BRUNO-VINICIUS-DAQUILA

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XI EPCC 
Anais Eletrônico 
29 e 30 de outubro de 2019 
ANÁLISE ULTRAESTRUTURAL DO INTESTINO MÉDIO EM LARVAS DA 
Diatraea saccharalis Fabricius, 1794 (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE) 
TRATADAS COM Bacillus thuringiensis (BACILLALES: BACILLACEAE) 
 
Bruno Vinicius Daquila¹, Richard Henrique Siebra Bergamo², Fabio de Deus 
Oliveira Junior ³, Matheus Veríssimo Varoni ⁴, Satiko Nanya⁵, Helio Conte⁶ 
 
¹Acadêmico do Curso de Doutorado e Mestre em Biotecnologia Ambiental, Universidade Estadual de Maringá - UEM, Maringá, Paraná. 
Bolsista CAPES. bv.ds@hotmail.com 
² Acadêmico do Curso de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Maringá, Maringá, Paraná. Bolsista PIBIC/CAPES – UEM. 
richardbgm17@gmail.com 
³ Acadêmico do Curso de Biotecnologia Ambiental, Universidade Estadual de Maringá, Maringá, Paraná. Bolsista PIBIC/Fundação 
Araucária – UEM. fabioinaja@gmail.com 
⁴ Acadêmico do Curso de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Maringá, Maringá, Paraná. PIC/UEM. 
matverissimo123@gmail.com 
⁵ Docente, Mestra e Doutora em Genética, Departamento de Biotecnologia, Genética e Biologia Celular - DBC, Universidade Estadual 
de Maringá – UEM. snanya@uem.br 
⁶Docente, Mestre em Zoologia, Doutor em Biologia Celular e Molecular, Departamento de Biotecnologia, Genética e Biologia Celular - 
DBC, Universidade Estadual de Maringá – UEM. hconte@uem.br 
RESUMO 
 
Controle biológico é uma técnica utilizada no combate de organismos pragas na agricultura. Diatraea 
saccharalis é um inseto holometábolo, responsável por prejuízos diretos e indiretos ao setor sucroalcooleiro, 
devido seu hábito alimentar mastigador durante a fase larval. Bioinseticidas formulados com Bacillus 
thuringiensis são utilizados como controladores biológicos de insetos pragas e a principal via de contato para 
avaliação dos efeitos de bioinseticidas ingeridos é o intestino médio, local onde ocorre síntese enzimática, 
digestão e absorção de nutrientes. Nos insetos este órgão é constituído por um epitélio simples, contendo 
células colunares, caliciformes, regenerativas e endócrinas, alterações nestas células interferem na 
capacidade secretora, digestiva e absortiva. Considerando a importância do intestino e por este ser alvo dos 
bioinseticidas, o objetivo deste trabalho foi observar e descrever possíveis danos causados por B. 
thuringiensis no intestino médio em larvas da D. saccharalis alimentadas com dieta artificial contaminada, 
utilizando-se da microscopia eletrônica de varredura e transmissão. Bioensaios foram realizados com larvas 
em primeiro instar, submetendo-as à ação de B. thuringiensis var. Aizawai GC-91. 200µl de solução 0,250% 
foram aplicados sobre a dieta artificial fornecida as larvas. Amostras para análises histológicas foram 
coletadas com 24 e 48h. As alterações observadas no intestino médio em larvas da D. saccharalis foram: 
Esferitos, vacúolos, degeneração do nucléolo e surgimento de estruturas eletrondensas na região nuclear, 
reticulo endoplasmático concêntrico, descolamento e ruptura da lamina basal, vacuolizações e lise celular. 
Desta forma, podemos concluir que os danos observados foram suficientes para ocasionar a morte das larvas 
da D. saccharalis tratadas. 
 
PALAVRAS-CHAVE: Bt; Controle-biológico; Entomopatógeno; Insetos-pragas; Sustentabilidade. 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
Bioinseticidas formulados com B. thuringiensis estão ganhando espaço na 
agricultura e saúde pública, devido sua alta especificidade e baixo dano ambiental, 
favorecendo seu uso como biocontrolador de insetos pragas, como a Diatraea saccharalis, 
que durante sua fase larval é causadora de prejuízos ao setor sucroalcooleiro (BOUKEDI 
et al., 2016; CACCIA et al., 2016; FERREIRA et al., 2018). 
Considerada uma das principais vias de contato para avaliar efeitos de bioinseticidas 
ingeridos em insetos, o intestino médio é formado por um epitélio simples, constituído por 
células colunares, caliciformes, regenerativas e endócrinas (BILLINGSLEY; LEHANE, 
1996; CATAE et al., 2014). Células colunares são responsáveis pela secreção de enzimas 
digestivas e da membrana peritrófica, as células caliciformes atuam no processo de 
homeostase iônica, enquanto a renovação epitelial e o controle hormonal são realizados 
por células regenerativas e endócrinas (SNODGRASS, 1993; CHAPMAN, 1998). 
A ação de entomopatógenos podem ocasionar lise nas membranas celulares, 
seguida por rupturas na parede intestinal, com isso, o conteúdo gástrico é misturado à 
 
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hemolinfa, reduzindo o pH intestinal e fornecendo nutrientes necessários para proliferação 
e disseminação bacteriana pelo organismo, causando a morte do inseto alvo por inanição 
e septicemia (HORTA et al., 2017). 
Por ser alvo de ações dos biopesticidas e pelas funções que exerce, o objetivo deste 
estudo foi analisar prováveis alterações morfológicas no epitélio do intestino médio em 
larvas de primeiro instar da D. saccharalis, alimentadas com dieta artificial contaminada 
com B. thuringiensis var. Aizawai GC-91, utilizando-se da microscopia eletrônica de 
varredura e transmissão. Com os resultados obtidos, são fornecidos dados para o melhor 
entendimento da ação deste entomopatógeno em insetos susceptíveis. 
 
2. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
2.1. INSETOS E BIOENSAIOS COM B. thuringiensis var. Aizawai GC-91 
 
Larvas neonatas da D. saccharalis fornecidas pelo Laboratório de Controle Biológico, 
Morfologia e Citogenética de Insetos da Universidade Estadual de Maringá (23° 25' 30" S e 
51° 56' 20" W), Paraná, Brasil, foram mantidas em placas de Petri de vidro 90 x 15 cm, 
alimentadas com dieta artificial sem anticontaminantes (HANSLEY; HAMMOND, 1968). 
Nos bioensaios utilizamos o produto AGREE®, fabricado pela CERTIS USA, LLC. 
Wasco, Califórnia, EUA, número de registro do produto - EPA 70051-47. Manipulado pela 
Bio Controle - Métodos de Controle de Pragas Ltda. Indaiatuba, São Paulo, Brasil, 
registrado no Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento - MAPA sob nº 06095, 
formulado com Bacillus thuringiensis var. Aizawai GC-91 - 109 de esporos viáveis/g 
(equivalente a 38,0 g/kg de endotoxina - 25.000 µl/mg de potência). 
A concentração utilizada foi a que demonstrou melhores resultados em bioensaios 
prévios, realizados pelos autores. Uma solução à 0,250% (2,5 g/L) foi obtida diluindo o 
produto comercial em água destilada autoclavada pH 7.0 com temperatura de 25ºC, no 
momento dos tratamentos. Placas de Petri de polietileno 60 X 15 cm contendo 7,5 mL de 
dieta artificial, receberam 200µl da respectiva solução em sua superfície. Para o grupo 
controle utilizamos apenas água destilada autoclavada pH 7.0. As placas permaneceram 
em sala climatizada com temperatura de 25 ± 2ºC, fotoperíodo de 12h, umidade relativa de 
70 ± 10% (ARAÚJO, 1987). 
 
2.2. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV) 
 
Larvas controle e tratadas coletadas 24 e 48h após o início dos bioensaios (n=4 por 
idade/grupo) foram fixadas em Bouin alcoólico por 24h na temperatura ambiente, 
desidratadas em serie crescente de álcoois (70, 80, 90 e 100%), submetidas ao ponto crítico 
Leica CPD 030-BALTEC. As amostras foram fraturadas com lamina de inox, metalizadas 
em pó de ouro no equipamento Shimadzu IC-50 metalizer e posteriormente analisadas 
utilizando SEM QUANTA 250-FEI no Complexo de Centrais de Apoio à Pesquisa 
(COMCAP) da Universidade Estadual de Maringá, Paraná, Brasil. 
 
2.3. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO (MET) 
 
Larvas controle e tratadas coletadas com 24 e 48h após o início dos bioensaios (n=4 
por idade/grupo) foram fixadas em solução de glutaraldeído 2,5% e paraformaldeído 4% 
em tampão fosfato 0,1 M, pH 7.3 por 24h a temperatura ambiente. Posteriormente pós-
fixadas em tetróxido de ósmio 1 % em tampão fosfato por 2h. Após esta etapa, foram 
lavadas em água destilada, contrastadas em solução aquosa de acetato de uranila 0,5% 
por 2h, e posteriormente desidratadas em series crescentes de acetona (50, 70, 90 e 100%) 
e embebidasem resina Araldite®. As análises dos cortes foram realizadas utilizando Tecnai 
 
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Spirit transmission electron microscope (FEI Company, Eindhoven, Netherlands) na Central 
de Microscopia Eletrônica do Instituto de Biociências de Botucatu, São Paulo, Brasil. 
 
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
Em larvas controle fraturadas transversalmente, observamos em microscopia 
eletrônica de varredura o intestino médio com formato circular constituído por células 
colunares (Figura1-A). No intestino das larvas tratadas com solução 0,250% em 24h, não 
foram observadas alterações, mas 48h após o tratamento, identificamos vacuolizações e 
bactérias dispersas no citoplasma e superficialmente nas células colunares (Figura 1-B, C). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1: Microscopia Eletrônica de Varredura do intestino médio em larvas de primeiro instar da 
D. saccharalis. (A) Larvas controle em fratura transversal: Lúmen (lu); Células colunares (cc); (B e 
C) Larvas tratadas 24h-0,250%: Vesículas (vs); Células colunares (cc); Bactérias (bt). Em A e C, 
barra = 5µm. Em B, barra = 100µm. 
 
Com a microscopia eletrônica de transmissão, identificamos nas larvas controle, 
células colunares e caliciformes; membrana peritrófica, dividindo o lúmen em duas regiões: 
ectoperitrófica e endoperitrófica. Características eletrondensas foram localizadas no ápice 
das células colunares e microvilosidades prolongando-se para o lúmen. Reservas de 
glicogênio e vesículas lipídicas são visíveis no citoplasma das células colunares e no núcleo 
observa-se nucléolo e cromatina granular dispersa (Figura 2-A). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2: Microscopia Eletrônica de Transmissão do intestino médio em larvas de primeiro instar 
da D. saccharalis. (A) larvas controle em corte transversal: Lúmen (lu); espaço ectoperitrófico (ec); 
espaço endoperitrófico (ed); microvilosidades (mv); célula colunar (cc); núcleo (n); vesiculas 
lipídicas (lv); células caliciformes (gc); membrana peritrófica (pm); (C). Tratadas com 24h-0,250%: 
microvilosidades (mv); vacúolos (v); esferitos (s); gotas lipídicas (lv); retículo endoplasmático 
rugoso (er); mitocôndrias (m). (C). Tratadas com 48h-0,250%: microvilosidades (mv); vesículas 
lipídicas (lv); núcleo (n); ruptura na lamina basal (r); células degeneradas (dc); espaços 
extracelulares (*). Em A-C, barra = 5µm. 
 
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A redução do lúmen intestinal e desintegração da membrana peritrófica ocorrem 24h 
após o tratamento. Depósitos de glicogênio são dispersos e há acumulo de vesículas 
lipídicas. As regiões apicais mantem as características eletrondensas descritas 
anteriormente, concentrando mitocôndrias com morfologias diferenciadas. Esferitos, 
vacúolos com características digestivas e reticulo endoplasmático rugoso concêntrico estão 
presentes em diversas células colunares. Nas regiões nucleares observa-se a 
desintegração dos nucléolos em pequenos aglomerados com características 
eletrondensas, migrando para a região periférica (Figura 2-B). 
Desorganização celular, espaçamentos extracelulares e rupturas na lamina basal 
evidenciam danos severos 48h após o tratamento. Microvilosidades degeneradas são 
observadas no ápice, assim como coalescências das vesículas lipídicas no citoplasma, 
resultando em um aspecto vacuolizado do citoplasma celular. Com o acúmulo de vesículas 
no citoplasma, as células sofrem lise e se degeneram (Figura 2-C). 
Os danos observados nas células colunares da D. saccharalis, possivelmente 
resultam da ação tóxica de B. thuringiensis. Peyronnet et al. (1997) relataram que as 
toxinas sintetizadas por este entomopatógeno possuem ligações especificas com 
receptores presentes na membrana apical em células do intestino médio, dados estes 
confirmados por Rausell et al. (2000). 
A degeneração da borda estriada e vacuolizações observadas no epitélio intestinal 
da D. saccharalis em microscopia eletrônica, podem ter relação com a inserção destas 
toxinas na região apical das células. Bravo et al. (1992); Mohamed et al. (2015), estimaram 
os danos de diferentes toxinas de B. thuringiensis nas células do intestino médio de 
Manduca sexta, P. xylostella e Sesamia cretica, relatando alterações histopatológicas que 
incluem: ruptura da borda em escova (microvilosidades), vacuolizações citoplasmáticas, 
hipertrofia e desintegração celular. 
A presença de esferitos e reticulo endoplasmático rugoso concêntrico, podem ter 
ação citoprotetora. Grânulos presentes no citoplasma (esferitos) indicam ativação de 
fatores ligados a desintoxicação celular, além disso, a estocagem de cálcio, provavelmente 
interfere prevenindo autofagia celular, vacuolizações e danos ao reticulo endoplasmático 
rugoso, que assume a conformação concêntrica em resposta a estas alterações (CRUZ-
LANDIM; SILVA-DE-MORAES; SERRÃO, 1971; NOGAROL; FONTANETTI, 2010; SOUZA; 
FONTANETTI, 2011; SCUDELER et al., 2016). 
Fatores associados a morte celular podem ter ligação com a infecção bacteriana ou 
agressão sofrida pelas células epiteliais da D. saccharalis tratadas com B. thuringiensis. As 
células epiteliais do intestino médio em insetos podem ser induzidas a autofagia em 
resposta a diversos estímulos, entre eles a infecção bacteriana e a agressão sofrida pela 
ação de toxinas (MANJO; JORIS, 1995; SCUDELER et al., 2016). 
Resultados semelhantes aos observados em larvas da D. saccharalis tratadas com 
B. thuringiensis são descritos em outros lepidópteras por Aranda et al. (1996); Nogueira; 
Habb (2001); Knaak; Fiuza, (2005); Fiuza et al. (2013). Embora as células colunares 
tenham mostrado resposta citoprotetora, esta não se caracterizou efetivamente 
provavelmente devido as lesões ultraestruturais detectadas. 
 
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS 
 
Nossos resultados demonstram a ocorrência de alterações nas células epiteliais do 
intestino médio em larvas de primeiro instar da D. saccharalis, ocasionadas pela ação tóxica 
de B. thuringiensis var. Aizawai GC-91. Consideramos que o uso deste entomopatógeno, 
se configura em excelente alternativa sustentável para controle desta praga inclusive 
podendo ser associado ao Manejo Integrado de Pragas (MIP). 
 
 
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