 
modificados dichos parámetros para lograr mejores separaciones. 
4) Dibujar, en un mismo gráfico, cada uno de los términos dispersivos de la ecuación de Van Deemter
modificada y la curva resultante. Indicar la condición óptima de trabajo. 
5) Explicar la relación entre la altura del plato (H) y la difusión en remolino (término A) de un
compuesto en una cromatografía en columna. Indicar cómo se genera dicha difusión, su relación con la 
velocidad lineal de la fase móvil y en qué tipos de columnas cromatograficas está ausente. Justificar. 
6) Explicar la relación entre la altura del plato (H) y la difusión longitudinal (término B) de un compuesto
en una cromatografía en columna. Indicar cómo se genera dicha difusión, su relación con la velocidad 
lineal de la fase móvil y en qué tipo de cromatografía es más importante. Justificar. 
7) Explicar en qué consiste efectuar una curva de calibración con patrón interno en método
cromatográfico y las ventajas de este procedimiento. 
8) Justificar:
– qué tipo de especies se separan con HPLC y no con CG 
– qué tipo de especies se separan con exclusión molecular 
– qué tipo de especies se separan con intercambio iónico
9) En cromatografía líquida: definir los conceptos de fase normal y fase reversa. Ejemplos.
10) Describir el fundamento de separación en una cromatografía líquida de reparto, indicando la
naturaleza de la fase estacionaria y las fuerzas de interacción involucradas entre el analito y las fases. 
Indique qué mide el parámetro índice de polaridad (P’). 
14 
11) En una cromatografía líquida de adsorción: definir la naturaleza de fase móvil y estacionaria
(ejemplos de cada una de ellas). Describir el fundamento de la separación y fuerzas que intervienen. 
Indicar qué mide el parámetro de fuerza del solvente ( o). Justifique si la fase móvil es o no 
interactiva. 
12) Describir las diferencias entre una cromatografía líquida convencional y una de fase ligada, y
mencionar al menos 3 ventajas de la fase ligada respecto a la cromatografía convencional. 
13) En una cromatografía líquida de intercambio iónico, defina la naturaleza de la fase móvil y de la
fase estacionaria (ejemplos de cada una de ellas). Describa el fundamento de la separación y fuerzas 
que intervienen. Justifique si la fase móvil es o no interactiva. 
14) Describir las características generales de las columnas cromatográficas usualmente empleadas en
HPLC y los distintos tipos de rellenos. 
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CROMATOGRAFIA PLANAR 
La cromatografía plana tiene dos modalidades: capa delgada y papel. En la primera, la 
separación se produce sobre un sólido finamente dividido que se ha fijado sobre una superficie plana. 
La sustancia que más se utiliza como adsorbente es el gel de sílice que puede funcionar a veces como 
soporte para el agua u otros disolventes polares en las separaciones líquido – líquido. Pero si se seca 
en una estufa, la capa de gel de sílice pierde la humedad, su superficie resulta predominantemente 
sólida y sirve como adsorbente en las separaciones líquido – sólido. 
En el caso de cromatografía en papel se utilizan papeles de alta pureza y características 
reproducibles de porosidad y grosor. Estos papeles contienen suficiente agua retenida, de manera que 
la cromatografía de papel se puede clasificar como una cromatografía de tipo líquido – líquido. Es 
posible hacer que otros líquidos reemplacen al agua, proporcionando un tipo diferente de fase 
estacionaria y originando una cromatografía en papel de fase reversa en donde la fase móvil sea un 
solvente polar. 
También existen en el comercio papeles que tienen un adsorbente o una resina de intercambio 
iónico que permite realizar cromatografía en papel de adsorción o de intercambio iónico, 
respectivamente. 
La siguiente figura es el esquema de una placa de cromatografía en capa delgada donde se 
indican las distancias recorridas por uno de los sustratos (a) y por el solvente (b) a partir de la línea 
de siembra. 
Frente del 
solvente 
b 
 a 
Origen o 
línea de 
siembra 
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CROMATOGRAFIA EN CAPA DELGADA 
La fase estacionaria está constituida por una capa de adsorbente finamente dividido extendido 
sobre una placa de vidrio o de plástico. El sustrato a analizar se siembra cerca del borde inferior de la 
placa, la cual se sumerge en una cámara que contiene el disolvente de desarrollo, que a la vez puede 
ser el revelador, y que constituye la fase móvil. 
El solvente asciende por capilaridad, arrastrando al sustrato. Antes de que el líquido llegue al 
borde superior se retira la placa y se marca la posición alcanzada por el frente de solvente. Se señala 
la posición de la mancha y se calcula el parámetro Rf . 
Rf = distancia recorrida por el sustrato/ distancia recorrida por el frente de solvente 
Mecanismo de separación propuesto 
En cromatografía de adsorción, la placa con la fase estacionaria adherida (sílica gel o 
alúmina) se coloca en estufa a 110 a 120ºC para eliminar el agua que pueda estar retenida en el 
sólido. Este paso se conoce como 'activación' y habilita la capa para una separación líquido - sólido. 
Cuando la placa se recubre con celulosa en polvo, la fase estacionaria está constituida por el 
agua retenida en las fibras de celulosa. La separación que tiene lugar es líquido - líquido, y el 
mecanismo corresponde a la cromatografía de partición. 
Consideraciones sobre la fase estacionaria 
Adsorbentes 
La adsorción es el proceso por el cual un sólido atrae y retiene moléculas en su superficie. 
El mecanismo involucrado es físico; no existen reacciones químicas. 
La actividad del adsorbente se determina por su área superficial, naturaleza química y el 
arreglo geométrico de los átomos de su superficie. Depende de la producción de sitios activos. En 
función de estos sitios, los adsorbentes se clasifican en débiles, medianos y fuertes. 
El material adsorbente debe ser insoluble en el solvente cromatográfico. Por ejemplo, si se 
quiere analizar una solución acuosa de K+ y Na+ por TLC, no debe usarse sacarosa como adsorbente, 
porque se disolvería en el disolvente. 
El adsorbente no debe reaccionar con el disolvente y menos aún con los solutos a separar. Si 
las fuerzas físicas de unión entre el soluto y el adsorbente son muy importantes, el soluto no se 
desplazará del punto de siembra, y por el contrario, si son muy débiles, correrá junto al frente de 
disolvente. 
Los adsorbentes más utilizados son : 
SILICAGEL: Su actividad se debe a los grupos silanol (Si-OH) 
OH 
O Si O 
O 
ALÚMINA: Su actividad depende de los átomos de O2 y de Al. 
 O O O O 
 Al O Al O 
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CELULOSA: Se usa sólo cuando los compuestos a separar se unen muy fuertemente a la alúmina o 
al silicagel (compuestos muy hidrofílicos). 
Fase móvil 
La función de la fase móvil es desplazar al soluto de la fase estacionaria, de manera de 
correrlo a través de la placa. Ayuda a separar una mezcla de solutos de modo que cada uno quede 
detenido en distintos puntos de la placa. 
La efectividad de un solvente de desplazar al soluto del adsorbente se denomina “poder de 
elución”. Está asociado con la función llamada parámetro de fuerza del disolvente o coeficiente 
eluotrópico que es la energía de adsorción por unidad de área de un adsorbente patrón. Así, un mayor 
coeficiente eluotrópico, , implica una interacción más fuerte del disolvente con la superficie del 
adsorbente y las moléculas de soluto son desplazadas hacia mayores Rf. 
La fuerza de los solventes da lugar a una serie eluotrópica. 
Cuando se cambia el adsorbente, el coeficiente eluotrópico del solvente cambia también. El 
coeficiente eluotrópico se define en términos de atracción solvente/ adsorbente. 
Existe un equilibrio entre solvente, soluto (muestra) y adsorbente, en donde el solvente 
compitecon el soluto por los sitios activos de la fase estacionaria. Pero no solamente debe tenerse en 
cuenta la relación entre el tipo de adsorbente usado y el disolvente o mezclas de disolventes que 
determinan el coeficiente eluotrópico, sino también la relación entre la naturaleza química del soluto 
o muestra y la del disolvente. Todo ello contribuye a la determinación del Rf y a la calidad de la
resolución en la separación de los componentes de la muestra. Puede ocurrir que dos disolventes 
diferentes tengan, para el adsorbente dado, el mismo coeficiente eluotrópico, pero los valores de Rf y 
la resolución serán mejores en un caso que en otro, considerando la naturaleza química de los 
constituyentes de la muestra y su relación con el disolvente. Se elige en este caso el disolvente que de 
mejores Rf y resoluciones. 
Muestra 
La interacción de la muestra y el absorbente se puede establecer de diferentes modos: mediante 
fuerzas de Van der Waals para moléculas neutras; unión dipolo para solutos que tiene un grupo polar 
C-Cl o C-NO2, siendo esta interacción más importante en la alúmina; puente hidrógeno entre el 
soluto y la sílice en la que los grupos silanos actúan como dador o aceptor de protones; o por una 
unión química más que física, de tipo covalente. Se denomina quimiosorción. Se presenta para 
algunos ácidos carboxílicos y cetonas. 
Cantidad de muestra 
Conviene siempre sembrar poca cantidad de muestra. Cuando se usa mucha cantidad de 
muestra surge un efecto denominado 'en cola'. 
Es preferible secar entre aplicación y aplicación para eliminar el exceso de solvente, de lo 
contrario aparecen anillos de muestra. 
Resolución 
Rs = X / 0.5 (d1 + d2) 
donde X es la distancia entre dos manchas, y d1 y d2 sus diámetros promedios . 
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Se considera una buena separación cuando Rs es igual a 1. La resolución se puede modificar 
aumentando X, respetando el pero cambiando la naturaleza del o de los solventes, o disminuyendo d 
colocando menos cantidad de muestra. 
Visualización 
Métodos no destructivos: 
- Radiación visible. 
- Radiación ultravioleta (en algunos casos puede ser destructiva, por ejemplo ciertas vitaminas sufren 
variación fotoquímica). 
- Vapor de iodo (en algunos casos puede ser destructivo porque reacciona químicamente con la 
muestra). 
- Agua (salvo para ciertos ésteres que son hidrolizados). 
Métodos destructivos: El revelador reacciona con la muestra para dar productos coloreados 
(aminoácidos con ninhidrina), H2SO4.