cinética

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE AGRONOMIA
SETOR DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
CINÉTICA DE PROCESSOS BIOLÓGICOS
AÇÃO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SUBSTRATO SOBRE A
ATIVIDADE DA PEROXIDASE
GOIÂNIA, 2019
1. RESUMO
Enzimas possuem diversas variáveis que afetam sua atividade, uma delas é a influência
da concentração do substrato na velocidade inicial da reação enzimática. Este relatório objetiva
verificar o comportamento da atividade enzimática dada uma variação na concentração do
substrato (H2O2) através da análise a leitura de absorbância em espectrofotômetro no qual foi
possível constatar que, de acordo com o gráfico montado, com o aumento da concentração de
substrato, ocorreu um aumento na velocidade de reação de atividade enzimática, Isso pôde ser
concluído ao verificar que, a partir de uma concentração do substrato, a velocidade final se
tornou constante, no parâmetro cinético igual a x.
2. OBJETIVOS
Verificar a ação da concentração do substrato sobre a atividade da enzima (peroxidase).
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizadas os seguintes materiais:
● Extrato de enzimas pelifenoloxidade;
● 6 tubos de ensaio;
● Estante para tubo de ensaio;
● Solução tampão (Citrato Fosfato 0,1M, pH 5,0);
● Água destilada;
● Incubadora;
● Solução de Guaiacol 1%;
● Espectrofotometro - Biospectro SP 220;
● Micropipeta de volume variavel;
● Ponteiras;
● Metabissulfito de sódio;
O Preparo do extrato onde se encontra a enzima polifenoloxidade a ser analisada foram
feitos pelas técnicas responsáveis pelo laboratório, os discentes não estavam presentes durante o
procedimento.
Com a amostra devidamente pronta, fez-se os seguintes passos;
● Adicionou-se 1mL de extrato em 5 tubos de ensaio,
● Adicionou-se em cada tubo 2 mL de solução tampão (Citrato Fosfato 0,1M, pH 5,0)
● Adicionou-se 0,5 mL de solução com diferentes concentrações de H2O2 - sendo a
concentração H2O2 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, respectivamente nos tubos denominados
1,2,3,4 e 5.
● Fez a incubação à 30°C dos tubos por 5 minutos.
● Adicionou-se solução de Guaiacol 1% em todas os tubos em seguida homogeneizou-se.
● Fez-se novamente a incubação por 5 minutos. Adicionou-se 1 mL de Metabisulfito de
sódio em cada tubo de ensaio. Por fim fez-se a leitura da amostras em espectrofotômetro.
● Fez-se os cálculos para obter os parâmetros desejados para o experimento.
Obs: foi realizada o preparo de uma solução chamado “branco” que auxilia na precisão
do equipamento. O Preparo foi feito seguindo exatamente os mesmo passos das amostras
comuns. Porém não foi adicionado extrato de enzimas (sendo substituído por H2O).
E para na adição de H2O2, foi utilizada a concentração de 3%.
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Na Tabela 1 a seguir estão dispostos os valores experimentais da absorbância de cada
amostra.
Cálculo da atividade enzimática (peroxidase):
1) Obter leitura real (descontar o valor do branco). (Leitura da absorbância da sua
amostra – leitura do branco) = valor X (valor real da leitura)
Amostra Leitura Real
1 0,922
2 0,274
3 0,149
4 0,115
5 0,104
2) Obter a atividade da enzima por minuto de reação bioquímica (dividir o valor X pelo
minutos de reação). O tempo de reação foi igual a 5. (valor X / tempo de reação) = valor
Y
Amostra Atividade da enzima
1 0,184
2 0,055
3 0,030
4 0,023
5 0,021
3) Obter a atividade da enzima por grama da amostra/por minuto (dividir o valor X pelos
minutos de reação). Para peroxidase foram 0,4 gramas de amostra em cada mL do extrato
enzimático utilizado na reação. (valor Y / quantidade de amostra contida no extrato
enzimático) = valor Z
Amostra Atividade da enzima por grama de amostra por minuto
1 0,460
2 0,137
3 0,075
4 0,057
5 0,052
4) Obter a atividade da enzima por µmol enzima/grama da amostra/minuto (dividir o
valor Z). Neste passo será realizado o valor da conversão da absorbância (Abs) por
Unidade (UE). 1 U.E. (unidade enzimática de peroxidase) = 0,001 valor de absorbância.
1 U.E. ------ 0,001 (absorbância)
W ----- Z
Amostra Atividade da enzima por µmol enzima/grama da amostra/minuto
1 460
2 137
3 75
4 57
5 52
Na Tabela 2 a seguir estão dispostos os resultados encontrados para valor real da
leitura, atividade da enzima por minuto, atividade da enzima/grama/minuto e
atividade da enzima/μ mol/grama/min:
Tabela 2: Valores obtidos experimentalmente para a atividade da enzima
Amostra Valor de
Leitura
Atividade
Enzimatica/min
Atividade
Enzimatica/grama/
min
Atividade
Enzimatica/μ
mol/grama/min
1 0,922 0,184 0,460 460
2 0,274 0,055 0,137 137
3 0,149 0,030 0,075 75
4 0,115 0,023 0,057 57
5 0,104 0,021 0,052 52
Gráfico 1: Relação entre valores de atividade enzimática e concentração de
substrato
À medida que se aumenta a concentração inicial do substrato, as velocidades de formação
do produto se tornarão cada vez maiores. No equilíbrio da 1ª etapa existirá cada vez mais
complexo ES. Nestas condições haverá a maior concentração possível do complexo ES; a reação
será processada na máxima velocidade possível. Existirá uma determinada concentração de
substrato que provocará a formação de uma concentração de ES igual à metade da máxima
possível. Nestas condições, a velocidade será, naturalmente, a metade da maior velocidade
possível. Esta concentração definida de substrato é igual à Constante de Michaelis-Menten ou
Km (NAIDEK, 2016).
Neste aspecto há uma taxa máxima na qual certa quantidade de enzima pode catalisar
uma reação específica, pois apenas quando a concentração de substrato é extremamente alta, esta
taxa máxima pode ser alcançada. Sob condições de alta concentração de substrato, a enzima está
em saturação, isto é, seus sítios ativos estão todos ocupados por moléculas de substrato ou
produto. Nesta condição, um aumento na concentração de substrato não afetará a taxa de reação
porque todos os sítios ativos já serão utilizados. Em condições celulares normais, as enzimas não
estão saturadas com substrato. Em um determinado tempo, algumas das moléculas de enzima
poderão estar inoperantes por falta de substrato, assim, a velocidade de reação e a constante de
afinidade são influenciadas pela concentração de substrato (NAIDEK, 2016).
5. CONCLUSÕES
Com a análise dos resultados experimentais foi possível observar que, com a variação de
concentração de substrato peroxidase, há uma variação crescente linear de atividade enzimática,
até atingir um ponto máximo entre atividade enzimática e substrato, uma vez que para os valores
máximos encontrados graficamente e entre os fatores de correlação, o aumento da concentração
de substrato não interfere na taxa de reação a partir do ponto máximo, visto que esta se torna
constante.
6. BIBLIOGRAFIA
NAIDEK, K.; P.; Cinética química dos processos biológicos. UNIVERSIDADE DO ESTADO
DE SANTA CATARINA, CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS – DQMC BIOQUÍMICA,
novembro, 2016.