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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINÁRIA ORNITOPATOLOGIA VETERINÁRIA Relatório sobre Necropsia de aves e envio de material biológico para o laboratório Esdras Lima de Carvalho Gueiros Luiza Borba de Almeida Madruga Recife, 05/10/2021 SUMÁRIO 1. Introdução…………………………………………………………………………………. 1 2. Manual de Necropsia e Colheita de Amostras para Diagnóstico Laboratorial…1 3. EPI Equipamentos de Proteção Individual ………………………………...……...... 1 4. Diagnóstico presuntivo………………………………………………………….………. 2 5. Sacrifício…………………………………………………………………….……………....3 6. Necropsia………………………………………………………………………………….. 4 6.1. Exame dos órgãos internos ……………………………………………………… 4 6.2. Amostras para diagnóstico da Influenza Aviária (IA) e Doença de NewCastle (DNC) ..................................................................................................... 5 6.3. Acondicionamento e transporte das amostras ………………………………. 6 7. Diagnóstico laboratorial da Influenza Aviária (IA) e Doença de NewCastle (DNC)........................................................................................................................ 7 Bibliografia……………………………………………………………………………….. 8 1. Introdução A avicultura brasileira ocupa desde 2011 a liderança na exportação de carne de frango, sendo a terceira posição em produção mundial desse produto, considerada por isso uma área internacionalizado e uniforme, sem fronteiras geográficas de tecnologia (RODRIGUES, et al., 2014). Esta liderança se dá devido ao melhoramento de linhagens de insumos, investimentos em tecnologias de automatização do sistema produtivo, aperfeiçoamento de pessoal quanto ao manejo das aves, além do sistema de produção integrado, e principalmente pelo controle das condições sanitárias de criação, uma vez que a avicultura é muito vulnerável no que diz respeito a esta questão. Nesse contexto, o controle e prevenção de doenças como a Influenza aviária e a doença de NewCastle são essenciais para garantir o contínuo crescimento do setor. A influenza aviária é uma doença considerada exótica no Brasil, causada pelo vírus influenza A, capaz de acometer várias espécies de aves. A vigilância permanente para esta enfermidade nos plantéis comerciais de produção avícola e também em aves de subsistência criadas no entorno de sítios de aves migratórias é realizada pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. A doença de Newcastle (DNC) também é de caráter viral, em que seu agente pertence à família Paramyxoviridae, gênero Avulavirus, sorotipo APMV-1. A DNC faz parte da "lista A" das doenças infecciosas da Organização Mundial de Saúde Animal (OIE), que reúne as enfermidades cujas consequências sócio-econômicas podem ser graves e de grande importância no comércio internacional de aves e seus produtos. Ambas as doenças são de notificação obrigatória e fazem parte do Programa Nacional de Sanidade Avícola (PNSA). Assim sendo, esse trabalho objetiva relatar os princípios da necropsia em casos de influenza aviária e DNC de acordo com o Manual de Necropsia e colheita de amostras para Diagnóstico Laboratorial disponibilizado pelo Ministério da Agricultura. 2. Manual de Necropsia e Colheita de Amostras para Diagnóstico Laboratorial Diante da suspeita de ocorrência de surto de influenza aviária de alta patogenicidade ou doença de NewCastle em aves, o diagnóstico presuntivo se inicia com a obtenção do histórico clínico, anamnese, dando especial atenção aos sintomas clínicos: respiratórios, nervosos digestivos e a taxa de mortalidade das aves. O curso de doenças com essas características deve ser considerado um alerta para a tomada imediata de medidas para o seu diagnóstico. Devido a alta probabilidade de ocorrência de contaminação bacteriana durante a colheita das amostras, assim como a necessidade do correto acondicionamento, conservação e transporte do material, esse manual foi criado com o objetivo de contribuir com os profissionais de campo e orientá-los na padronização dos procedimentos de necropsia, colheita, acondicionamento e transporte de amostras ao laboratório contribuindo para seu rápido e preciso processamento pela equipe laboratorial. Também serão demonstrados os procedimentos e caminhos percorridos pelas amostras suspeitas de influenza aviária e doença de Newcastle dentro do laboratório diagnóstico. 3. EPI - Equipamentos de Proteção Individual Os EPI’s são fundamentais para a segurança dos profissionais envolvidos em investigação de suspeita de influenza aviária e doença de Newcastle e devem ser utilizados por todos os profissionais que prestam assistência ao caso suspeito, podendo ser descartável ou não. São itens obrigatórios de EPI: o macacão, propés, máscaras, 2 luvas (presas com fita ao macacão), óculos, capuz, borrifador desinfetante. Outro tipo de EPI são os respiradores com filtro HEPA e bomba de ar (airmate). Todo material utilizado deve ser desinfetado antes de ser descartado no saco de autoclave.É necessário que todos os adornos sejam retirados. O primeiro material de EPI que deve ser colocado é o macacão, o qual deve ser impermeável e ter 2 números a mais para que possa ser vestido em cima da roupa. Depois, coloca-se os propés e, em seguida, as luvas. A primeira luva é chamada de “luva pele” e deve ser fixada ao macacão e a segunda é a de procedimento que deve ser trocada sempre que necessário. Após, deve-se colocar a máscara e o capuz, deixando de fora apenas os olhos e a máscara. Ao invés da máscara pode ser utilizado o capuz de proteção com filtro HEPA. A utilização com a bomba de ar dá mais conforto ao Veterinário, pois a temperatura fica mais agradável. É importante que o filtro fique sempre nas costas, para que não encoste no material de necropsia. O material que pode ser reutilizado vai para o saco de autoclave para ser descontaminado. Primeiramente, troca-se as luvas por outras novas, assim, a retirada dos EPI começa com os propés, depois prossegue com: óculos, capuz de segurança, máscara, uma das luvas, a fita, o macacão do lado avesso (para não encostar na própria roupa) e, por último, as outras luvas. Depois, o saco é fechado e lacrado. Em seguida, faz-se o transporte para o laboratório onde o material será autoclavado. No caso de suspeita de influenza aviária, todos os materiais descartáveis serão eliminados na propriedade. Sua desinfecção e descarte deverão seguir rigorosamente as normas de biossegurança, recomendada nos casos que estão envolvidos microrganismos com capacidade infectante. 4. Diagnóstico presuntivo O diagnóstico de qualquer doença começa-se com uma eficiente coleta de dados do histórico clínico, seguido de uma necropsia realizada de forma minuciosa. No formulário de necropsia é importante anotar os detalhes de todas as estruturas observadas, inclusive as que não que tiverem alterações macroscópicas visíveis. É obrigatória a utilização dos EPI na realização de necrópsia. Nas suspeitas de influenza aviária deve-se utilizar o EPI com respirador de filtro HEPA. Os procedimentos de necropsia, desinfecção dos instrumentais, descarte das aves e equipamentos de EPI deverão seguir rigorosamente as normas de biossegurança recomendadas. Com a ave ainda viva e em estação, analise seu comportamento, postura, coordenação, se existe arrepiamento de penas, claudicação ou dificuldades respiratórias. Para analisar o animal em movimento, levante-o pelas penas da cauda e observe o movimento de pedalagem e bater de asas. Para prosseguir nos exames, é necessário fazer a contenção das aves, deixando pelo menos uma das mãos do veterinário livre para manipulação do animal. Para animais de pequeno porte, a imobilização pode ser realizada colocando a mão no dorso do animal, imobilizando suas asas e prendendo sua cabeça entre os dedos. Outro tipo de contenção para esse tipo de animal: mão no peito da ave e imobilização das suas pernas. Para aves maiores, a imobilização das asas através do seu cruzamento sobre o dorso, permite uma boa contenção. Entretanto, por ser penosa ao animal, somente poderáser realizada se a ave tiver um peso ou tamanho que impossibilite sua contenção através de outro método. A forma mais prática e mais confortável ao animal é a que permite que pernas e asas sejam imobilizadas ao mesmo tempo. Com a ave imobilizada, comece a examinar a cabeça: verifique crista, barbelas, olhos e narinas. Observe se existem sujidades aderidas ao bico, pois isso pode ser indício que houve descarga nasal. Pressione as narinas com os dedos em sentido caudo-rostral, observando se há saída do exsudato. Verifique se existe aumento de volume dos sinus. A seguir, faça uma leve compressão das áreas adjacentes aos ouvidos para verificação da presença de exsudato. Examine a cavidade oral e orofaringe. Passe a observar o restante da superfície do corpo da ave, examinando pele e penas. Verifique se existe alteração na pele, irregularidade no crescimento das penas, penas quebradas ou muito facilmente destacáveis, ou a presença de ectoparasitos. Para exame da região cloacal, pernas e pés, será necessária a imobilização através da extensão dos jarretes. Mantenha o peito da ave apoiada em uma superfície plana, esticando suas pernas. Os exames das pernas e pés devem ser realizados simultaneamente nos dois lados, para permitir comparações e evidenciar as simetrias. Examine as pernas e pés da ave, observando o formato e posicionamento dos ossos e articulações. Analise suas proporções e presença de lesões. Nos pés e almofadas plantares, busque evidências de anomalias e compactação de excrementos. Na região da cloaca, verifique se as penas estão sujas de excrementos ou sangue. Para complementar os exames realizados com a ave viva, precisamos realizar uma necropsia para uma observação minuciosa dos órgãos internos. O sacrifício da ave deverá ser realizado de forma a permitir uma morte humanitária, sendo de exclusiva responsabilidade do médico veterinário. Será realizada obrigatoriamente com método rápido e seguro para quem o executa. Deve causar o mínimo de estresse no operador e no animal, ser realizado com maior grau de confiabilidade possível e obedecer a legislação em vigor. A escolha do método dependerá da habilidade técnica do executor e do número de animais, devendo ainda o método ser compatível com os fins desejados. 5. Sacrifício A desarticulação cervical é a forma mais comum de sacrifício de um pequeno número de aves no campo. Para aves jovens ou de menor porte, esse procedimento é realizado com o auxílio de uma tesoura. O pescoço do animal é posicionado entre as partes do cabo da tesoura e a coluna cervical é desarticulada. Em aves mais velhas ou de maior porte, esse procedimento é realizado com as mãos. A cabeça da ave é tracionada firmemente e a coluna cervical é desarticulada. No caso de suspeita de doenças altamente infecciosas ou com risco para a saúde humana, o procedimento de sacrifício deve ser realizado com a ave acondicionada em um saco plástico, para evitar que secreções e penas se espalhem contaminando o ambiente. A partir desse momento, as observações realizadas com a ave viva, serão complementadas na necropsia. 6. Necropsia Para a necropsia, é necessário: tesoura para destrinchar, tesouras cirúrgicas e pinças dente de rato. Posicione a ave com o peito para cima e a cabeça para o lado oposto em que está o operador. Para que as penas não voam, molhe toda a região ventral com uma solução de água com desinfetante. Faça um corte no lado medial de cada coxa e libere-as. Desarticule a articulação coxofemoral forçando lateralmente. Este procedimento permite que a ave fique estendida sobre o dorso em uma posição mais adequada para o exame. Faça um corte na parte inferior do esterno, estendendo lateralmente em direção às coxas. Rebata a pele, deixando exposta a musculatura do peito, estendo o corte ao longo do pescoço até a mandíbula inferior. Rebata a pele para as laterais do corpo da ave. Examine a pele, o tecido subcutâneo, a musculatura do peito, as coxas e sobrecoxas. Exponha o nervo ciático, realize este procedimento do lado esquerdo e direito e verifique a simetria. Examine a cabeça do fêmur. Corte sua epífise distal longitudinalmente para que a placa de crescimento do osso e a medula óssea sejam examinadas. Observe o timo considerando a idade da ave examinada. Estes exames podem ser dificultados pelas lesões decorrentes do sacrifício da ave. Examine a traqueia e o esôfago exteriormente. Observe o inglúvio a partir da porção distal do esôfago. Fixe sua porção distal da traquéia e seccione, exponha a sua mucosa e examine-a. Reexamine a cavidade oral e a orofaringe. Corte o bico no nível da narina para expor os turbinados. Realize também cortes para examinar o sinus infraorbitário. 6.1. Exame dos órgãos internos Para evidenciar os órgãos internos, faça um corte na extremidade do osso do esterno. Estenda até acima da articulação costocondral através da entrada torácica, cortando-se o osso coracóide. A seguir, rebata o osso para a porção cranial. Observe a superfície interna do esterno. Remova o esterno realizando um corte em sua base. Visualize os sacos aéreos. Essa fase do exame deve ser realizada com extremo cuidado para evitar seu rompimento. Examine a gordura abdominal e o peritônio. Examine o fígado e o coração. Afaste-os e observe os pulmões. Leve o trato gastrointestinal para lateral, tendo o cuidado de liberar o fígado. Seccionado transversalmente a região entre o proventrículo e o esôfago, mantendo a ligação entre o reto e a cloaca. Examine os lóbulos renais. Examine a bursa de fabricius. Remova-a através do descolamento de sua ligação com a porção retal do intestino. Abra a bursa de Fabricius com auxílio de uma tesoura e realize os exames internos. Nestes exames, a idade da ave deve ser levada em consideração. Remova o trato gastrointestinal fazendo uma secção na porção distal do reto. Reexamine os pulmões e os rins. Observe os órgãos reprodutores. Nos machos, examine o par de testículos. Nas fêmeas jovens deverá ser examinado o ovário, das aves em reprodução: ovários e ovidutos. Observe o grau de evolução dos folículos. Assim, passa-se a examinar detalhadamente os órgãos do trato gastrointestinal: proventrículo, moela, alça duodenal envolvendo o pâncreas, alças intestinais, divertículo de Meckel, cecos, tonsilas cecais e reto. Separe o proventrículo e a moela do intestino realizando um corte entre a moela e o duodeno. Faça a abertura do proventrículo e da moela. Remova o conteúdo da moela e, se necessário, lave-a para analisar a coelina, remova-a e examine a mucosa. Examine o proventrículo. Observe o pâncreas envolvido pela alça duodenal. Observe o divertículo de Meckel, ceco e as tonsilas cecais. A seguir, abra o intestino e observe a mucosa. Para examinarmos o SNC, é necessário retirar a pele que recobre a calota craniana. Para removê-la, inicie o corte no forame magno e circunde todo o crânio. Examine o cérebro e o cerebelo. 6.2 Amostras para diagnóstico da Influenza Aviária (IA) e Doença de NewCastle (DNC) É importante que se tenha qualidade nas amostras que serão encaminhadas para o diagnóstico laboratorial. Para garantir a qualidade e aumentar as chances de diagnóstico rápido e preciso, as amostras devem ser também coletadas de outras aves, para minimizar a contaminação bacteriana. As colheitas devem ser realizadas com materiais estéreis. Cuidados especiais devem ser tomados para evitar a contaminação dos frascos de acondicionamento. A troca de luvas deve ser realizada sempre que tocar na ave ou em suas secreções. O sacrifício dos animais deverá ser realizado em saco plástico para evitar contaminação do ambiente com penas e secreções. Todos os frascos que serão utilizados para colheita de amostras, devem ser identificados e conter o conservante viral indicado pelo laboratório oficial. Em caso de suspeita dessas doenças, o EPI deve conter máscara especial para utilização do filtro tipo HEPA. Nas aves vivas, a colheita de material se restringe ao swab traqueal e de cloaca e, se possível, colheita de sangue para obtenção do soro sanguíneo. A colheita de sangueem aves adultas ou de maior porte, deve ser realizada através da punção de uma das veias da asa da ave. Introduza a agulha e puxe o êmbolo delicadamente para evitar a ocorrência de hemólise. Retire aproximadamente 2,5mL de sangue para garantir, pelo menos, 1 mL de soro. Puxe completamente o êmbolo da seringa e deposite-a horizontalmente sob uma superfície plana e aguarde a formação do coágulo e da desoração. Retire o êmbolo da seringa, inverta em um frasco com tampa rosca e anel de vedação e refrigere imediatamente. Em aves de pequeno porte, somente haverá a possibilidade de punção cardíaca. Entretanto, este é um procedimento que coloca em risco a vida do animal. Assim, deverá ser realizado somente em aves que serão sacrificadas. Após a introdução da agulha no coração, proceda da mesma forma que em aves adultas. Para coleta do swab de traqueia, abra o bico da ave e introduza o swab, raspe-o nas paredes da laringe e traqueia para retirar o maior número de células possíveis. Certifique-se que não existe resto de alimento no swab, pois isso indica que ele foi introduzido no esôfago. Coloque o swab em um frasco com tampa rosca e anel de vedação que contenha meio de transporte para conservação viral. Quebre a haste do swab na altura da boca do frasco, feche e refrigere imediatamente. Para coleta do swab de cloaca, levante as penas da cauda e introduza o swab, o raspando nas paredes. Coloque o swab em um frasco com tampa rosca e anel de vedação que contenha meio de transporte para a conservação viral. Quebre o swab na altura da boca do frasco, feche-o e refrigere-o imediatamente. Para as colheitas em aves de pequeno porte, utilize o swab de tamanho adequado. Para aves que serão sacrificadas, deve-se coletar os swabs após seu sacrifício. Sacrifique a ave dentro do saco plástico, corte o plástico e posicione o animal para as coletas. Este procedimento minimiza a contaminação do ambiente com penas, sangue e secreções. Proceda a coleta do swab de cloaca utilizando a mesma técnica realizada na ave viva. Com a traquéia exposta, após a abertura da pele do pescoço, segure-a e proceda a secção em sua porção proximal. Introduza o swab e raspe vigorosamente suas paredes. Coloque o swab em um frasco com tampa rosca e anel de vedação que contenha meio de transporte para conservação viral. Quebre o swab na altura da boca do frasco, feche-o e refrigere-o imediatamente. A colheita das amostras de órgãos será realizada após a abertura da cavidade abdominal. Esse procedimento deverá ser realizado com extremo cuidado para não contaminar o material a ser coletado. Afaste o fígado e o coração, rompa os sacos aéreos e colete um fragmento de pulmão. Coloque um frasco com tampa rosca e anel de vedação que contenha meio de transporte para a conservação viral. Certifique-se que o fragmento esteja coberto pelo conservante, refrigerar imediatamente. Afaste o trato digestivo e colha um fragmento de rim. Coloque-o em um frasco com tampa rosca e anel de vedação que contenha meio de transporte para conservação viral. Certifique-se que o fragmento esteja coberto pelo conservante, refrigerar imediatamente. Realize o mesmo procedimento para o coração e fígado. Localize a alça duodenal e colha um fragmento que contenha duodeno e pâncreas. Coloque em um frasco com tampa rosca e anel de vedação que contenha meio de transporte para conservação viral. Certifique-se que o fragmento esteja coberto pelo conservante, refrigerar imediatamente. Localize o ceco e colha as tonsilas cecais. Coloque-as em um frasco com tampa rosca e anel de vedação que contenha meio de transporte para conservação viral. Certifique-se que o fragmento esteja coberto pelo conservante, refrigerar imediatamente. Para realizar a colheita de amostras do SNC, é necessário retirar a pele que recobre a calota craniana. Para removê-la, inicie o corte no forame magno e circunda todo o crânio, exponha o cérebro e cerebelo e proceda para a coleta de fragmentos dessas estruturas. Coloque-os em um frasco com tampa rosca e anel de vedação que contenha meio de transporte para conservação viral. Certifique-se que o fragmento esteja coberto pelo conservante, refrigerar imediatamente. Antes de realizar o acondicionamento das amostras, certifique-se de que não haja extravasamento de líquido dos frascos. 6.3. Acondicionamento e transporte das amostras O acondicionamento e transporte das amostras são importantes para a manutenção da qualidade do material coletado e devem obedecer às normas de biossegurança. O tempo entre a coleta do material e sua chegada ao laboratório de diagnóstico deverá ser o menor possível e o laboratório deverá ser avisado com antecedência. O transporte do material é muito importante. Algumas maneiras de transporte: o material coletado é colocado em frascos com tampa rosca e anel de vedação chamados de embalagens primárias. Estas embalagens devem estar envolvidas em material absorvente para evitar extravasamento de líquido do material em caso de quebra. Em seguida, é colocada uma embalagem plástica que é chamada de embalagem secundária, a qual é dobrada e colocada dentro da embalagem terciária, sendo esta feita com material resistente como alumínio ou PVC resistente a impactos. Esta embalagem é colocada em caixa isotérmica com material refrigerante adequado ao tempo de viagem da amostra. A caixa isotérmica é acondicionada em caixa de papelão, impermeável internamente e que tenha sido rotulada com etiqueta de material infectante. Estes procedimentos de modalidade de acondicionamento são aprovados pelos órgãos nacionais e internacionais que regulamentam o transporte aéreo. Outra maneira de acondicionamento é colocar a amostra em nitrogênio líquido seco. O material está dentro do criotubo que é a embalagem primária. Abra o botijão de nitrogênio e tire o cânister: embalagem secundária. Neste caso, não é necessário material absorvente. Coloca-se novamente o cânister no botijão, sendo esta a embalagem terciária. A caixa fechada rotulada com etiqueta de material infectante, depois de passada a fita poderá ser transportada com segurança. Desta forma, o material poderá ser conservado em até 30 dias. 7. Diagnóstico laboratorial da Influenza Aviária (IA) e Doença de NewCastle (DNC) O diagnóstico laboratorial destas doenças é composto por procedimentos que vão de relativamente simples à altamente complexos. As amostras com suspeita de Influenza Aviária serão trabalhadas em laboratório de segurança nível 3 e os técnicos estão obrigatoriamente protegidos com EPI com respirador que contém o filtro HEPA. A amostra é entregue no setor de recepção de amostras para conferência da documentação e triagem. O formulário, chamado de FORM IN, deve ser preenchido de acordo com as normas nacionais, com carimbo e assinatura do responsável pelo envio. No formulário, deverá constar informações claras e precisas sobre os animais durante os últimos 30 dias, provável origem das doenças, origens dos animais, bem como dos profissionais envolvidos no caso. Uma via do formulário que acompanha as amostras deve ser enviada paralelamente às autoridades sanitárias competentes. No caso de suspeita de Influenza Aviária ou Doença de NewCastle, a amostra é encaminhada na mesma caixa fechada diretamente à área de biossegurança. Somente nesta área a caixa será aberta e os soros, swabs e órgãos avaliados, são separados e devidamente identificados. Os soros são avaliados quanto ao volume, hemólise e contaminação e, se adequados, são direcionados para a área de sorologia para execução dos testes de ELISA para diagnóstico da doença de NewCastle e Influenza aviária. As amostras positivas para Influenza Aviária serão submetidas ao teste de Ágar gel precipitação para confirmação. Independentemente dos resultados sorológicos e, após a inativação viral, uma alíquota dos swabs de cloaca e traqueia e pequenos fragmentos dos órgãos são submetidos aos processos de extração de RNA para execução do teste de PCR em tempo real. Este teste visa a detecção da presença do vírus nas amostras pela amplificação doseu material genético. São realizadas duas reações distintas: Uma para pesquisa do vírus da doença de NewCastle e outra para o vírus da influenza aviária . Para identificação da neuraminidase dos vírus da Influenza, o teste mais confiável é o teste sorológico de neuraminidase e sequenciamento do gene, essencial para diferenciar um vírus H5N1 (potencialmente perigoso) e H5N2 (usualmente não patogênico). Independente do resultado de ELISA e PCR, uma alíquota dos swabs traqueal, cloacal e pequenos fragmentos dos órgãos, devem ser submetidos ao isolamento viral em ovos embrionados. Caso se detecte a presença de vírus hemaglutinante deve-se identificá-lo. Sempre que se detecta a presença do vírus de NewCastle e Influenza aviária, deve-se verificar seu grau de patogenicidade e isso pode ser feito por meio do sequenciamento genético ou IPIV (no caso de influenza aviária) ou IPIC (no caso da doença de NewCastle). Assim, os procedimentos e técnicas do manual buscam minimizar os riscos durante a investigação de casos suspeitos de Influenza Aviária de alta patogenicidade e doença de NewCastle, bem como garantir a rapidez e precisão no diagnóstico laboratorial. Bibliografia: , MinistérioManual de Necropsia e colheita de amostras para Diagnóstico Laboratorial da Agricultura, YouTube, Dezembro de 2006, 31min44s. Disponível em: https://www.youtube.com/watch?v=wu9CLgRtGgU CARDOSO, Ana Lúcia Sicchiroli Paschoal; TESSARI, Eliana Neire Castiglioni. Doença de Newcastle. 2011. REISCHAK, Dilmara. Vírus da influenza aviária: monitoramento em aves de subsistência criadas no entorno de sítios de aves migratórias no Brasil. 2016. Tese de Doutorado. Universidade de São Paulo. RODRIGUES, Wesley Osvaldo et al. Evolução da avicultura de corte no Brasil. Enciclopédia Biosfera, v. 10, n. 18, 2014. https://www.youtube.com/watch?v=wu9CLgRtGgU