Relatório biologia extração do ADN

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Relatório: Extração do ADN
Professor: Nuno Boucinha Trabalho realizado por:
Disciplina: Biologia e Geologia A Francisco Martins 11ºC Nº9
Data: 15-11-2017
Índice
página
Introdução-------------------------------------------------------------------------------- 3
Materiais utilizados--------------------------------------------------------------------- 9
Procedimento experimental----------------------------------------------------------- 10
Apresentação de resultados----------------------------------------------------------- 11
Discussão de resultados---------------------------------------------------------------- 12
Conclusão--------------------------------------------------------------------------------- 14
Bibliografia e Web Grafia------------------------------------------------------------- 15
Introdução
 Nesta atividade experimental visámos a visualização de moléculas de ADN de células vegetais do quivi e da banana. Para conseguir-mos a extração do ADN passámos por várias etapas, utilizando diversos princípios. 
 A extração e posterior análise do ADN é uma técnica muito importante em investigações forenses e em investigações científicas.
 Mas, durante muito tempo não se conheciam as moléculas intervenientes nos mecanismos responsáveis pela expressão das características dos seres vivos, nem como estes se processavam. Só no século XX foi possível desvendar onde se encontrava a informação que permitia estes mecanismos - a informação genética – e perceber como esta intervia na morfofisiologia dos seres vivos e como se transmitia de célula para célula.
	A descoberta do ADN
 Em 1869, o bioquímico suíço Friedrich Miescher descobriu uma molécula de natureza ácida e de elevado peso molecular - o ADN. Aconteceu na sequência de uma de muitas experiências com células do pus (analisou o núcleo de células vindas de glóbulos brancos). Os resultados foram desconsiderados: foram levantadas muitas dúvidas sobre a descoberta.
 Miescher chamou à substância de nucleína e, anos mais tarde (em 1889) após a obtenção de preparações com um elevado grau de pureza da molécula, por Richard Altmann, conseguiu-se confirmar a natureza ácida da nucleína, passou-se a chamar de Ácido nucleico.
 Em 1900, através do estudo de leveduras, descobriu-se outro ácido nucleico que diferia do outro ácido nucleico por possuir a base azotada uracilo em vez da base azotada timina e a pentose ribose em vez da pentose desoxirribose. Desta forma, foram classificados dois tipos de ácidos nucleicos, classificados de acordo com a pentose que possuíam – o Ácido desoxirribonucleico e o Ácido ribonucleico.
	Função do ADN
 
 Embora tenham continuado os estudos com os ácidos nucleicos desconhecia-se a sua função e, foram necessários muitos anos após a sua descoberta até se ter percebido que estes compostos eram o material genético. Pensava-se que eram as proteínas que continham as informações genéticas, pela sua variabilidade tanto na sua estrutura como na sua composição.
 Em 1928, o médico britânico Frederick Griffith realizou os primeiros estudos do ADN como material hereditário, através de experiências com bactérias de pneumonia e o seu efeito em ratos domésticos. As bactérias do tipo S (virulentas, normalmente letais para os ratos) depois de mortas conseguiram, de alguma forma, passar informações químicas que transformaram a estirpe R e converteram-na em bactérias vivas do tipo S, tornando-se virulentas, razão pela qual os ratos morrem. Griffith chamou a estas informações genéticas de princípio transformante.
 
Figura 1: Experiência de Griffith 
 
 
 Em 1944, o investigador bioquímico canadense Oswald Avery e a sua equipa de colaboradores conseguiram identificar o princípio transformante como sendo o ADN, após testes com diversas moléculas químicas e enzimas que degradavam essas moléculas. Quando utilizou a Desoxirribonuclease (DNase ou DNAase). Ou seja, o ADN proveniente de bactérias do tipo S previamente mortas é incorporado pelas bactérias do tipo R. Isto permite que as bactérias R passem a ter a informação necessária para produzirem cápsula, passando assim a serem letais, resultando na morte dos ratos. Abaixo está uma esquematização dessa experiência.
 
Figura 2: Experiência de Avery e Macleod 
 Em 1953, os geneticistas Alfred Hershey e Martha Chase conseguiram, através de uma experiência com o vírus bacteriófago T2 (um ser muito simples cujo ciclo de vida já se conhecia), corroborar o que já se sabia sobre o ADN ( que era o suporte universal da informação genética). Abaixo está uma esquematização simples dessa experiência.
 
Figura 3: Experiência de Hershey e Chase 
 Ou seja, se fosse o fósforo (P), as proteínas não contêm este elemento, a aparecer nas bactérias infetadas o ADN seria o material genético, se fosse o enxofre, o ADN não tem este elemento na sua composição, as proteínas seriam o material genético. Verificou-se que grande parte do fósforo radioativo foi transferido do bacteriófago para a bactéria, em oposição, não se verificou a presença de enxofre radioativo nas bactérias. Logo, é o ADN que contém as informações genéticas.
	Composição química do ADN
 
 O ADN é uma biomolécula orgânica pertencente ao grupo dos ácidos nucleicos. As suas unidades básicas são os nucleótidos. Estes apresentam uma base azotada, uma pentose e um grupo fosfato. A base liga-se ao carbono 1’ da pentose do nucleótido e o grupo fosfato ao carbono 5’.
 A pentose é a desoxirribose as bases azotadas são as de anel duplo, as púrinas, a adenina (A) e a guanina (G), e as de anel simples, as pirimidinas, citosina (C) e a timina (T).
 Os diferentes nucleótidos estabelecem ligações entre si através do grupo fosfato de um nucleótido e o carbono 3’ da pentose do nucleótido seguinte (ligação fosfodiéster), formando cadeias polinucleotídicas.
	Estrutura do ADN: o modelo da dupla-hélice
 Em 1953, James Watson e Francis Crick apresentaram o modelo tridimensional da molécula de ADN. Para isto foram importantes diversos contributos de experiências, tais como:
	 Os estudos de Erwin Chargaff, que consistiram na quantificação de bases azotadas em amostras de ADN de diferentes espécies.
 
Figura 4: Proporções de bases em ADN de diferentes fontes. 
 
 
 
 
 A partir destes estudos foi possível tirar importantes conclusões sobre a estrutura do ADN. Descobriu-se que todas as espécies possuem ADN com as mesmas bases azotadas, mas em diferente número, a composição quantitativa de bases azotadas era a mesma dentro da mesma espécie e que, independentemente da espécie que foi retirada a amostrada de ADN, os valores de adenina são idênticos aos valores de timina e os valores de guanina são idênticos aos valores de citosina. A partir disto retiraram-se as seguintes expressões:
 
 
 e
 Logo, no ADN, a base púrica adenina liga-se especificamente à base pirimídica timina e a base púrica guanina liga-se especificamente à base pirimídica citosina. Como estas bases azotadas só se ligam entre si, há complementaridade de bases.
	Os estudos de radiogramas da difração de raios X, por Rosalind Franklyn e Maurice Wilkins, também contribuíram para a descoberta da estrutura em hélice do ADN. Quando foi feita a incidência de raios X no ADN cristalizado a figura obtida no radiograma foi em cruz o que indica a forma em hélice do ADN.
	Os dados de microscopia eletrónica também auxiliaram na descoberta de Watson e Crick. A espessura de uma molécula de ADN é maior que a de uma cadeia polinucleotídica ( duas vezes maior).
 
 Em 1953, James Watson e Francis Crick apresentaram um modelo tridimensional coerente com os resultados experimentais e dados apresentados até a altura. 
 Alguns anos após a sua proposta foram feitas experiências que confirmaram a sua hipótese de o ADN ser constituído por duas cadeias polinucleotídicas enroladas em hélice. Estas estão ligadas entre si por pontes de hidrogénio, estabelecidas entre as bases azotadas. A adenina liga-se à timina, porduas ligações de hidrogénio, e a guanina liga-se à citosina, por três ligações de hidrogénio.
 Cada uma das cadeias nucleotídicas apresenta uma extremidade 3’ livre, em que se inicia a cadeia, e uma extremidade 5’, em que esta termina, verificando-se que as duas cadeias polinucleotídicas estão dispostas em sentido inverso, a extremidade 3’ de uma cadeia corresponde à extremidade 5’ da outra e vice-versa, pelo que são antiparalelas.
 Apesar da estrutura da molécula de ADN ser igual em todas as formas de vida, cada organismo tem o seu próprio ADN que o torna único e diferente de todos os outros (inclusive dos da mesma espécie), diferindo na proporção e na sequência das suas bases azotadas.
 Em cada ser, a parte do ADN responsável por uma informação designa-se gene e o conjunto de todos os genes de um ser vivo é o seu genoma.
 
 
Figura 5: Estrutura do ADN e modelo tridimensional da molécula. 
 
	Célula eucariótica vegetal
 
 A célula é a unidade básica e elementar dos sistemas biológicos, pelo que é a unidade básica da vida. As células podem ser, de acordo com a sua estrutura, procarióticas ou eucarióticas, sendo as últimas mais recentes, maiores e mais complexas. As células procarióticas formam os seres procariontes e estes seres são unicelulares. As células eucarióticas formam os seres eucariontes podendo estes seres ser unicelulares ou pluricelulares. As células eucarióticas possuem núcleo individualizado, delimitado por um invólucro nuclear membranoso, e vários tipos de organitos. Os animais, as plantas e os fungos são formados por este tipo de células. 
 As células animal e vegetal possuem a mesma estrutura básica - membrana citoplasmática, citoplasma e núcleo - mas quando observados ao microscópio ótico evidenciam-se algumas diferenças.
 As células vegetais possuem plastos e têm uma parede celular exterior à membrana citoplasmática, devido a esta apresentam muitas vezes forma geométrica. Normalmente, possuem apenas um grande vacúolo, as plantas superiores não possuem centríolos. As células animais não possuem plastos nem parede celular. Possuem vários vacúolos pequenos e têm centríolos.
 
Figura 6: Célula eucariótica vegetal 
 
 
 Tanto a membrana plasmática como a membrana dos organelos seguem o modelo do mosaico fluido. As membranas regulam as trocas e têm uma composição lipoproteica. Os lípidos são principalmente fosfolípidos. Estes possuem uma extremidade polar hidrofílica, com glicerol e fosfato e outra extremidade apolar hidrofóbica, com ácidos gordos. As extremidades hidrofóbicas estão viradas umas para as outras, enquanto que as extremidades hidrofílicas estão viradas para o meio intracelular e extracelular. As proteínas que se encontram na membrana têm uma função estrutural, intervêm no transporte de substâncias específicas e têm uma função de receção de determinadas hormonas. Ainda existem, associados aos lípidos e às proteínas da membrana, glícidos, que servem de recetores químicos de determinadas hormonas.
 Nos seres eucariontes, a informação genética encontra-se no núcleo da célula distribuída por várias moléculas de ADN, às quais estão associadas proteínas - as histonas - que são responsáveis pelo mecanismo de condensação da molécula (enrolamento). Cada uma das moléculas de ADN encontra-se sob a forma de um filamento que se encontra disperso pelo nucleoplasma, quando as células entram em processo de divisão estes filamentos condensam.
 
 
 Materiais utilizados
	Quivi (podia-se utilizar banana ou um pedaço de fígado, mas no caso do meu grupo foi utilizado 1 quivi).
	10 mL de detergente de loiça
	3 g de sal
	70 mL de água da torneira
	Álcool etílico
	Faca
	Almofariz
	Proveta
	Funil
	Papel de filtro
Procedimento experimental
	Descascou-se e cortou-se o quivi em pequenos pedaços.
	Colocou-se o quivi no almofariz e iniciou-se o processo de esmagamento.
	Juntou-se numa proveta 70 mL de água da torneira, 10 mL de detergente e 3 gramas de sal.
	 Adicionou-se ao quivi, que se encontrava no almofariz, a mistura.
	Triturou-se o produto obtido.
	De seguida, colocou-se o papel de filtro, em forma de leque, num funil.
	Verteu-se, através do funil, a mistura para uma proveta.
	Adicionou-se, lentamente, álcool à solução filtrada.
	Aguardou-se pela precipitação do ADN.
Apresentação de Resultados
 ADN 
 Álcool 
 Camada aquosa distinta da camada alcoólica 
 
 Depois de se adicionar o álcool aguardou-se. Começou a notar-se a ascensão lenta de fitas brancas muito finas de ADN do quivi. Depois de algum tempo, foi possível observar a formação de um novelo branco e filamentoso de ADN, que se formou na zona de interseção entre o álcool e a camada aquosa. O novelo de ADN ascendeu e acumulou-se, posteriormente, na parte superior da proveta.
 É possível observar o novelo de ADN do quivi por estarem aglomeradas, neste novelo, milhões de moléculas de ADN. Caso as moléculas de ADN fossem observadas individualmente não seria possível vê-las a olho nu, uma vez que, as moléculas de ADN individuais têm um tamanho microscópico.
Discussão de resultados
 A extração e posterior observação do ADN do quivi foi feita em diversas etapas, foram utilizados diferentes componentes que atuaram quimicamente nas células e no ADN: sal, detergente e álcool. Também utilizámos instrumentos que atuaram fisicamente nas células e no ADN: um almofariz e papel de filtro.
 Para se extrair o ADN do quivi primeiramente recorreu-se ao almofariz. Procedemos desta maneira de forma a romper as paredes celulares das células vegetais do quivi e, também, a membrana citoplasmática das células. A membrana nuclear do núcleo, por ser de dimensão muito reduzida, não foi destruída com este procedimento, pelo que o ADN permaneceu dentro do núcleo, intacto (o ADN encontra-se dentro do núcleo por se tratar de uma célula eucariótica). Aquando deste procedimento obtemos uma polpa de quivi espessa.
 Utilizou-se o detergente de loiça para causar a desorganização das membranas uma vez que o detergente dissolve as gorduras / os lípidos que se encontram nas membranas. Destruindo assim não só a bicamada fosfolípidica das membranas citoplasmáticas, uma grande parte já foi rompida pelo procedimento anterior, mas também as membranas dos organelos. Ainda libertou o ADN do núcleo ao romper as membranas nucleares, também elas constituídas por fosfolípidos (o ADN encontra-se dentro do núcleo por se tratar de uma célula eucariótica).
 Utilizou-se o sal para se ter um ambiente mais favorável ao ADN, pois o cloreto de sódio (designado comummente de sal de cozinha) torna a molécula de ADN mais estável com a ajuda das histonas. Isto acontece porque o cloreto de sódio (NaCl) altera a carga da molécula de ADN. O ADN possui nucleótidos que têm um grupo fosfato com um número elevado de cargas negativas, estas repelem-se umas às outras. O sal dissocia-se num ião positivo Na+ e num ião negativo Cl-. As cargas Na+ positivas do sal vão neutralizar as cargas negativas do fosfato e vão impedir as repulsões elétricas entre as moléculas de ADN. Isto vai estabilizar a solução, o que permite à moléculas de ADN, com a ajuda das histonas, agregarem-se formando um novelo de filamentos compridos e espessos que possibilita a observação a olho nu do ADN. Também foi utilizado o sal para que as proteínas dissolvidas na solução extraída não precipitassem com o ADN.
 Filtrou-se a mistura de quivi, água da torneira, detergente e sal para a proveta utilizando o papel de filtro em forma de leque (maximizando, assim, a área de superfície de absorção) dentro de um funil (que facilitou a passagem da mistura de um recipiente para o outro). Recorreu-se à filtração do preparado para que apenas uma parte mais ou menos translúcida e liquida atravessasse o filtro, separando assim o ADN do resto dos constituintes da célula. Alguns constituintes maiores, como as paredes celulares e as membranas citoplasmáticas não atravessaram o filtro e acabaram por ficar presas no funil. O papel de filtrodeixou passar o ADN e as proteínas. A parte liquida depositou-se, uniformemente, no fundo da proveta.
 Depois da filtração procedemos à junção de álcool à mistura filtrada. Foi utilizado pois ajuda na remoção de impurezas que se podiam encontrar no ADN. Mas a principal razão da utilização do álcool foi separar o ADN do resto da mistura e permitir a sua ascensão. E foi exatamente isso que aconteceu, permitindo que filamentos de moléculas de ADN ascendessem para a camada alcoólica e, posteriormente, para a parte superior da proveta. Isto ocorreu pois o ADN não é solúvel no álcool, o álcool é menos denso que a água e o ADN tem uma densidade menor que a água e que a mistura. O álcool vai precipitar o ADN. Isto causa o movimento lento do ADN em direção à camada alcoólica e, depois, para a superfície, levando ao aparecimento de um novelo filamentoso e esbranquiçado, formado na zona de interseção entre o álcool e a camada aquosa.
 
Conclusão
 
 Esta atividade experimental visou a extração do ADN de células vegetais do quivi para a sua posterior visualização. Para isto, utilizámos alguns processos que tinham por base princípios relacionados com a célula e mais especificamente com o ADN ( que se encontra no núcleo da célula por estarmos a realizar a extração de uma célula eucariótica vegetal).
 Por talvez terem sido cometidos alguns erros no procedimento experimental a ascensão do ADN não ocorreu, possivelmente se se tivesse aguardado mais algum tempo, a ascensão ocorreria. Na apresentação de resultados mostrou-se o que supostamente ocorreria, se tudo tivesse sido feito corretamente.
 Através desta atividade consegue-se tirar diversas conclusões sobre a molécula de ADN. O ADN é muito pouco denso, não é solúvel em álcool e as suas ligações de hidrogénio entre as bases azotas são energicamente fracas. Ainda se constatou que os grupos fosfato das moléculas de ADN têm carga negativa, podendo ser estabilizadas com sal e que o detergente dissolve gorduras e por isso pode ser utilizado para destruir membranas.
Web Grafia e Bibliografia
- https://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_desoxirribonucleico
-https://pt.scribd.com/doc/70406400/Relatorio-Biologia-11%C2%BA-Extracao-do-DNA
-http://desvendandoodna.blogspot.pt/
- http://www.notapositiva.com/old/pt/trbestbs/biologia/11extrmoladn.htm
- Powerpoints do Google Drive providenciados pelo professor.
- https://www.slideshare.net/anabzizou/extraco-do-dna-do-kiwi
- Biologia e Geologia, Terra, Universo de Vida 11º Ano, Porto Editora