GIARDÍASE E NOVOS MÉTODOS LABORATORIAIS: UMA REVISÃO DE LITERATURAA docx

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São Paulo
2021
ELISABETH CAVALCANTI DOS REIS LEITE
GIARDÍASE E NOVOS MÉTODOS LABORATORIAIS:
UMA REVISÃO DE LITERATURA
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado
à Universidade Anhanguera de São Paulo -
UNIAN, como requisito parcial para a obtenção
do título de graduado em Biomedicina.
BANCA EXAMINADORA
Profª Espª Brenda Mery Santos de Godoy
Profº. Drº João Leonardo Rodrigues Mendoça
Profª. Drª Thaiana Cristina de Camargo
São Paulo, XX de Junho de 2021.
Agradeço aos meus pais pelo apoio incondicional em todos os
momentos difíceis da minha trajetória acadêmica. Este trabalho
é dedicado a eles.
AGRADECIMENTOS
À Deus por me conceder sua centelha divina, a vida da qual desfruto todos os
dias. Aos meus pais que sempre me apoiaram concedendo-me educação para a
vida.
Aos meus pais que foram fundamentais para essa conquista, e que estiveram
diretamente envolvidos no crescimento pessoal e profissional desde o começo deste
curso.
Agradeço a Profª. Paola Cavalin pela orientação do trabalho, por auxiliar e dar
suporte técnico e estar presente no desenvolvimento com a sua total dedicação e
nos mantendo firmes aos objetivos propostos.
Somos gratos aos professores que compuseram a banca avaliadora, Profª
Brenda Mery Santos de Godoy, Profº Drº João Leonardo Rodrigues Mendoça, Profª
Drª Thaiana Cristina de Camargo, estes que dispuseram de seu tempo para
participarem do desfecho deste trabalho.
Agradeço também a todos os professores que fizeram parte da minha
formação acadêmica, em especial o corpo docente do curso de Biomedicina da
Universidade Anhanguera de São Paulo – UNIAN – Unidade Marte.
Em conjunto a isso saúdo todos os profissionais da Universidade Anhanguera
de São Paulo – UNIAN – Unidade Marte, que com sua estrutura me permitiu
consolidar mais uma etapa em minha vida.
Gostaria de lembrar aos meus amigos e colegas que foram indescritíveis a
convivência e o crescimento mútuo que tivemos durante o período. Muitos trabalhos,
aprendizados e desenvolvimento de atividades que me proporcionaram um grande
crescimento pessoal e profissional.
Aos meus familiares, que foram de extrema importância, dando a força e
sustentação para seguir firme na caminhada até o final. Suportaram a carga imposta
por esses longos anos de estudo e que agora vibram com a minha vitória.
O meu muito obrigada a todos.
“Não se pode ensinar tudo a alguém, pode-se
apenas ajudá-lo a encontrar por si mesmo o
caminho.”
(Galileu Galilei).
LEITE, Elisabeth Cavalcanti dos Reis. Giardíase e novos métodos laboratoriais:
uma revisão de literatura. 2021. 29 folhas. Trabalho de Conclusão de Curso
(Graduação em Biomedicina) – Anhanguera de São Paulo, São Paulo, 2021.
RESUMO
Este trabalho tem por objetivo realizar uma revisão bibliográfica sobre a Giardia
lamblia, um protozoário que acomete uma boa parte da população e que merece um
esclarecimento maior devido às consequências que ele pode ocasionar com o
agravamento do quadro médico, principalmente, em crianças. Assim abordar os
principais métodos de prevenção da afecção, elucidar sobre a giardíase e sua
patogênese, explanando sobre dados epidemiológicos da doença, e por fim, elucidar
novos métodos laboratoriais de detecção da Giardia lamblia. Os exames
coprológicos, geralmente, usados para a detecção da giardíase são: o método Faust
que é um processo de centrífugo-flutuação, método Ritchie
centrífugo-sedimentação, e o método Hoffman, Pons e Janer (HPJ). Porém, estes
métodos amplamente difundidos no mundo todo, tem uma porcentagem de erro, por
se tratar de um processo que pode ter confusão com outros patógenos, além de
depender da experiência dos técnicos. Isso, pode ser evitado com a adoção de
novas metodologias de análises como, o ensaio imunoezimático (ELISA) e a reação
em cadeia de polimerase (PCR). A aplicação da técnica de ELISA de kits
comerciais, como descrito de pela empresa Thermo Fisher Scientific, denominado
microplaca ProSpecT™ Giardia EZ, que utiliza o processo de análise do ensaio de
microplaca para a detecção do antígeno GSA 65 específico para Giardia lamblia,
eleva 3 vezes mais chances de detectar amostras positivas. Porém, uma limitação
para o cenário brasileiro, é a elevação do custo do exame se comparado a técnica
HPJ.
Palavras-chave: Giardíase. Diagnóstico Giardia lamblia. ELISA. PCR.
LEITE, Elisabeth Cavalcanti dos Reis. Giardiasis and new laboratory methods: a
literature review. 2021. 29 pages. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em
Biomedicina) – Anhanguera de São Paulo, São Paulo, 2021.
ABSTRACT
This work aims to carry out a literature review on Giardia lamblia, a protozoan that
affects a large part of the population and deserves further clarification due to the
consequences it can cause with the worsening of the medical condition, especially in
children. Thus, approach the main methods of prevention of the disease, elucidate
about giardiasis and its pathogenesis, explaining the epidemiological data of the
disease, and finally, elucidate new laboratory methods for detecting Giardia lamblia.
The coprological tests generally used to detect giardiasis are: the Faust method,
which is a centrifugal-flotation process, the Ritchie centrifugal-sedimentation method,
and the Hoffman, Pons and Janer (HPJ) method. However, these methods, widely
spread around the world, have a percentage of error, as it is a process that can be
confused with other pathogens, in addition to depending on the experience of the
technicians. This can be avoided with the adoption of new analysis methodologies
such as the immunoezymatic assay (ELISA) and the polymerase chain reaction
(PCR). The application of the ELISA technique of commercial kits, as described by
Thermo Fisher Scientific, called ProSpecT™ Giardia EZ microplate, which uses the
microplate assay analysis process for the detection of the specific GSA 65 antigen
for Giardia lamblia, raises 3 times more likely to detect positive samples. However, a
limitation for the Brazilian scenario is the increase in the cost of the exam compared
to the HPJ technique.
Key-words: Giardiasis. Diagnosis Giardia lamblia. ELISA. PCR.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Cistos de Giardia lamblia sob microscopia 15
Figura 2 – Trofozoíto de Giardia lamblia sob microscopia 15
Figura 3 – Ciclo de vida da Giardia lamblia..............................................................16
Figura 4 – Distribuição global da giardíase.............................................................. 18
Figura 5 – Etapas da técnica Ritchie........................................................................21
Figura 6 – Método Hoffman, Pons e Janer (HPJ).....................................................22
Figura 7 – Processo de análise do Kit ProSpecT™ Giardia EZ de parasitologia.....24
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
μm Micrometro
CDC Center for Disease Control and Prevention
DNA Ácido desoxirribonucleico
ELISA Ensaio de Imunoabsorção Enzimática
HPJ Método Hoffman, Pons e Janer
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IBICT Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia
OMS Organização Mundial da Saúde
NBR Norma Brasileira
PCR Reação em cadeia da Polimerase
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 12
2. TRANSMISSÃO E CICLO BIOLÓGICO.............................................................14
3. EPIDEMIOLOGIA DA GIARDÍASE....................................................................18
4. NOVOS MÉTODOS DE DETECÇÃO 21
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS 26
REFERÊNCIAS 27
13
14
1. INTRODUÇÃO
Segundo dados da Organização Mundial da Saúde (OMS), a infecção por
parasitose advindas de protozoários e helmintos atinge cerca de 3,5 bilhões de
pessoas. Inclusive no Brasil, a giárdia é uma doença negligenciada pelas
autoridades públicas, havendo uma subnotificação de casos e falta de coordenação
para a prevenção e tratamento. A giardíase é uma infecção causada pela Giardia
lamblia, um protozoário flagelado que habita o intestino e o parasita, muito
decorrente de problemasrelacionados as condições socioeconômicas do local,
como o saneamento básico, tipo de alimentação, e mais recorrente em crianças. O
diagnóstico é realizado através do exame parasitológico de fezes (LACERDA; DIAS,
2017).
Como cada organismo combate as enfermidades de maneiras diferentes, no
caso da giárdia, o exame parasitológico que irá identificar os cistos presentes nas
fezes, podem resultar em exames “falso negativo”. Pois, há evidências de que a
excreção do cisto não é contínua e pode demorar de 10 a 20 dias para ser liberada
na evacuação. Por isso, para driblar estas questões e ter maior precisão na
detecção, surgiram novos métodos para avaliação do patógeno, como a
imunofluorescência indireta, ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), e
detecção pelo reconhecimento de DNA como o PCR (polymerase chain reaction),
entre outros (MACHADO, 2011).
Por esse motivo, os métodos utilizados para a prevenção e detecção da
giardíase necessitam ser efetivos, sendo a questão norteadora deste trabalho: de
que forma os novos métodos de detecção laboratoriais podem contribuir para um
quadro clinico mais eficiente?
Este trabalho tem por objetivo geral realizar uma revisão bibliográfica sobre a
Giardia lamblia, um protozoário que acomete uma boa parte da população e que
merece um esclarecimento maior devido às consequências que ele pode ocasionar
com o agravamento do quadro médico. Podendo impactar no desenvolvimento
intelectual e cognitivo de crianças. Assim abordar os principais métodos atuais de
prevenção, diagnóstico da afecção. Os objetivos específicos incluem: elucidar sobre
15
a giardíase e sua patogênese, explanando sobre dados epidemiológicos da doença,
e por fim, elucidar novos métodos laboratoriais de detecção da Giardia lamblia.
Para sistematizar os principais aspectos relacionados ao prevenção e
diagnóstico da giardíase, foi realizado um levantamento de publicações nacionais e
internacionais selecionadas a partir da principal questão de interesse do estudo.
Essa abordagem metodológica, de natureza narrativa, não pretendeu esgotar o
universo de estudos que enfocam a questão da prevenção da Giardia lamblia, mas
sim explorar os principais aspectos relacionados ao tema, de modo a oferecer
elementos que possam subsidiar a formulação de ações de saúde nos âmbitos de
prevenção, diagnóstico e novos métodos aplicados a detecção da doença.
A revisão bibliográfica sobre o tema foi abordada segundo os seguintes
tópicos: diagnóstico, prevenção, Giardia lamblia, giardíase, ELISA. Para auxiliar na
compreensão do tema as bases de dados utilizadas para a pesquisa foram: livros de
áreas correlatas disponíveis na Biblioteca da Universidade Anhanguera de São
Paulo (UNIAN), LILACS (Literatura Latino Americana e do Caribe em Ciências
Sociais e da Saúde), Scielo (Scientific Eletronic Library Online) e PubMed, do
período que compreendem os anos de 2009 a 2018.
Em seguida, após extrair os dados de estudos individuais, ocorreu a síntese,
processo de colocação dos estudos individuais em conjunto em um arranjo novo ou
diferente e o desenvolvimento de um conhecimento que não está aparente na leitura
isolada dos estudos individuais.
16
2. TRANSMISSÃO E CICLO BIOLÓGICO
A giárdia foi relatada pela primeira vez em 1681, por Antony van
Leeuwenhoek que analisou suas próprias fezes e encontrou seres vivos, e os
denominou como "animalículos móveis". Em seguida, em 1859, Duŝan Lambl fez
uma análise mais detalhada de um parasito que designou C. intestinalis. Mas foi em
1915, que foi usada como nomenclatura oficial a Giardia lamblia, uma homenagem a
Dusan Lambl (SILVA, 2017).
Já em 1952, foi definida três tipos de estrutura da giárdia: Giardia duodenalis,
Giardia muris e Giardia agilis. Hoje a Giardia lamblia é comumente usada, mas
também pode ser empregado a nomenclatura de Giardia duodenalis e Giardia
intestinalis (ALMEIDA, 2019).
A Giardia lamblia é um protozoário flagelado, do filo Sarcomastigophora,
classe Zoomastigophorea, ordem Diplomonadida, família Hexamitidae, gênero
Giardia e possui várias espécies com compõem a Giardia sp. Segundo o autor
Almeida (2019), indica que existem oito tipos de espécies de Giardia e os seus
hospedeiros: Giardia agilis presente em anfíbios, Giardia muris e Giardia microti em
roedores; Giardia ardeae e Giardia psittaci em aves; Giardia peramelis em
Bandicoots australianos; Giardia cricetidarum em hamsters. Já a Giardia lamblia (ou
Giardia duodenalis ou Giardia intestinalis) está presente no ser humano e
mamíferos, ou seja, uma doença antropozoonótica.
O ciclo biológico da Giardia lamblia existe em duas formas, como trofozoítos e
cistos. Os trofozoítos fazem parte do ciclo de vida do protozoário, e tem a forma
semelhante a uma pera, com dois núcleos, com comprimento de 2,1 a 9,5
micrometros (μm) e de 5 a 15 micrometros (μm) de largura, como na figura 2.
Possuem uma reprodução assexuada, colonizam o intestino delgado e depois se
transformam em cistos. Os cistos têm a forma circular, possuem de dois a quatro
núcleos, concentrados em dos polos, medem 8 a 12 μm de comprimento por 7 a 9
μm de largura, como na figura 1 abaixo. Então, os cistos são ingeridos e no trato
gastrointestinal o cisto percorrerá o corpo até o intestino delgado, mas logo após o
estomago ocorre uma brusca variação de pH, assim ocasiona o desencistamento e
o cisto libera dois trofozoítos, que se reproduzem, e este processo que acarretam os
17
sintomas mais agudos aos pacientes. O processo inflamatório da giardíase, obtém
uma reação em que alterar a vilosidade e com biopsia é possível identificar o
rompimento da microvilosidade intestinal e a presença de trofozoítos na parede
epitelial. Depois os trofozoítos quando eles chegam ao cólon começa então a
transformação em cistos e consecutivamente inicia-se o ciclo novamente
(LACERDA; DIAS, 2017).
Figura 1 – Cistos de Giardia lamblia sob microscopia
Fonte: Centro de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA (2017)
Figura 2 – Trofozoíto de Giardia lamblia sob microscopia
Fonte: Centro de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA (2017)
A forma de transmissão da giardíase é feita pela água ou alimentos
contaminados; contato direto ou por via fecal-oral de indivíduos contaminados pelos
cistos, como na figura 3. Os cistos são a forma infectante da doença, além de se
caracterizar por uma alta resistência a variação de temperatura, sendo destruído
somente a temperaturas acima de 64ºC, resistente a alteração de umidade e a
cloração da água, podem permanecer durante dois meses inativo no meio ambiente,
até a transmissão para um novo hospedeiro. Já os trofozoítos não conseguem
18
sobreviver em ambiente externo por mais de quinze minutos (SANTANA et al.,
2014).
A forma de transmissão mais comum seria através dos recursos hídricos, por
isso, o saneamento básico é intrínseco a prevenção e combate a esta
enteropatogenia. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), a giardíase é
uma das doenças negligenciadas pelos países, e está interligada as condições
estruturais de cada nação, pois o acometimento desta doença em países
desenvolvidos se apresenta em menor escala, se comparado aos países em
desenvolvimento (MARIANO, 2014).
Figura 3 – Ciclo de vida da Giardia lamblia
Fonte: Mariano (2014, p.29)
Segundo dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), a
realidade no Brasil de esgotamento sanitário, datado em 2017, era de 60,3% nos
19
5.570 municípios brasileiros, com 153 municípios em implantação e os outros 2.211
não havia a oferta do serviço. Comparando a região sudeste, a rede de esgoto
atende os cidadãos com 96,5%, sendo no norte do país esse percentual cai para
16,2%. Esta discrepância de infraestrutura básica brasileira causa uma grande
variação na incidência da doença, atingindo de 12,4% a 50% na predominância da
giárdia, tendo correlação direta com a região geográfica, faixa etária e condições de
imunidade (SANTANA et al., 2014).
A procura por atendimento médicocom pessoas acometidas com giardíase
demonstram sintomas de diarreia líquida e volumosa, dor abdominal, náusea,
vômitos, flatulência e febre baixa (MACHADO, 2011). Neste sentido, para melhor
identificação do quadro clínico depende de análise laboratorial para sua
confirmação, mas após a contaminação com o protozoário, demora de uma a duas
semanas para que o organismo excrete os cistos nas fezes, e este processo não é
constante, sendo um fator de dificuldade para a detecção da doença através da
microscopia, pois pode apresentar um “falso negativo” (INOUE et al., 2018). Por
isso, os autores Motta e Silva (2002), indicam a coleta das secreções deve ser
realizada em três momentos em dias diferentes para a melhor identificação da
patogenia.
Como a doença está presente principalmente em crianças, o não tratamento
pode ter consequência no desenvolvimento infantil, por causa da má absorção de
nutrientes. Pois, o trofozoíto em grande quantidade no duodeno forma um obstáculo
a absorção de certas vitaminas como: A, D, E, K e B12; ácidos graxos e ácido fólico,
sendo um agravamento para desnutrição e diarreia (MOTTA; SILVA, 2002).
Atualmente a infecção pela giardíase é uma zoonose, está presente em todo
o mundo, e habita os mamíferos, aves, répteis e anfíbios. A identificação dos vetores
da doença é importante para a que tenha um maior monitoramento de casos e o
levantamento de fatores envolvidos nas afecções, e com isso a prevenção seja cada
vez mais possível (MACHADO, 2011).
20
21
3. EPIDEMIOLOGIA DA GIARDÍASE
A infecção parasitária tem ampla distribuição mundial, principalmente em
regiões tropicais e subtropicais. A Giardia lamblia é uma das infecções mais
encontradas em endoparasitoses, afetando aproximadamente 200 milhões pessoas
na Ásia, África e América Latina, representando cerca de 500 mil novos casos por
ano, como na figura 4 demonstra (CARDONA et al., 2014).
Figura 4 – Distribuição global da giardíase
Fonte: Silva (2017 p. 25)
Com a estação do ano há uma propagação maior a doenças parasitárias,
sendo mais agudos em regiões dos países tropicais, normalmente acontece no
verão e nas regiões na qual há o maior uso de piscinas comunitárias frequentadas
por crianças. Outro local que frequentemente se encontram as parasitoses são as
creches devido ao grande número de crianças tornando o ambiente propício para
infestação intestinal (MARIANO, 2014).
Os cães também são grandes responsáveis na a proliferação dos parasitos
pois normalmente são encontrados em suas fezes. Eles estão sempre em praças
públicas, dentro das casas e nas ruas, aumentando ainda mais o risco de
22
contaminação nos adultos e ainda mais nas crianças que normalmente brincam na
areia, gramas etc., como será discutido abaixo em diversas pesquisas (MARIANO,
2014).
De acordo com análises clinicas, realizadas na cidade de Londrina, Paraná,
em 2015, pela comunidade cientifica da Universidade Estadual de Londrina, foram
2.315 amostras analisadas em pessoas de 0 a 80 anos. Identificado que 19,31% das
pessoas estavam infectadas com algum tipo de parasitoses intestinal, sendo na
região sul da cidade este índice foi para 61,3%. Para Giardia lamblia este número foi
para 70,7% da amostra das populações residente da região sul estavam com o
parasita presente. Isso se justifica pela estrutura da região, com valetas de esgoto a
céu aberto, acumulo de lixo em terrenos e córregos, concentração de ocupações
irregulares de habitação, além de ser uma região com alto índice de analfabetismo
de 12 a 17%. Todos estes fatores corroboraram para a precariedade de
infraestrutura e baixa grau de instrução educacional (BOSQUI et al., 2016).
De acordo com Carvalho, Carvalho e Mascarini (2006), foi realizado um
estudo em 279 crianças entre 0 a 6 anos, em creches municipais da cidade de
Botucatu, São Paulo. Dentre estas crianças 53,40% apresentaram parasitismo
intestinal, e 26,88% com Giardia lamblia. Como salientado anteriormente, neste
trabalho há a alta incidência de parasitoses em locais comunitários e entre crianças
da primeira infância que possuem o sistema imunológico em formação, período de
contato frequente com outras pessoas e crianças e fase de experimentação fecal
oral.
Este estudo levou em consideração as 17 creches municipais da cidade, onde
3 creches da zona urbana e uma da zona rural, onde crianças e funcionários da
creche participaram da pesquisa. Realizado 3 coletas para cada indivíduo e com
intervalo de 3 dias para cada coleta (CARVALHO; CARVALHO; MASCARINI, 2006).
Foi realizado um questionário socioeconômico a família das crianças, e
relacionado com os resultados laboratoriais. A incidência maior de Giardia lamblia foi
encontrada na região rural com 48% das crianças da creche rural obtinham a
parasitose, sendo que na área urbana a média de crianças infectadas com Giardia
lamblia se aproximava de 17,33%. Outra constatação do estudo foi a relação com a
fatores socioeconômicos, onde a menor renda familiar, abaixo de um salário mínimo
23
obtinha 71,43% de crianças infectadas, já famílias com nível superior obtinham
26,32% da doença (CARVALHO; CARVALHO; MASCARINI, 2006).
Quanto às condições de moradia, minimamente adequadas, com uso de água
encanada, consumo de água filtrada, higienização de frutas antes de ingeri-las e
coleta regular de lixo, as taxas de incidência chegam a 16% em média. Mesmo
assim, fica um pouco distante da que é estabelecido em países desenvolvidos de 2
a 6% de incidência. Isso demonstra que há vários fatores socioeconômicos e
sanitários no Brasil que podem ser transformados para a minimização de doenças
(MOREIRA, 2019).
24
4. NOVOS MÉTODOS DE DETECÇÃO
As técnicas mais utilizadas no Brasil para detecção da Giardia lamblia seria o
método Ritchie e Faust, indicados para amostras fecais sólidas. O método Ritchie é
usado para detecção de cistos e oocistos de protozoários. Os materiais usados são:
éter, lugol, formol 10%, lâmina, pipeta de Pasteur e gaze. É diluído a amostra de
fezes em água, até o sobrenadante estiver com coloração clara, e usado a
centrifugação para auxiliar neste processo. Depois o formol e éter são adicionados
na amostra, e novamente levado a centrifugação. Coloca-se a amostra na lâmina e
adiciona lugol para coloração da amostra e análise no microscópio, descrito na
figura 5 (CARDONA et al., 2014).
Figura 5 – Etapas da técnica Ritchie
25
Fonte: Brasil (2012 p. 24)
Já o método Faust é um processo de centrífugo- flutuação em uma solução
de sulfato de zinco, ideal para pesquisa de cistos de protozoários e ovos de
helmintos. O material coletado é diluído em água, feita a centrifugação, filtração e
nova centrifugação. Quando a amostra tiver uma coloração clara, é adicionado a
solução de sulfato de zinco e centrifuga-se novamente. Com a alça de platina na
película superficial da amostra, será colhido o material para ser depositado na
lâmina, e tratada com lugol para observação no microscópio (CASTANHO, 2004).
O método Hoffman, Pons e Janer (HPJ), utilizado para identificação das
diversas infestações parasitárias (ovos e larvas de helmintos e cistos de
protozoários) e na triagem das infecções intestinais, como descrito na figura 6. A
intensidade do parasitismo influi no número de formas parasitárias eliminadas. É
recomendável o exame de fezes em três amostras colhidas em dias diferentes, pois
a ausência de parasitas em uma amostra de fezes não elimina a possibilidade da
presença do mesmo no organismo (OLIVEIRA JUNIOR, CALVÃO, 2020).
Figura 6 – Método Hoffman, Pons e Janer (HPJ)
Fonte: Oliveira Junior, Calvão (2020 p.63)
26
O processo de análise parasitológica de análise fecal, métodos mais usados
pela facilidade técnica e baixo custo. Porém em laboratórios as técnicas são
aplicadas de forma complementar para melhorar o acurácia, já que há uma
porcentagem de falso negativo, causado pela baixa carga parasitária no paciente no
momento da coleta (AZEVEDO et al.,2017).
Porém, segundo Lacerda e Dias (2017),este método amplamente difundido
no mundo todo, tem uma porcentagem de erro, por se tratar de um processo que
pode ter confusão com outros patógenos, além de depender da experiência dos
técnicos. Isso, pode ser evitado com a adoção de metodologias de análises como, o
ensaio imunoezimático (ELISA) e a reação em cadeia de polimerase (PCR). Além de
que, segundo Inoue et al. (2018), a análise por microscopia tem uma falha de
30-50% de casos suspeitos, e com uma amostra chega a 50% de falha, por causa,
da intermitência de excreção de cistos e trofozoítos.
O princípio de atuação do ELISA é o conhecimento de um antígeno que
possui alta especificidade por anticorpos, que são proteínas produzidas pelo sistema
imunológico. Então o antígeno presente nas amostras e em contato com os
anticorpos corretos se ligarão, e fará a base para a detecção (BERNE et al., 2017).
De acordo com Berne et al. (2015) o ensaio de imunoenzimático (ELISA) tem
apresentado resultados mais satisfatórios ao que encontra nos exames coprológico.
Foram analisadas 158 amostras de fezes em crianças da região do Rio Grande do
Sul, e encontrado uma discrepância entre os resultados com método ELISA e as
técnicas Ritchie e Faust, chegando a detectar cerca de 3 vezes mais do que os
métodos tradicionais.
O custo do exame ELISA no Brasil teve um custo estimado de US$ 6,70
dólares (cerca de R$34,00), ao passo que o custo de um teste utilizado para leitura
em microscopia é cerca de R$ 1,52 (US$0,30) (INOUE et al., 2018).
Existem muitos kits de antígeno para detecção da Giardia lamblia técnicas
usadas em ensaio imunoenzimático que avalia o antígeno solúveis e testa o
anticorpo em contato com esta solução. Mas eles são caros e demandam uma carga
de trabalho extra para o laboratório em questão, além de maquinário necessário.
Uma técnica alternativa envolve um Sistema de cartão de teste de cromatografia
27
imune em fase sólida (Immuno Card STAT Ensaio rápido de Cryptosporidium⁄
Giardia), que permite a detecção simultânea de Cryptosporidium e também é rápido,
fácil de usar e não requer equipamento extra (MERIDIAN BIOSCIENCE INC., 2015).
Conforme Castanho (2004), o método de ensaio imunoenzimático (ELISA) -
utilizando o kit comercializado pela empresa Thermo Fisher Scientific, denominado
microplaca ProSpecT™ Giardia EZ. O processo de análise do ensaio de microplaca
ProSpecT Giardia EZ, é uma fase sólida imunoensaio para a detecção de GSA 65,
demonstrado na figura 7. Os poços da microplaca são revestidos com anticorpo
anti-GSA 65. O conjugado de enzima (anticorpo monoclonal anti-GSA marcado com
enzima peroxidas) e amostras diluídas de fezes são incubados simultaneamente no
poço. Se GSA 65 estiver presente, é ‘capturado’ entre o anticorpo anti-GSA 65 nos
poços e o conjugado enzimático. Após a incubação, os poços são lavados para
remova o excesso de amostra e qualquer conjugado enzimático não ligado. O
substrato para a enzima, 3,3 ', 5,5'- tetrametilbenzidina (TMB), é adicionado. Em
uma reação positiva, a enzima se ligou ao poço pelo GSA 65 converte o substrato
em uma reação colorida produtos. O desenvolvimento da cor pode ser detectado
visualmente ou espectrofotometricamente. Em uma reação negativa, não há GSA 65
ou um nível insuficiente de GSA 65 presente para ligar a enzima conjugado e
nenhum produto de reação colorido se desenvolve.
Figura 7 – Processo de análise do Kit ProSpecT™ Giardia EZ de
parasitologia
28
Fonte: Thermo Fisher Scientific Inc, (2014)
A técnica da PCR, imita o que a célula faz na mitose, quando a célula faz a
mitose ela precisa se replicar seu DNA para que suas células-filhas tenha cópias do
seu genoma original. Replicar no tubo de ensaio, fazer várias cópias do fragmento
especifico. No tubo de ensaio vai conter um DNA molde, ou seja, DNA alvo que será
copiado, replicado e amplificado, e vários fragmentos do DNA especifico. Já o DNA
DNA polimerase é uma enzima capaz de utilizar uma fita molde de DNA para
sintetizar (gerar) uma nova fita complementar. Utiliza dos nucleotídeos livres para
construir novas moléculas de DNA. Na solução da amostra, são usados os primers
que são pequenos fragmentos de DNA de fita simples, que se ligam ao DNA
presente na amostra, geralmente, nas extremidades complementares e específicos
as extremidades do fragmento alvo de DNA (CASTANHO, 2004).
Existem 3 etapas no processo de análise PCR, a primeira etapa é a
denaturação, com o aumento da temperatura em cerca de 90 graus, a proteína do
DNA se rompe e se transforma em duas fitas simples. No segundo momento,
29
denominado anelamento a temperatura da amostra é reduzida para 60 graus,
aproximadamente, e os primers se ligam as fitas que foram separadas. E no último
processo, as fitas de DNA são preenchidas por completo (HILL; STEWART, 1992).
O PCR em tempo real há um uso crescente desta técnica, pois pode detectar
não só a Giardia lamblia como outras enteroparasitoses, como Cryptosporidium
spp., E. histolytica e D. fragilis, não onera tanto a infraestrutura do operacional do
laboratório. Mas em regiões com baixa demanda e baixos recursos, provavelmente o
exame coprológico seja o mais adequado (VERWEIJ et al., 2003; HUANG; WHITE,
2006).
30
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este trabalho expõe interpretações que finalizam esta pesquisa cientifica, a
qual abordou a temática da giardíase e as formas de detecção do protozoário.
Nesta, o autor buscou relatar tópicos relevante a questão dos procedimentos
recorrentes de detecção do protozoário, dentre eles, estudos detalhados sobre
novos métodos de análise clínica para a identificação desta enteroparasitose.
Dessa forma, dentre os vários projetos existentes apresentados ao longo
desta pesquisa, estre tratou-se de analisar as metodologias de exame por ELISA e
PCR para detecção da Giardia lamblia.
Os métodos tradicionais de exame coprológicos, como as técnicas de Ritchie,
Faust e método Hoffman, Pons e Janer há linhas de pesquisa que identificaram uma
variação muito grande em relação a diagnósticos falso-negativo. Então,
descreveu-se novas técnicas que poderiam ser aplicadas em larga escala no Brasil
para o diagnóstico mais efetivo.
Mas no Brasil, assim como em outros países, a giardíase de certa forma é
negligenciada pelo Estado, e no cenário brasileiro há mais um agravante a não
centralização de informações, e a falta de monitoramento, pois de porte destes
fatores será possível rastrear e minimizar e as afecções no país
Para pesquisas futuras, é necessário que seja avaliado os aspectos gerais da
giardíase no Brasil, mas também a questão financeira da implementação do método
de ELISA e PCR para detecção de Giardia lamblia. Pois, os custos fixos atrelados a
estes testes, podem inviabilizar sua utilização, e a propagação do exame.
31
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