Para o estudo da citotoxicidade dos monômeros foi estabelecida uma linhagem celular primária de fibroblastos pulpares humanos (FPH) pela técnica de...

Para o estudo da citotoxicidade dos monômeros foi estabelecida uma linhagem celular primária de fibroblastos pulpares humanos (FPH) pela técnica de explants (FRESHNEY, 2000). A linhagem celular foi estabelecida no Laboratório de Cultivo Celular da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Pelotas (NCT-BIO/FO – Núcleo de Biologia Celular e Tecidual). Polpas dentárias foram obtidas de terceiros molares hígidos provenientes de doadores jovens e sadios. Os terceiros molares apresentavam rizogênese incompleta e ápice aberto e foram indicados para extração por motivos terapêuticos. Os pacientes assinaram termo de consentimento e doação de dentes, livre esclarecido (Anexo B), Imediatamente após as extrações dentárias, os dentes foram armazenados em Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco/Invitrogen–Lote: 563487) com 10% de soro fetal bovino (SFB, Gibco/Invitrogen-Lote: 210120) e 1% de antibiótico (estreptomicina/penicilina,Gibco/Invitrogen-Lote: 847143). Sob refrigeração foram transportados ao Laboratório de Cultivo Celular, no qual, em capela de fluxo laminar vertical (Quimis/ Série 041109), os dentes foram limpos em PBS (Tampão Fosfato Salino, Gibco/Invitrogen-Lote:558182) e todo o tecido gengival removido com lâminas de bisturi estéreis. As polpas dentais foram removidas dos ápices radiculares com o auxílio de curetas (SS White Duflex) e limas endodônticas (tipo Hedstroem - 2ª série - Maillefer – Dentsply), também estéreis. As polpas foram lavadas duas vezes em PBS e cortadas sobre placa de Petri estéril com o auxílio de duas lâminas de bisturi até que a obtenção de pequenos fragmentos com aproximadamente 1mm2. Após os fragmentos pulpares foram colocados cuidadosamente sobre a superfície cultivável de uma garrafa de cultura de 25cm2 (Techno Plastic Products) e feita a adesão dos tecidos na superfície da garrafa, e após, foi adicionado 1ml de meio de cultivo (DMEM + 10% de SFB + 1% de antibiótico) para promoção da adesão dos explants. Os fragmentos foram mantidos em garrafas de cultivo celular com Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco/Invitrogen–Lote: 563487) com 10% de soro fetal bovino (SFB, Gibco/Invitrogen-Lote:210120) e 1% de antibiótico (estreptomicina/penicilina, Gibco/Invitrogen-Lote: 847143) em estufa com atmosfera de 5% de CO2 à 37°C (Thermo Electron Corporation). Nas primeiras 72 horas os explants permaneceram em repouso sem nenhum movimento nos frascos. Após este período, as garrafas foram monitoradas diariamente em microscópio de luz invertida (modelo AAKER) para a observação da migração das células a partir do tecido pulpar. A cada 48/72 horas, 1ml de DMEM completo era adicionado cuidadosamente e os fragmentos não aderidos, removidos. Após o início da migração das células (Fig. 5, a-c), os explants foram descartados e as células mantidas até a confluência na garrafa de cultivo, sempre em atmosfera de 5% CO2 à 37°C. O crescimento celular isolado foi monitorado diariamente em microscópio de luz invertida (modelo AAKER) e o meio de cultura trocado a cada 2 ou 3 dias, de acordo com o metabolismo celular, até a obtenção da subconfluência (Fig. 5 d-f).