TCC Spodoptera frugiperda e fungos associados

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO OESTE DA BAHIA – UFOB
Centro Multidisciplinar de Luís Eduardo Magalhães – CMLEM
Graduação em Engenharia de Biotecnologia
BRUNA NOVAIS SILVA
SPODOPTERA FRUGIPERDA (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) E FUNGOS ASSOCIADOS: PERSPECTIVAS ECOLÓGICAS E BIOTECNOLÓGICAS
Luís Eduardo Magalhães, BA
2021
BRUNA NOVAIS SILVA
SPODOPTERA FRUGIPERDA (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) E FUNGOS ASSOCIADOS: PERSPECTIVAS ECOLÓGICAS E BIOTECNOLÓGICAS
Trabalho de conclusão de curso apresentado à Universidade Federal do Oeste da Bahia, como requisito para obtenção do título de Bacharel em Engenharia de Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Taides Tavares dos Santos
Coorientador: Dr. Lucas Souza Arruda 
Luís Eduardo Magalhães, BA 
2021
BRUNA NOVAIS SILVA
SPODOPTERA FRUGIPERDA (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) E FUNGOS ASSOCIADOS: PERSPECTIVAS ECOLÓGICAS E BIOTECNOLÓGICAS
Trabalho de conclusão de curso apresentado à Universidade Federal do Oeste da Bahia, como requisito para obtenção do título de Bacharel em Engenharia de Biotecnologia.
Luís Eduardo Magalhães-BA, 06 de setembro de 2021.
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________________
Prof. Dr. Taides Tavares dos Santos
Universidade Federal do Oeste da Bahia
_________________________________________________
Prof. Dr. Bruno Motta Oliveira
Universidade Federal do Oeste da Bahia
_________________________________________________
Prof. Dra. Eveleise Samira Martins Canto
Universidade Federal do Oeste do Pará 
(A versão assinada deste documento encontra-se na Coordenação do Curso)
AGRADECIMENTOS
Agradecer é uma forma de dizer você fez parte, você estava lá comigo! 
Agradeço em primeiro lugar a Deus, que nunca me desamparou e nem me deixou só por nenhum segundo que seja em toda a minha existência, por ser o fôlego de vida todas as vezes que parecia que ia me afogar!
A mim mesma, caramba como tenho orgulho de mim! Por não escutar a minha mente que muitas vezes me traia dizendo que eu não era capaz, ou que eu não conseguiria chegar ao fim!
Ao meu esposo Dereck que está de parabéns por ter aturado meu mau humor e estresse! Agradeço por todo apoio e carinho que só você poderia me dar, te amo!
A minha família: Meus pais Dinaura e Airton, as minhas irmãs Jéssica, Marta, Eduarda e Júlia, a minha avó Zenaide e todos os meus familiares que me ajudaram em todos os aspectos. E por família não me refiro apenas a parentesco, me refiro a quem realmente estava lá por mim, o que inclui, Célia, Beto e Thainá, família que adotei no meu coração!
Aos meus amigos: Gabi Serafim, por todos os momentos juntas, você é inspiradora; A Gabi Amaral, Felipetto, Biesek, Thay e Ozânia, pelos momentos de cachaçada e descontração, eles tornaram esses cinco anos mais leves e divertidos!
Aos meus professores: Heverson, Felipe, Bruno Motta, Aurizângela, Jamilly, Samuel, Bruno Trindade, Nara, Lais e Mariana, por todo conhecimento e experiencias compartilhadas ao longo desse tempo.
Por fim, mas não menos importante, agradeço ao meu orientador Taídes, por cumprir com excelência o papel em orientar. Obrigada por toda ajuda, feliz por termos construído nesse pouco tempo uma relação de respeito e amizade!
EPÍGRAFE
“Não sou eu que te mando ser forte e corajoso? Não temas nem te apavores, pois Javé, teu Deus, estará contigo aonde quer que fores” (Josué 1,9).
RESUMO
A atuação de insetos-praga é um dos principais fatores responsáveis pelas quedas em produtividade agrícola e prejuízos econômicos no Brasil e no mundo. Entre esses insetos-praga, destaca-se a lagarta Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), cujo controle é baseado principalmente em métodos químicos, que são prejudiciais ao ambiente e à saúde humana e animal, além de potencialmente selecionarem populações de lagartas resistentes aos produtos em uso. Investigações da microbiota associada aos insetos e aos substratos a eles circundantes pode contribuir para o entendimento do papel ecológico desses microrganismos, bem como possibilitar insights para o desenvolvimento de produtos e/ou processos de interesse biotecnológico. Diante disso, o objetivo deste estudo foi investigar a interação entre S. frugiperda e fungos ambientais visando à seleção de agentes microbianos com potencial de uso biotecnológico. Para isso, lagartas foram coletadas em campo e criadas em laboratório com dieta natural (folhas de milho da variedade IPR 164 desinfectadas). Durante a criação, foi realizado o monitoramento do ambiente visando a detecção macroscópica de fungos e, foi avaliada a presença destes microrganismos por meio de cultivo. Além disso, foi analisada a eficiência dos métodos de desinfecção superficial das folhas de milho destinadas à alimentação de lagartas. Investigou-se, ainda, a presença de fungos filamentosos e leveduriformes cultiváveis associados à superfície corpórea S. frugiperda e, realizou-se um bioensaio de triagem para atividade inseticida com os fungos mais frequentemente isolados. Entre os resultados, fungos não foram detectados macroscopicamente durante a criação das lagartas, embora tenham sido constatados por meio de cultivo. A comparação entre os protocolos de desinfecção superficial demostrou que o protocolo empregado em rotina laboratorial (denominado como I) permitiu o crescimento de diversos microrganismos (fungos e bactérias), enquanto o protocolo proveniente da literatura (denominado II) se mostrou eficiente na eliminação de microrganismos epifíticos e patogênicos em potencial. Quanto à microbiota do corpo de S. frugiperda, é possível afirmar com veemência que fungos estão frequentemente associados a ela, uma vez que foi possível obter esses microrganismos a partir de todos os insetos amostrados. Com relação ao tamanho populacional, verificou-se maior ocorrência de fungos filamentosos (média ± desvio padrão = 3,5 x 101 ± 3,2 x 101 UFC/lagarta) do que de leveduras (5,0 x 100 ± 5,1 x 100 UFC/lagarta). As 33 morfoespécies (19 de fungos filamentosos e 14 leveduriformes) obtidas foram agrupadas em oito morfotipos (quatro de fungos filamentosos e quatro de leveduras). Representantes de cada um dos três morfotipos mais frequentes (F3, F2 e L1) foram utilizados no bioensaio de atividade inseticida. Numa escala qualitativa de toxicidade, o fungo filamentoso F3 e a levedura L1 mostraram-se atóxicas. Por outro lado, o fungo filamentoso F2, identificado como Cladosporium sp., foi classificado como pouco tóxico. Apesar da baixa toxicidade, esse fungo pode ser considerado como um bom candidato a ser explorado na perspectiva de obtenção de produtos biotecnológicos de interesse para a agricultura. Estudos complementares futuros devem ser conduzidos visando caracterizar quantitativamente a atividade inseticida de metabólitos desse fungo (Cladosporium sp. F2) contra S. frugiperda, bem como elucidar o(s) composto(s) responsáveis por essa atividade. 
Palavras-chave: bioinseticida; inseto-praga; microbiota; milho. 
ABSTRACT
The action of insect pests is one of the main factors responsible for the declines in agricultural productivity and economic losses in Brazil and in the world. Among these pests, the caterpillar Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) stands out. The control of this insect is based mainly on chemical methods, which are harmful to the environment and human and animal health. Investigations of the microbiota associated with insects and their surrounding substrates can contribute to the understanding of the ecological role of these microorganisms, as well as providing insights for the development of products and/or processes of biotechnological interest. In view of this, the aim of this study was to investigate the interaction between S. frugiperda and environmental fungi to select microbial agents with potential for biotechnological use. For this purpose, caterpillars were collected in the field and raised in a laboratory with a natural diet (disinfected maize leaves of the IPR 164 variety). During creation, the monitoringof the environment was carried out, aiming at the macroscopic detection of fungi, and the presence of these microorganisms was evaluated through cultivation. In addition, the efficiency of the methods of surface disinfection of corn leaves destined to caterpillars was analyzed. The presence of filamentous fungi and yeast associated with the body surface of S. frugiperda was also investigated, and a screening bioassay for insecticidal activity was carried out with the most frequently isolated fungi. Among the results, fungi were not detected macroscopically during the rearing of the caterpillars, although they were found through cultivation. The comparison between surface disinfection protocols showed that the protocol used in laboratory routine (denominated as I) allowed the growth of several microorganisms (fungi and bacteria), while the protocol from the literature (denominated II) was efficient in the elimination of microorganisms epiphytic and potential pathogens. As for the microbiota of the body of S. frugiperda, it is possible to vehemently state that fungi are frequently associated with it, since it was possible to obtain these microorganisms from all sampled insects. Regarding population size, there was a higher occurrence of filamentous fungi (mean ± standard deviation = 3.5 x 101 ± 3.2 x 101 CFU/caterpillar) than yeast (5.0 x 100 ± 5.1 x 100 CFU/caterpillar). The 33 morphospecies (19 filamentous fungi and 14 yeast) obtained were grouped into eight morphotypes (four filamentous fungi and four yeast). Representatives of each of the three most frequent morphotypes (F3, F2 and L1) were used in the insecticidal activity bioassay. On a qualitative scale of toxicity, the filamentous fungus F3 and yeast L1 were non-toxic. On the other hand, the filamentous fungus F2, identified as Cladosporium sp., was classified as low toxic. Despite its low toxicity, this fungus can be considered a good candidate to be explored from the perspective of obtaining biotechnological products of interest to agriculture. Future complementary studies should be conducted to quantitatively characterize the insecticidal activity of metabolites of this fungus (Cladosporium sp. F2) against S. frugiperda, as well as to elucidate the compound(s) responsible for this activity.
Keywords: bioinsecticide; insect pest; microbiota; corn.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 01 – Ciclo de vida dos fungos endofíticos em uma planta ...........................................18
Figura 02 – Ciclo de vida da Spodoptera frugiperda ...............................................................22
Figura 03 – Local de realização das coletas de amostras biológicas deste estudo ...................25
Figura 04 – Cartucho da planta de milho (Zea mays L.) ..........................................................27
Figura 05 – Etapas de criação de S. frugiperda .......................................................................32
Figura 06 – Caracterização macromorfologia e micromorfologia dos fungos filamentosos mais frequentemente isolados ..................................................................................................36
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 – Unidades Formadoras de Colônia (UFCs) e morfoespécies de fungos filamentosos e leveduras por lagarta amostrada ......................................................................34
Tabela 02 – Caracterização macromorfológica dos fungos filamentosos e das leveduras isoladas .....................................................................................................................................35
Tabela 03 – Bioensaio de atividade inseticida contra S. frugiperda ........................................37
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µg – Micrograma
µL – Microlitro
BDA – Batata Dextrose Ágar 
Bt – Bacillus thuringiensis
CPTO – Cento de Pesquisa e Tecnologia do Oeste da Bahia
L – Litro
min. – Minuto
mL – Mililitro
q.s.p. – quantidade suficiente para
r.p.m. – Rotação por minuto 
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS	4
EPÍGRAFE	5
RESUMO	6
ABSTRACT	8
LISTA DE ILUSTRAÇÕES	10
LISTA DE TABELAS	11
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS	12
1. INTRODUÇÃO	14
2. OBJETIVOS	16
2.1 OBJETIVO GERAL	16
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS	16
3. REFERENCIAL TEÓRICO	17
3.1 FUNGOS: UMA VISÃO GERAL	17
3.2 INTERAÇÃO DE FUNGOS COM PLANTAS	18
3.3 INTERAÇÃO FUNGO - PLANTA - INSETO	20
3.4 SPODOPTERA FRUGIPERDA	22
3.5 BIOINSETICIDAS	24
4. METODOLOGIA	26
5. RESULTADOS	33
6. DISCUSSÃO	39
REFERÊNCIAS	43
Apêndice I	50
Apêndice II	55
Apêndice III	58
INTRODUÇÃO
Segundo o Canal Rural (2021), o Brasil é um dos maiores produtores de grãos do mundo, podendo chegar em 2050 a produzir mais de 500 milhões de toneladas. A cultura do milho está entre as mais importantes mundialmente, o Brasil, na temporada 2019/2020, colheu aproximadamente 101 milhões de toneladas do grão (ADAMS et al., 2021). No estado da Bahia, a região Oeste é a principal responsável pela produção de grãos, sendo cultivada na região 100% da soja, 31% do milho e 97% do algodão do estado (OLIVEIRA; VIEIRA, 2018). O município de Luís Eduardo Magalhães, localizada no extremo Oeste da Bahia, é responsável por grande parte dessa produção, sendo considerada referência no setor agrícola e movimento econômico baiano, consolidando o agronegócio como propulsores na região (SOUZA, 2019). 
Quedas em produtividade agrícola e consequentes prejuízos econômicos no Brasil estão associados, entre outros fatores, à atuação de insetos-praga (PICANÇO et al., 2003; CORASSA et al., 2019). Entre esses insetos, destaca-se a Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), também conhecida como lagarta-do-cartucho. Trata-se da principal praga dos cultivos de milho nas Américas e, apesar da preferência por gramíneas, pode estar presente também nas culturas de feijão, algodão e sorgo (SILVA et al., 2011; JARALEÑO-TENIENTE, 2020). S. frugiperda é a causadora de grandes prejuízos econômicos relatados na agricultura, uma vez que, em condições favoráveis, a reprodução do inseto aumenta, comprometendo a produtividade das culturas-alvo. Estima-se que os prejuízos no Brasil, decorrentes da atuação dessa praga, podem chegar à ordem de 400 milhões de dólares por ano (SILVA et al., 2011; SANTOS et al., 2017).
A proliferação do inseto-praga S. frugiperda pode ser favorecida por fatores como clima, época de semeadura e sistemas de irrigação empregados, sendo prevalecente, para seu controle, o emprego de métodos químicos. Nesses métodos, o produto é pulverizado em amplo espectro, eliminando a praga e qualquer outro inimigo natural que possa estar presente no ambiente. Como já é sabido, o controle químico pode ocasionar problemas ambientais e à saúde humana, podendo provocar efeitos negativos sobre os organismos benéficos a lavoura, além de selecionar as populações de lagartas resistentes aos defensivos agrícolas utilizados (MOREIRA et al., 2019; ADAMS et al., 2021). Além disso, o uso indiscriminado de inseticidas traz prejuízos ao solo e ao equilíbrio ambiental (CORRÊA; SALGADO, 2011). 
Diante dos problemas ambientais supramencionados, decorrentes do uso de defensivos agrícolas, torna-se evidenciada a necessidade de busca por soluções para o controle de insetos-pragas que sejam menos agressivas ao meio ambiente e, ao mesmo tempo, eficientes. Nessa perspectiva, o manejo de culturas e o controle de pragas vem sendo estudado para diferentes pragas agrícolas. Diversos predadores atuam no controle da S. frugiperda na cultura de milho e, compostos obtidos a partir de microrganismos tem demonstrado atuação como bioinseticidas (FIGUEIREDO et al.,1999; BÉLO et al., 2009), o que pode vir a mudar a perspectiva de controle de insetos-praga, que atualmente fundamenta-se basicamente em controle químico.
Na perspectiva de uso de microrganismos e/ou de seus metabólitos em estratégias de controle biológico, pode-se destacar o uso de fungos com atividade inseticida, as quais são utilizadas na agricultura em substituição a inseticidas químicos(OLIVEIRA, 2014; ABREU et al., 2015; LI et al., 2016). Cerca de 700 das 100 mil espécies descritas de fungos apresentam ação patogênica aos insetos, consequentemente controlando seus níveis populacionais em uma determinada cultura agrícola e, por isso, sendo definido como produtos biológicos ou bioinseticidas (KHAN et al., 2012, ALVES et al., 2020). Apesar disso, os poucos relatos de uso de bioinseticidas que são atualmente empregados para o controle de S. frugiperda são relacionados ao emprego de vírus da família Baculoviridae (Baculovírus) e de bactérias da espécie Bacillus thuringiensis (SARMENTO et al., 2002; MOREIRA et al., 2019). Diante disso, justifica-se a realização do presente trabalho, executado com o apoio da Fundação Bahia, instituição de pesquisa sem fins lucrativos situada no município de Luís Eduardo Magalhães, que objetiva contribuir no aprofundamento da pesquisa local, no que concerne à investigação de fungos presentes no ambiente que potencialmente interagem com S. frugiperda, na perspectiva de compreender a importância ecológica e investigar potenciais usos biotecnológicos desses microrganismos. 
OBJETIVOS
1 
2 
 OBJETIVO GERAL
Investigar a interação entre Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) e fungos ambientais visando à seleção de agentes microbianos com potencial de uso biotecnológico.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
· Descrever graficamente as etapas empregadas para criação de larvas de S. frugiperda em laboratório;
· Monitorar o crescimento de fungos na superfície do corpo de S. frugiperda e nos substratos e superfícies circundantes ao inseto durante um ciclo de criação em laboratório (desde a captura da larva em campo até obtenção do adulto);
· Comparar a eficiência de métodos desinfecção superficial de folhas do milho (Zea mays L.) destinadas à alimentação de S. frugiperda em laboratório;
· Isolar, purificar e caracterizar morfologicamente os fungos associados ao corpo S. frugiperda;
· Realizar ensaios de triagem para atividade inseticida com os fungos mais frequentemente isolados do corpo de S. frugiperda.
REFERENCIAL TEÓRICO
3 
 FUNGOS: UMA VISÃO GERAL
Os fungos são organismos unicelulares ou multicelulares, que apresentam células eucariontes, reprodução por meio de esporos (sexuais ou assexuais) ou por brotamento (no caso das leveduras), metabolismo heterotrófico, aeróbico ou anaeróbico facultativo (ALEXOPOULOS et al., 1996; EVERT; EICHHORN, 2013). Esses organismos podem ser microscópicos (fungos filamentosos e leveduriformes) ou macroscópicos (cogumelos), o que está relacionado à multiplicidade de características das várias espécies do grupo. Estima-se que o número de espécies possa chegar a 8,25 milhões, porém o número de espécies descritas até o momento é de apenas 100 mil (ABREU et al., 2015).
Fungos são organismos responsáveis por grande parte do equilíbrio ambiental, uma vez que, juntamente com as bactérias, atuam nos ciclos biogeoquímicos, sendo responsáveis pela decomposição de detritos vegetais (COLLA et al., 2008; ROCHA et al., 2017). Fungos auxiliam também no crescimento vegetal, ajudam as plantas a se protegerem contra inimigos naturais ou patogênicos, atuam na degradação de substâncias tóxicas e, por meio do estabelecimento de simbiose, auxiliam as raízes da planta a absorverem água e minerais do solo (TORTORA et al., 2012). Os fungos são também importantes para os animais, podendo estar associado ao trato digestório destes, bem como aos seus tecidos superficiais, podendo atuar como imunomoduladores, bem como produzirem substâncias de interesse para o metabolismo microbiano (DOUGLAS, 2015; SANTOS et al., 2019).
A diversidade representada pelos fungos é muito grande e a micologia tem por objetivo explorar essa variedade, levantando questões e problemas nos mais variados setores das atividades humanas, trazendo reflexos no âmbito da biotecnologia, na criação e desenvolvimento de novos produtos e técnicas, acarretando em significativas melhoras direta ou indiretamente nos setores farmacêuticos, alimentícios e agrícolas (OLIVEIRA, 2014).
Em 1929, foi relatado por Alexander Fleming pela primeira vez metabólitos do fungo Penicillium notatum, a penicilina, substância capaz de combater infecções de origem bacteriana. A descoberta de Fleming proporcionou um novo olhar sobre os fungos na medicina, acarretando em uma demanda produtiva na área farmacêutica, com um vasto número de compostos bioativos tem sido descrito a cada ano, aumentando a gama de aplicações das mais variadas substâncias como fármacos (NEWMAN; CRAGG, 2016). 
A utilização dos fungos na indústria de alimentos é bastante conhecida, uma vez que esses microrganismos são aplicados a bastante tempo na produção de pães (Saccharomyces cerevisiae e outras leveduras fermentativas), shoyo (Aspergillus oryzae), queijos (Penicillium roqueforti) e bebidas fermentadas, como cerveja e vinho (Saccharomyces cerevisiae e outras leveduras fermentativas) (TAKAHASHI et al., 2017).
Na agricultura, espécies fúngicas têm sido utilizadas no controle biológico de pragas, atuando diretamente como bioinseticidas e bioherbicidas. Trata-se de uma alternativa criada aos pesticidas sintéticos, diminuindo a potencial toxicidade que estes produtos podem causar ao meio ambiente e aos animais, além de atenuar a incidência de fungos fitopatogênicos resistentes (LI et al., 2016).
INTERAÇÃO DE FUNGOS COM PLANTAS 
As relações entre fungos e plantas abarcam uma grande variação entre essas interações, dependem da adaptação e especificidade do hospedeiro, além do estágio de desenvolvimento das partes envolvidas, dos mecanismos de defesa da planta, e das condições climáticas nas quais essas interações ocorrem (AZEVEDO et al., 2000). As associações com os fungos permitem que muitas plantas possam se adaptar às adversidades terrestres, incluindo resistência aos estresses bióticos e abióticos (RODRIGUEZ; REDMAN, 2008).
Os fungos podem ser classificados tanto em relação ao local dos quais são isolados, como em função da relação que estabelecem com seus hospedeiros. Os mais conhecidos são, endofíticos, epifíticos, fitopatogênicos, entomopatogênicos, rizosféricos, de solo e isolados de organismos marinhos. Entre aqueles que interagem com plantas, os endofíticos são aqueles capazes de colonizarem o interior de órgãos vegetais, sem causar danos à planta hospedeira, proporcionando nutrientes favoráveis ao crescimento e metabólitos que contribuem para formação da mesma (AZEVEDO, 1999; TAKAHASHI; LUCAS, 2008). 
A associação entre plantas e fungos endofíticos vem sendo investigada em culturas alimentares, plantas tóxicas e plantas medicinais, e, apesar dessas relações serem classificadas ainda como complexas, sabe-se que há uma produção de substâncias que podem conferir diversas vantagens às plantas. Agentes inibidores de pragas e patógenos, metabólitos primários e secundários de interesse, como o taxol, lipopeptídeos antimicóticos e vários antibióticos, são exemplos dos benefícios oferecidos por essa interação (SOUZA et al., 2004; SOUZA et al., 2018). 
A inibição de pragas e patógenos ocorre por meio da produção de uma variedade de compostos secundários, tais como terpenóides, esteroides, alcaloides e compostos aromáticos, os quais são tóxicos ou capazes de repelir os seus inimigos (LIU et al., 2001). Em relação à simbiose estabelecida, os fungos endofíticos promovem uma maior habilidade competitiva, altas taxas de enraizamento e germinação, maiores biomassas nos tecidos e produção de sementes, além de favorecerem a planta quanto ao estresse hídrico, salino e oxidativo (FAETH; FAGAN, 2002).
Alguns fatores podem interferir na variedade e frequência com que os fungos endofíticos são encontrados em seus hospedeiros. A umidade ambiental, distribuição geográfica, parte da planta, dentre outros são decisivos para variação de planta para planta ou de região para região. Dentro de uma mesma espécie podem ser encontrados ainda diferentes endofíticos a depender das condições climáticas nas quais se encontra (NAIR; PADMAVATHY, 2014).Os endofíticos geralmente são transmitidos de uma planta para outra de forma horizontal, aparentando ser esta a forma predominante de transmissão (Figura 01) (SAIKKONEN et al., 2004). Os estômatos presentes nas folhas são portas ideais, facilitando a penetração dos fungos através dos tecidos frágeis e expostos, podendo permanecer próximo ao local de entrada ou disseminar-se pela planta (ZINNIEL et al., 2002; SOUZA et al., 2004). A transmissão vertical ocorre quando os fungos penetram pelas sementes ou raízes. Podemos citar como exemplo Xylaria sp. e Acremonium sp., fungos que utilizam esse meio de transmissão como forma de disseminação (WHITE JR. et al., 1996).
Figura 01 – Ciclo de vida dos fungos endofíticos em uma planta.
 (
Transmissão
 
vertical
via sementes
) (
Assexuadamente 
) (
Sexuadamente 
por esporos
) (
Transmissão
horizontal:
)
Fonte: Adaptado de SAIKKONEN et al., 2004.
	
Os fungos endofíticos vêm sendo cada vez mais utilizados na agricultura, tanto como agentes de biocontrole de pragas, bem como para controle de doenças causadas por fungos patogênicos, além de influenciarem de forma positiva no crescimento vegetal através da produção de fitoreguladores (AFZAL et al., 2014). Em certas gramíneas o ataque de insetos como Spodoptera frugiperda e S. eridana, foi reduzido pela presença de fungos endofíticos do gênero Acremonium (BREEN, 1993). Isentas do ataque de insetos, as plantas se tornam mais resistentes ao ataque de doenças e são selecionadas para determinação de endófitos presentes na planta (CLAY et al., 1993).
O fungo Piriformospora indica, conhecido por promover o desenvolvimento de muitas plantas, tais como, tabaco, salsa e o milho, colonizando endofiticamente as raízes dessas plantas (VARMA et al., 1999). A produção de compostos secundários, forneceram as plantas aos longos dos anos a capacidade das se defenderem contra insetos, microrganismos patógenos e animais herbívoros (LIU et al., 2001).
Devido à grande extensão territorial, o Brasil possui uma grande variedade de ecossistemas, o que proporciona uma alta diversidade de fungos endofíticos. Muitos estudos já foram feitos com as mais variadas espécies nativas e esses microrganismos já foram isolados das mais diversas partes das plantas, flores, frutos, caules, raízes, folhas e sementes (NAIR; PADMAVATHY, 2014). A colonização pode ser sistêmica ou localizada, sendo capazes de chegar aos espaços inter e intracelulares, tais como, xilema, floema, epiderme, entre outros (GERMAINE et al., 2004). 
INTERAÇÃO FUNGO - PLANTA - INSETO
As interações entre plantas e insetos podem ser consideradas positivas. A herbivoria, por exemplo, é apontada como um dos mecanismos evolutivos que em possíveis relações mutualistas, levam a tolerância (GONÇALVES, 2016). Estudos mostram que mesmo com uma remoção de cerca de 95% da biomassa de uma planta da espécie Ipomopsis agregata, em decorrência da herbivoria, tanto a produção de sementes como a sobrevivência das plântulas aumentaram significativamente (FRITZ; SIMMS, 1992). 
Os insetos podem se tornar pragas quando atingem níveis populacionais capazes de causar danos a uma determinada cultura. Alguns insetos que são considerados inicialmente como inofensivos podem se tornar pragas a partir da introdução acidental ou migração para áreas fora de sua região nativa, ou ainda quando este inseto se torna vetor de um patógeno vegetal ou animal (GULLAN; CRANSTON, 2007). A S. frugiperda é considerada mundialmente como uma das principais pragas na cultura do milho e do arroz, e pode causar altos índices de desfolhamento quando acometida em uma plantação (CRUZ, 1995).
No que tange a interação dos fungos com insetos, esta pode se dar das mais diversas formas, seja na síntese de compostos que ajudem o sistema imunológico na proteção contra patógenos como na contribuição nutricional. Evidencias sugerem que fungos como os ascomicetos são parceiros capazes de prover proteção e compostos essenciais como, por exemplo, os esteroides (DOUGLAS, 2015; PALUDO et al., 2018). Relações mutualistas podem influenciar no crescimento, desenvolvimento e fecundidade do inseto, dada a magnitude desse relacionamento há o interesse em saber como ocorrem as associações defensivas, e como a variedade de defesas químicas podem levar a descoberta de produtos naturais bioativos (STAMPS et al., 2012; MELO et al., 2019).
As associações das leveduras com insetos ainda são pouco conhecidas, no geral os insetos protegem as leveduras em ambientes desfavoráveis e servem como meio de propagação, diferente das bactérias e dos fungos filamentosos que se dispersam pelo ar, as leveduras precisam de vetores para se propagarem pelos diferentes ambientes (PALANCA et al., 2013; CHRISTIAENS et al., 2014). As leveduras são conhecidas ainda por atraírem besouros através da produção de fermentados voláteis, a atração inicial dos insetos pelos alimentos depende na maioria das vezes de estímulos olfativos, o que estreita essa associação (GILLOTT, 2005; GANTER, 2006). 
Uma vez que essa interação é estabelecida, a natureza dessa relação deve ser investigada, podendo se tratar de uma associação, neutra, mutualística ou parasitária. Um exemplo a ser citado e a relação entre besouros da família Anobiidae e Symbiotaphrina spp., na qual foi demostrado que essas leveduras habitam o intestino anobiídeo fornecendo nitrogênio e vitaminas a seus hospedeiros, degradam uma série de compostos que ajudam na digestão de alimentos e na desintoxicação de vários compostos (VEGA; DOWD, 2005).
As leveduras desenvolveram estratégias evolutivas para se adaptarem ao trato gastrointestinal dos insetos, essa resistência à digestão gástrica permite a sobrevivência desses microrganismos no intestino do hospedeiro (COLUCCIO et al., 2008). O intestino possui características especificas que podem favorecer o acasalamento intra e interespécies de células de leveduras, o que pode ser considerado vantajoso para produção de híbridos, gerando um aumento da biodiversidade genética das leveduras, além de potencializar os processos fermentativos industriais para diferentes tipos de substratos fermentáveis (STEFANINI et al., 2012; 2016). 
Além do trato intestinal, muitas outras interações são estabelecidas embora pouco compreendidas. Formigas do gênero Cyphomyrmex cultivam leveduras como fonte de alimento, o besouro Doubledaya bucculenta mantém uma relação simbiótica com os sacaromicetos que favorecem o desenvolvimento larval (MUELLER et al., 1998; TOKI et al., 2012). Outros relatos incluem a alta frequência de leveduras associadas a larvas e pupas de abelhas sem ferrão, essas leveduras podem atuar como agente de deterioração do mel para as abelhas, além de estarem relacionadas com o processo de pupação dessas abelhas (ROSA et al., 2003).
Poucos estudos associam as leveduras com os insetos da ordem Lepidoptera, e o pouco descrito na literatura se concentra em borboletas e mariposas. Todavia, há um interesse muito grande por esses insetos, visto que muitos deles são pragas relevantes em culturas economicamente importantes como, por exemplo a Helicoverpa armígera na cultura de algodão e a Ostrinia nubilalis no milheto. A Galleria mellonella tem sido bastante utilizada em estudos de imunidade e infecções fúngicas, porém ainda são escassos os relatos de leveduras que são associadas naturalmente a esta mariposa (STEFANINI, 2018).
Contudo, apesar dos diversos esforços empreendidos até agora para se conhecer a diversidade dos fungos associados aos insetos e os mais variados aspectos das interações estabelecidas, ainda se faz necessários que sejam realizados estudos envolvendo a interação dos fungos com seus hospedeiros, sobretudo visando obter uma compreensão sistêmica do inseto e de seus microrganismos associados no ecossistema em que se encontra.
SPODOPTERA FRUGIPERDA
A S. frugiperda, também conhecida como lagarta-do-cartucho, originária das zonas tropicais, trata-se de um inseto polígrafo que se alimenta de um grande número de plantas, principalmente gramíneas como trigo, sorgo e arroz (SARMENTO et al.,2002). Apesar de sua preferência por gramíneas podem se apresentar nas mais diferentes culturas, incluindo feijão, algodão, batata, batata doce, amendoim, tomate, espinafre, repolho, entre outras (CRUZ, 1995).
A lagarta-do-cartucho é a principal praga do milho nas Américas, causando prejuízos na cultura tanto na fase vegetativa de maior desenvolvimento do milho, como, logo após a germinação ou espigamento (CRUZ, 1997). O ciclo de vida completo da S. frugiperda dura cerca de 30 dias (Figura 02), que vai desde o ovo até a fase adulta, inicialmente a lagarta ataca somente as folhas e o cartucho, todavia, em altas infestações podem atacar as espigas e cortar a planta na região do colo (MOREIRA et al., 2019).
Figura 02 – Ciclo de vida da Spodoptera frugiperda
Fonte: Elaborado pelo autor (2021).
O método químico é o método mais utilizado atualmente para o controle da S. frugiperda em lavouras de milho. Outros métodos vêm sendo inseridos no mercado visando um menor custo e impacto ambiental, o controle biológico vem crescendo substancialmente no mercado, sendo que o predador Doru luteipes apresenta grande potencial para o controle da praga (MOREIRA et al., 2019). Esse predador na fase adulta pode chegar a consumir 21 larvas pequenas por dia, podendo se desenvolver e se reproduzir nas mesmas condições que a S. frugiperda, valorizando sua utilização no controle biológico dessa praga (RODRIGUES et al., 2013).
O controle biológico é uma ferramenta importante para o manejo integrado dessa praga, sendo que o sucesso da técnica depende do conhecimento e da adaptação do agente biológico aplicado na lavoura. Mesmo que a utilização de pesticidas químicos não seja totalmente substituída pelo controle químico, uma variedade microrganismos vêm sendo estudadas, e as quedas expressivas nos custos para produção de bioprodutos, coloca o controle biológico como uma das principais alternativas de controle (MAHMOUD, 2017; ASSEFA; AYALEW, 2019).
Uma forma de controle biológico é a utilização do bioinseticida a base de Baculovirus spodoptera, o qual apresenta eficiência comparável à dos inseticidas químicos (CRUZ, 1997). O fungo Beauveria bassiana (COSTA, 2019) e a bactéria Bacillus thuringiensis também têm sido utilizados como meio de controle da praga, através da pulverização esses bioinseticidas agem por contato e ingestão, e são caracterizados pela seletividade que possuem em relação aos inimigos naturais presentes nas plantações de milho (MOREIRA et al., 2019).
BIOINSETICIDAS
Os primeiros microrganismos a serem empregados no controle biológico de pragas foram os fungos, mais de 700 espécies são patogênicas aos insetos (KHAN et al., 2012). A espécie B. bassiana é muito estudada por infectar várias espécies de insetos, sendo descrita em 1834 por Agostino Bassi como patógeno do bicho-de-seda, contribuindo com os avanços dos estudos nesse setor (GLARE; MILNER, 1991; ALVES, 1998). 
Os microrganismos que são capazes de controlar os insetos-pragas de uma cultura são definidos como produtos biológicos ou bioinseticidas (VALICENTE, 1994). O uso de bioinseticidas vem sendo estudado em diferentes pragas agrícolas, Sesamia calamistis, Muscina stabulans, Pratylenchus zeae e Pratylenchus jaehni, são exemplos nos quais os compostos obtidos a partir de microrganismos atuam como bioinseticidas (BÉLO et al., 2009). Em 2010, Zappelini et al., demonstrou uma alta taxa de mortalidade em larvas de D. saccharalis causada pelas linhagens M. anisopliae IBCB 384 e M. anisopliae IBCB 425.
A integração entre diversas táticas tem sido utilizada para o manejo de culturas e o controle de pragas. Estudos acerca do controle da S. frugiperda na cultura do milho revelam que a vespa Telenomus remus (FIGUEIREDO et al.,1999); o predador Doru luteipes, a vespa Campoletis flavicincta e os parasitóides Chelonus insularis, Pristomerus spinator, Archytas incertus, Exasticolus fuscicornis, Eiphosoma vitticole, Cotesia marginiventris e o Eiphosoma laphygmae, têm se mostrado viáveis no controle da S. frugiperda nas culturas de milho no Brasil (FIGUEIREDO et al., 2006).
Os endofíticos estão se tornando cada vez mais importantes no que diz respeito ao controle biológico, estudos acerca dos potenciais benéficos na agricultura provocam uma especial atenção a cerca desses microrganismos (GUO et al., 2008). O controle biológico é um fenômeno natural que ocorre na natureza, se estabelecendo através da regularização de isentos-praga através dos inimigos naturais, tornando esses agentes de controle em alternativas ao uso de pesticidas químicos na agricultura (PARRA et al., 2002).
Para que os endofíticos possam ser utilizados no meio agrícola, é necessário que os resultados científicos obtidos em laboratório sejam reproduzidos no campo, para tanto, algumas condições devem ser estabelecidas como a quantidade de microrganismos depositadas nos hospedeiros bem como o meio mais adequado para entrada do mesmo na planta (SANTOS; VARAVALLO, 2011). Fatores externos devem ser levados em consideração, as diferentes condições climáticas podem influenciar nos testes (ROCHA et al., 2017; BARRETTI, 2009).
 METODOLOGIA
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CARACTERIZAÇÃO DA ÁREA DE ESTUDO
	O estudo foi conduzido no Centro de Pesquisa e Tecnologia do Oeste da Bahia (CPTO), na Fundação Bahia, situado na rodovia BR 020/242, Km 53, no município de Luís Eduardo Magalhães - BA, conforme pode ser observado na Figura 03. A região possui clima Tropical (Aw/Köppen-Geiger) (PEEL, 2007), com inverno seco que vai de maio a setembro e verão chuvoso e quente que se estende entre outubro e abril (BATISTELLA et al., 2002). A vegetação predominante na região é de Cerrado (SANO et al., 2010) e a pluviosidade anual varia de 800 a 1.600 mm e médias de temperaturas máxima e mínima de 26° e 20°C, respectivamente (BATISTELLA et al., 2002). 
Figura 03 – Local de realização das coletas de amostras biológicas deste estudo.
Fonte: Elaborado pelo autor (2021).
Nesta área, foi realizada a coleta de S. frugiperda na fase larval. As lagartas foram manualmente retiradas do cartucho das plantas de milho e identificadas, em campo, por um especialista em entomologia agrícola da Fundação Bahia utilizando a chave taxonômica adequada (SMITH, 1797). Em seguida, as lagartas foram armazenadas em uma vasilha contendo folhas de milho para alimentação e encaminhadas ao laboratório para criação.
As folhas de milho (Zea mays L.) coletadas pertenciam à variedade IPR 164, a qual foi plantada no início do mês de maio de 2021 exclusivamente para alimentação das lagartas em laboratório e realização dos demais ensaios descritos neste estudo. Essa variedade de milho é denominada como convencional, isto é, sem tecnologia Bt, e foi cuidada e mantida sem aplicações de pesticidas químicos ou de qualquer outra espécie a fim de evitar prejuízos ao crescimento e desenvolvimento das lagartas, ou afetar o desenvolvimento dos ensaios experimentais.
DESCRIÇÃO GRÁFICA DAS ETAPAS DE CRIAÇÃO DE LARVAS DE S. FRUGIPERDA EM LABORATÓRIO E MONITORAMENTO DO CRESCIMENTO DE FUNGOS
Foi realizado um levantamento na literatura acerca dos protocolos empregados na criação de larvas de S. frugiperda em laboratório, corroborado com os protocolos de criação estabelecidos na Fundação Bahia. A S. frugiperda foi coleta em campo na sua fase larval e foi criada em laboratório até a obtenção de adultos e, através da ovoposição deu continuidade ao ciclo de vida das lagartas, que foram criadas posteriormente por três ciclos. 
O registro fotográfico foi feito a cada três dias utilizando uma câmera fotográfica Xiaomi RediMi Note 8. A partir das informações obtidas na criação, foi construído um infográfico resumindo os dados obtidos. Com o auxílio dos programas Corel Draw Graphics suíte 2018 e o Adobe Photoshop CS4, realizou-se a integração dos elementos visuais com os textos que descreviam as respectivas etapas. 
Durante a execução dessa etapa, foi realizado o monitoramento diário do crescimento de fungos macroscopicamente constatáveis na superfície do corpo de S. frugiperda,nos substratos utilizados na alimentação (folhas de milho) e superfícies circundantes ao ambiente de criação das larvas durante um ciclo de criação em laboratório.
Afim de verificar a existência de fungos filamentosos ou leveduriformes nas estruturas de criação de S. frugiperda, três diferentes pontos do meio de criação foram amostrados por meio de esfregaços de swabs esterilizados e utilizados para inocular placas de Petri contendo meio de cultura Sabouraud (Ágar Sabouraud Dextrose, composto por 5,0g de digestão enzimática de caseína, 5,0g de digestão enzimática de tecido animal, 40,0g de dextrose e 15,0g de ágar, água destilada esterilizada q.s.p. 1000 mL) com e sem antibiótico (cefalotina a 175 µg/µL). As placas foram incubadas a 25ºC ± 2ºC e monitoradas por até 15 dias. À medida em que foi observado o crescimento macroscópico dos fungos nas placas, foi realizada a caracterização morfológica e a contagem de Unidades de Formadoras de Colônias (UFCs). 
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COMPARAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE MÉTODOS DE DESINFECÇÃO SUPERFICIAL DE FOLHAS DO MILHO (ZEA MAYS L.) DESTINADAS À ALIMENTAÇÃO DE S. FRUGIPERDA EM LABORATÓRIO
Folhas de milho foram escolhidas aleatoriamente para coleta, determinando-se uma distância mínima de um metro de uma planta para outra. Foram coletadas folhas, no mesmo estágio de desenvolvimento, do cartucho da planta de milho (Figura 04), que é o local de maior incidência da S. frugiperda. As plantas possuíam aparência saudável e sem sintomas de doenças ou deformações. Evitou-se as folhas muito próximas do solo, bem como, as folhas com aparência muito velha. Imediatamente após a coleta, as folhas foram armazenadas em sacos plásticos de primeiro uso, acondicionadas em caixas isotérmicas e encaminhadas ao Laboratório de Ensino de Engenharia de Biotecnologia nº 03, do Centro Multidisciplinar de Luís Eduardo Magalhães (CMLEM), da Universidade Federal do Oeste da Bahia (UFOB).
Figura 04 – Cartucho da planta de milho (Zea mays L.).
 
Fonte: Elaborado pelo autor (2021).
No laboratório, as folhas foram lavadas em água corrente para eliminação de quaisquer resquícios de poeira ou outras partículas superficiais que pudessem estar presentes. Em seguida, sob condições assépticas, foram fragmentadas e desinfectadas superficialmente de acordo com dois protocolos. O primeiro deles consistiu na reprodução do método corriqueiramente utilizado em laboratórios de entomologia para desinfecção superficial de folhas de milho destinadas à alimentação de lagartas, denominado como Protocolo I. O segundo foi a metodologia descrita por Gonzaga et al., 2015, com ligeiras modificações, para desinfecção superficial de folhas visando a eliminação integral de microrganismos epifíticos, denominado como Protocolo II.
No protocolo I, fragmentos de oito folhas foram imersos individualmente em água destilada esterilizada (100 mL) contendo 5% de hipoclorito de sódio (2,0% - 2,5% de cloro ativo) e 1,0 mL de detergente neutro por 5 min. Em seguida, os fragmentados foram lavados com água destilada esterilizada (fragmentos de quatro folhas) e não esterilizada (fragmentos de quatro folhas). No protocolo II, fragmentos de oito folhas foram imersos em solução de etanol a 70% (100 mL) por 1 min, seguido por uma solução de hipoclorito de sódio contendo de 2,0 – 2,5% de cloro ativo (100 mL) por 4 min, e finalmente a uma solução de etanol a 70% por 30s (100 mL). Por último, os fragmentos foram lavados três vezes em água destilada esterilizada por 2 min. 
Em seguida, foi realizado imprinting individualizado dos fragmentados foliares desinfectados em placas de Petri (90 mm) contendo meio de cultura Sabouraud com ou sem cefalotina a 175 µg/µL. Além disso, 100 µL da água utilizada na última lavagem dos fragmentados foram inoculados, em triplicata, na superfície de uma placa de Petri contendo o mesmo meio de cultura supramencionado. Todas as placas foram incubadas a 25ºC ± 2ºC e monitoras por até 15 dias para acompanhamento do crescimento de microrganismos. A presença ou ausência de fungos e/ou bactérias definiram se o método de desinfecção pode ser considerado eficiente ou não.
Dado que a concentração e/ou tempo de exposição dos reagentes no protocolo II foi superior ao protocolo I, foi verificado se o Protocolo II era capaz de afetar a microbiota endofítica, fragmentos das folhas de milho foram inoculados em placas de Petri com 90 mm de diâmetro contendo o meio de cultura Sabouraud suplementado com cefalotina 175 µg/ µL para inibir o crescimento bacteriano. As placas forma incubadas (25ºC ± 2ºC) e monitoradas por até 15 dias.
ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DE FUNGOS ASSOCIADOS AO CORPO DE S. FRUGIPERDA
Para o isolamento da microbiota fúngica da superfície de S. frugiperda, foram amostradas dez lagartas com 20 dias de criação, todas com aspecto saudável, ativas e com medidas corporais visualmente compatíveis com o tempo de crescimento delas. Individualmente e, sob condições assépticas, um swab esterilizado foi suavemente encostado em toda a superfície do inseto e, em seguida, utilizado para inocular placas de Petri, de 90 mm de diâmetro, contendo meio de cultura Sabouraud com cefalotina a 175 µg/µL. As placas foram incubadas a 25ºC ± 2ºC e monitoradas por até 15 dias. À medida em que fungos filamentosos ou leveduriformes foram crescendo, foi realizada a repicagem, caracterização morfológica e contagem de UFCs.
4.4.1 Conservação dos fungos
Os fungos filamentosos foram conservados utilizando o método de Castellani (CASTELLANI, 1939) em triplicata. Trata-se de uma técnica simples, econômica e segura, na qual os fungos são armazenados em água destilada estéril, que garante o armazenamento dos fungos por um período de cerca de 10 anos. 
As leveduras obtidas foram conservadas em meio GYP (2% de glicose, 1% de extrato de levedura e 0,5% de peptona) acrescido de Glicerol (15%) (SPENCER; SPENCER, 1996). Sob condições assépticas, 1,0 mL de meio GYP foi transferido para microtubos de 1,5 mL no qual as leveduras foram armazenadas, logo em seguida, com o auxílio da alça de platina. Cada isolado foi transferido para um microtubo. O processo foi realizado em triplicata, e as leveduras foram armazenadas sob refrigeração em uma caixa de criopreservação. 
4.4.2 Caracterização macromorfológica dos fungos
Todas as colônias fúngicas que cresceram no meio de cultura foram caracterizadas morfologicamente e agrupadas em tipos morfológicos (morfotipos). A determinação do morfotipo foi realizada de acordo com os critérios propostos por Lacap et al. (2003) e Ibrahim et al. (2017), o que inclui a taxa de crescimento, forma e coloração da colônia. Para evitar problemas de subjetividade na determinação de cores, foram realizados registros fotográficos e as cores do anverso e reverso foram definidas através das escalas de cores RGB, abreviatura do sistema de cores formado por Red (vermelho), Green (verde) e Blue (azul), utilizado na reprodução de cores em aparelhos eletrônicos. O sistema RGB define uma cor utilizando um código composto por três valores, atribuindo a proporção correspondente de cada cor, com valor mínimo de 0 e máximo de 255. Na caracterização (https://www.site24x7.com/pt/tools/seletor-de-codigo-cor.html), as colônias que tiveram códigos iguais ou bastante próximos foram consideradas como sendo da mesma cor. 
Os fungos filamentosos mais frequentes foram caracterizados microscopicamente por meio da técnica de microcultivo (RIDDELL, 1950), a qual consiste no cultivo do fungo em pequenos pedaços de meio de cultura, entre lâmina e lamínula, onde o crescimento do fungo se expande e fixa na porção inferior da lamínula, que quando retirada com cuidado mantém intactas as estruturas importantes para a taxonomia, possibilitando sua visualização em microscópio.
4.4.3 Análises estatísticas da comunidade fúngica associada a S. frugiperda
A análise estatística da comunidade fúngica associada a S. frugiperda foi baseada em Krebs (1978) e Ludwig et al. (1988). A ocorrência de fungos (filamentosos e leveduriformes) associados a S. frugiperda foi expressada pelaquantidade de UFCs por hospedeiro. As UFCs de cada hospedeiro foram caracterizadas morfologicamente e agrupadas em morfoespécies. As morfoespécies de diferentes hospedeiros foram agrupadas em morfotipos. A frequência de ocorrência (Fo) de morfotipos foi calculada como a porcentagem de lagartas em que determinado morfotipo foi encontrado em relação ao total de lagartas amostras. A constância de qualquer morfotipo (x) foi baseada nos dados de Fo e corresponde à porcentagem de amostras nas quais o morfotipo x estava presente. Morfotipos foram classificados como constantes quando presentes em >50% das amostras; acessórios quando presentes em 25–50% das amostras e, acidentais quando presentes em menos de 25% das amostras.
TRIAGEM PARA ATIVIDADE INSETICIDA CONTRA S. FRUGIPERDA 
Representantes dos três morfotipos associados ao corpo das lagartas com maior frequência de ocorrência (Fo) foram utilizados no ensaio de triagem para atividade inseticida contra S. frugiperda.
4.5.1 Obtenção do líquido metabólico
O líquido contendo metabólitos fúngicos foi obtido seguindo a metodologia proposta por Souza et al. (2004), com ligeiras modificações. Após 8 dias de cultivo, foram obtidos discos da colônia (de fungo filamentoso ou leveduriforme) com 6 x 6 mm para fermentação em 20 ml de GYP. Os meios de cultura inoculados com os fungos foram incubados em uma plataforma Shaker (Luca – 222), a 25 ºC, a 120 r.p.m. A incubação ocorreu por cinco dias para leveduras e oito dias para fungos filamentosos. Após esse período, a massa celular foi separada do meio metabólico por centrifugação em uma centrifuga refrigerada (SL – 706) por 20 min a 3500 r.p.m., seguido de filtração à vácuo do líquido metabólico em papel filtro qualitativo 80g. Sob condições estéreis, o líquido foi novamente filtrado em um filtro de seringa com poros de 0,45 µm e armazenado a 4 ºC para posterior realização do ensaio com as lagartas. 
4.5.2 Ensaio para atividade inseticida
As lagartas empregadas foram criadas em laboratório e utilizadas no ensaio após três dias de eclosão. Os líquidos metabólicos obtidos foram utilizados para imersão de três folhas de milho (repetição), previamente desinfectadas com o mesmo método utilizado no tópico 4.3 para eliminação de fungos epifíticos (protocolo II). Cada folha ficou submersa por 30s em cada líquido metabólico (chamado de tratamento). Em seguida, as folhas foram retiradas e secas em temperatura ambiente. Posteriormente as folhas de milho tratadas foram transferidas para outras placas de Petri estéreis e, em seguida, foram transferidas dez lagartas para cada placa. Como controle negativo, lagartas foram expostas a folhas de milho imersas no meio de cultura sem fungos inoculados. 
O ensaio foi monitorado diariamente e a taxa de mortalidade foi determinada com 72 h após a exposição aos metabolitos. O critério para avaliação foi a coordenação motora da lagarta, sendo que a mesma foi considerada morta quando observada a ausência de movimentos. Foi utilizado um pincel com cerdas macias para estimular a lagarta a se movimentar, tocando-se levemente em sua porção posterior (OLIVEIRA; NUNES, 2017).
A fim de determinar a toxicidade (ação inseticida dos líquidos metabólicos) foi utilizada a seguinte classificação qualitativa, proposta por Vasilio (2006), a qual é relacionada à taxa de mortalidade das lagartas:
· Taxa de mortalidade > 50% = Tóxicas;
· Taxa de mortalidade entre 10 – 50% = Com indícios de toxicidade;
· Taxa de mortalidade < 10% = Sem indício de toxicidade.
RESULTADOS
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DESCRIÇÃO GRÁFICA DAS ETAPAS DE CRIAÇÃO DE LARVAS DE S. FRUGIPERDA EM LABORATÓRIO E MONITORAMENTO DO CRESCIMENTO DE FUNGOS
As etapas da criação de larvas de S. frugiperda desde a coleta em campo até a eclosão (obtenção de insetos adultos) estão descritas na Figura 05, que consiste em um infográfico. Adicionalmente, ilustrações autorais de cada etapa podem ser visualizadas no apêndice I.
Figura 05 – Etapas de criação de S. frugiperda.
Fonte: Elaborado pelo Autor (2021).
Com relação ao monitoramento diário das lagartas em crescimento, dos substratos utilizados para alimentação das mesmas (folhas de milho) e das superfícies circundantes, não foi observado o crescimento de fungos de forma macroscopicamente constatável. Contudo, ao realizar esfregaços com swabs nas superfícies circundantes à lagarta, foi observado o crescimento de fungos filamentosos (2,0 UFCs/ponto amostrado), leveduras (incontáveis UFCs) e bactérias (incontáveis UFCs). 
AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DOS MÉTODOS DE DESINFECÇÃO SUPERFICIAL DAS FOLHAS DE MILHO
O método de desinfecção do protocolo I foi considerado ineficiente para desinfecção de microrganismos epifíticos, uma vez que foi observado o crescimento de diversos microrganismos (fungos filamentosos, leveduras e bactérias), constatando que o este método não é suficiente para garantir a desinfecção do material utilizado na alimentação de S. frugiperda, ao passo que o protocolo II é eficiente, uma vez que não ocorreu crescimento de quaisquer microrganismos após a desinfecção.
Com relação à avaliação do impacto do protocolo II na microbiota endofítica, foi verificada baixa riqueza e abundância de fungos. Do total de fragmentados inoculados, cresceram apenas 2,0 UFC de fungos leveduriformes e 1,0 UFC de fungo filamentoso.
FUNGOS FILAMENTOSOS E LEVEDURIFORMES ASSOCIADOS AO CORPO S. FRUGIPERDA
No presente estudo, fungos foram obtidos de forma bastante frequente a partir da superfície de S. frugiperda, uma vez que 100,0% (n = 10/10) das lagartas amostradas possuíam pelo menos uma UFC de fungo filamentoso ou levedura, 90,0 % (n = 9/10) possuíam pelo menos uma UFC de fungo filamentoso, 90,0% (n= 9/10) possuíam pelo menos uma UFC de levedura e 80,0% delas (n = 8/10) possuíam simultaneamente UFCs de fungos filamentosos e leveduriformes (Tabela 01).
Tabela 01 – Unidades Formadoras de Colônia (UFCs) e morfoespécies de fungos filamentosos e leveduras por lagarta amostrada.
	Hospedeiros
	UFCs de Fungos Filamentosos
	UFCs de Leveduras
	Morfoespécies de 
Fungos Filamentosos / hospedeiro
	Morfoespécies de leveduras / hospedeiro
	Lagarta 01
	4,6 x 101
	1,1 x 101
	3,0
	2,0
	Lagarta 02
	2,0 x 100
	1,0 x 100
	1,0
	1,0
	Lagarta 03
	1,4 x 101
	2,0 x 100
	3,0
	1,0
	Lagarta 04
	-
	4,0 x 100
	-
	2,0
	Lagarta 05
	1,1 x 101
	4,0 x 100
	2,0
	2,0
	Lagarta 06
	5,2 x 101
	2,0 x 100
	2,0
	1,0
	Lagarta 07
	1,4 x 101
	-
	2,0
	-
	Lagarta 08
	3,9 x 101
	1,0 x 100
	2,0
	1,0
	Lagarta 09
	9,4 x 101
	1,4 x 101
	2,0
	2,0
	Lagarta 10
	7,8 x 101
	1,1 x 101
	2,0
	2,0
	TOTAL
	3,5 x 102
	5,0 x 101
	19,0
	14,0
	MÉDIA
	3,5 x 101
	5,0 x 100
	1,9
	1,4
	Com relação ao tamanho populacional, expresso como UFC/lagarta, verificou-se maior ocorrência de fungos filamentosos (média ± desvio padrão = 3,5 x 101 ± 3,2 x 101 UFC/lagarta) do que de leveduras (5,0 x 100 ± 5,1 x 100 UFC/lagarta). 
	Um total de 33 morfoespécies de fungos (filamentosos ou leveduriformes) foi obtido a partir das lagartas amostradas. Deste total, 19 foram de fungos filamentosos (média ± desvio padrão por lagarta = 1,9 ± 0,9; mediana = 2,0) e 14 leveduriformes (média ± desvio padrão por lagarta = 1,4 ± 0,7; mediana = 1,5). 
	Após a caracterização e comparação das morfoespécies, foi possível agrupá-las em quatro morfotipos de fungos filamentosos (denominados de F1 a F4) e quatro de leveduras (L1 a L4) (Tabela 02). Detalhes da macromorfologia dos morfotipos podem ser verificados no Apêndice II.
Tabela 02 – Caracterização macromorfológica dos fungos filamentosos e das leveduras isoladas.
	Morfotipo
	Caracterização macromorfológica
	Total de isolados (morfoespécies)
	Fo
	%
	
	Código RGB reverso/ Código RGB anverso/ aspecto da borda/ outras características relevantes
	
	
	
	F1
	(208, 179, 109) / (216, 204, 162) / Irregular/ Parte aérea alta
	3
	0,157
	15,7
	F2
	(039, 042, 049) / (089, 083, 067) / Regular cor branca / Parte aérea aveludada musgosa
	7
	0,368
	36,8
	F3
	(188, 109, 37) / (175, 156, 155) / Regular tons mais claros / Parte aérea cotonosa alta
	8
	0,421
	42,1
	F4(197, 159, 52) / (196, 191, 185) / Irregular / Parte aérea alta; Centro do fungo esverdeado
	1
	0,052
	5,2
	L1
	(203, 191, 169) / (216, 210, 210) / Regular/ Aspecto opaca e cremosa
	8
	0,571
	57,1
	L2
	(179, 169, 144) / (241, 234, 226) / Irregular / Aspecto opaca, textura rugosa (lembra flocos de neve)
	3
	0,214
	21,4
	L3
	(173, 159, 118) / (180, 163, 135) / Regular/ Aspecto brilhosa e cremosa
	2
	0,142
	14,2
	L4
	(218, 151, 135) / (212, 107, 116) / Regular / Aspecto brilhosa e viscosa
	1
	0,071
	7,1
Abreviações: F – Fungo filamentoso; L – levedura, Fo = frequência de ocorrência.
Os morfotipos de fungos filamentosos com maior Fo foram F3 (42,1%) seguido de F2 (36,8%). Com relação às leveduras, o morfotipo mais frequente foi o L1 (57,1%), seguido de L2. Com relação à constância, os morfotipos F2 e F3 podem ser classificados como acessórios, enquanto que F1 e F4 como acidentais. No que diz respeito aos morfotipos leveduras, L1 pode ser classificado como constante e todos os demais como acidentais.
Com relação à micromorfologia e elucidação taxonômica dos morfotipos, foi realizado o microcultivo dos dois morfotipos de fungos filamentosos mais frequentes (Figura 6). 
Figura 06 – Caracterização macromorfologia e micromorfologia dos fungos filamentosos mais frequentemente isolados.
 (
C
) (
B
) (
A
)
 (
F
) (
E
) (
D
)
A – anverso F2; B – reverso F2; C – microscopia F2; D – anverso F3; E – reverso F3; F – microscopia F3. Todas as fotomicrografias estão reproduzidas com escala de 20 µm.
O morfotipo F2 foi identificado como Cladosporium sp., baseado na caracterização realizada por Guimarães e Carvalho (2014), enquanto que o F3 não pode ser identificado pelos métodos aqui empregados e requer o emprego de ferramentas de taxonomia molecular para sua elucidação.
Com relação às leveduras, após análise das características macro e micromorfológicas, apenas a levedura L4 pode ser identificada como pertencente ao gênero Rhodotorula (cf.) sp. Harrison (1927), ao passo que as demais também requerem o emprego de ferramentas moleculares de taxonomia.
TRIAGEM PARA ATIVIDADE INSETICIDA CONTRA S. FRUGIPERDA 
Um representante dos morfotipos F2, F3 e L1, que foram os mais frequentemente isolados, foram utilizados no ensaio de atividade inseticida e, os resultados da ação de cada fungo podem ser observados na Tabela 03. Ilustrações de demonstrando o passo a passo do ensaio podem ser observadas no apêndice III.
Tabela 03 – Bioensaio de atividade inseticida contra S. frugiperda.
	Tratamento/
Repetição
	Controle
	F2
	F3
	L1
	
	T
	M
	T
	M
	T
	M
	T
	M
	1
	10
	1
	9
	2
	8
	-
	10
	-
	2
	8
	-
	8
	4
	7
	-
	6
	-
	3
	8
	1
	10
	2
	8
	1
	9
	-
	Total
	26
	2
	27
	8
	23
	1
	25
	-
	Taxa de mortalidade 
	7,7 %
	29,6 %
	4,3 %
	-
T – Total de lagartas na placa de Petri; M – Número de lagartas mortas.
Por meio dos critérios de classificação estabelecidos, os morfotipos F3 e L1 foram considerados sem indícios de toxicidade e F2 com indícios de toxicidade.
DISCUSSÃO 
Neste estudo foi avaliado a interação de S. frugiperda com fungos. As larvas foram coletadas em campo e criadas em laboratório. Um ciclo completo de criação durou pouco mais que 30 dias e, o monitoramento foi eficiente para manutenção e criação de lagartas saudáveis e viáveis para realização do ensaio de toxicidade, corroborando a importância fundamental da criação de insetos para ensaios biotecnológicos relacionados com o desenvolvimento de bioinseticidas (BARROS et al., 2010; TRUZI, 2020). Grande parte dos estudos que envolvem a criação S. frugiperda utilizam dieta artificial para manutenção das larvas (NICULAU et al., 2013) é importante destacar que neste estudo foi utilizada uma dieta natural a base de folhas de milho, o que reproduz melhor as condições as quais essa espécie é submetida a alimentação em campo.
 No tocante à criação dos insetos em laboratório, é fundamental importância garantir uma nutrição apropriada aos mesmos. Aqui, avaliou-se duas metodologias de desinfecção superficial de folhas utilizadas para alimentação das larvas. O protocolo I de desinfecção utilizado, embora seja comum em laboratórios de entomologia, não é suficiente para garantir a eliminação de microrganismos epifíticos, uma vez que foi observado o crescimento de incontáveis UFCs de fungos filamentosos, leveduras ou bactérias, por outro lado, o protocolo II mostrou-se efetivo. Os fungos presentes no ambiente podem ser patogênicos aos insetos, segundo Alves (1998), o primeiro patógeno associado a inseto notificado, foi um fungo do gênero Cordyceps, que infectou um lepidóptero e foi relatado por Réamur no ano de 1726. Para além disso fungos do gênero Apergillus são apontados como patogênicos para gafanhotos (ZHANG et al., 2015), o que corrobora com a necessidade de um método de eliminação eficiente. 
Propusemos nos métodos a averiguação da interferência do protocolo II no crescimento de microrganismos endofíticos. Foi constatado que o mesmo é eficiente para desinfecção superficial, porém também pode ser considerado agressivo para obtenção de microrganismos endofíticos, visto que foram obtidos apenas dois fungos leveduriformes e um fungo filamentoso a partir dos fragmentos das folhas de milho. O tempo de exposição das folhas de milho aos desinfetantes utilizados no protocolo II também é um ponto a ser avaliado. Russo et al. (2016) utilizou como desinfecção para isolamento de endofíticos das folhas de milho um protocolo semelhante, contudo a imersão das folhas, ocorrem em 1 min em solução de etanol 70% e 4 min em uma solução de hipoclorito de sódio com 3% de cloro ativo. 
A baixa frequência de isolamento pode estar associada a ordem de obtenção dos fragmentos. No protocolo II as folhas foram fragmentadas e depois submetidas a desinfecção ao passo que na metodologia adotada por Russo et al. (2016) a obtenção dos fragmentos é realizada após a desinfecção da folha, isso sugere que a fragmentação previa pode exterminar a microbiota no interior da folha, enquanto que a fragmentação após a desinfecção expões os microrganismos presentes, assim foi possível isolar um total sete espécies de fungos endofíticos em folhas de milho, corroborando com a hipótese de que a ordem e o tempo de exposição influenciam na obtenção desses microrganismos.
O protocolo I, onde as soluções desinfetantes estão bastante diluídas, mostrou-se ineficiente e, o protocolo II foi agressivo até mesmo para a microbiota endofítica, a qual pode ser de interesse para a nutrição do inseto. Novos estudos devem ser conduzidos visando determinar a concentração ideal dos desinfetantes, de modo a garantir a eliminação de fungos epifíticos e patogênicos em potencial, sem comprometer, contudo, a microbiota endofítica.
No que concerne aos fungos isolados das lagartas e seu ambiente de criação, foram agrupados oito morfotipos incluído fungos filamentosos e leveduriformes. O morfotipo F2 foi identificado como Cladosporium sp., este por sua vez foi isolado por Pan et al. (2008), em folhas de milho em Minnesota, EUA, além de ser um fungo endofítico comum em folhas e caules de soja cultivada no Brasil (IMPULLITTI; MALVICK, 2013).
O gênero Cladosporium foi associado por Belmont-Montefusco et al. (2020) a larvas de Stenochironomus como agentes capazes de realizar a degradação de celulose em meio sólido, revelando o potencial dessa linhagem para produção de enzimas do complexo celulósico. O morfotipo L4 por suas características foi identificada como Rhodotorula (cf.) sp. Segundo Meireles et al. (2018), essa levedura já foi associada ao microambiente do ninho das abelhas Melipona interrupta e Cephalotrigona femorata,
Estudos relatados por Witzgall et al. (2012) indicam que essa levedura está associada a larva da mariposa Cydia pomonella (Tortricidae, Lepidoptera), também conhecida como verme da maçã. Análises comportamentais e químicas indicam que as mariposas sentem e respondem ao aroma das leveduras presentes. As respostas olfativas indicam fortemente o papel da contribuição da levedura na descoberta do hospedeiro.O estudo dos microrganismos associados a insetos, são importantes no impacto que eles podem causar na ecologia e nas possíveis contribuições que medeiam a descoberta e o reconhecimento desses organismos no âmbito biotecnológico. 
O conhecimento das interações entre leveduras e insetos podem ser exploradas em vários aspectos. As leveduras isoladas das lavas, convivem de forma mutualista, e apresentam uma grande relevância biotecnológica para região. Knight e Witzgall (2013) propuseram a utilização desses microrganismos como um controle biológico da mariposa Cydia pomonella, praga conhecida da macieira, eles combinaram um granulovírus patógeno com leveduras isoladas das larvas, como resultado, essa combinação levou a um aumento significativo da mortalidade de insetos neonatos quando comparado a utilização do vírus sozinho.
Podemos citar ainda a associação de leveduras e Drosophila, estudada por Murphy et al. (2016), utilizando a interferência de RNA, células de S. cerevisiae geneticamente modificadas para expressar um dsDNA foram capazes de alterar a locomoção e a sobrevivência em larvas de Drosophila, reduzindo a aptidão do inseto. Essa abordagem traz à tona o potencial das leveduras como agentes de biocontrole, que podem ser explorados no controle dos mais diversos insetos-pragas incluindo a lagarta-do-cartucho.
É improvável descobrir todas a interações possíveis entre insetos e leveduras, porém uma melhor compreensão das relações já conhecidas, ampliam a gama de benefícios e vantagens que podem ser exploradas. A avaliação de novas espécies e o conhecimento da biodiversidade contribuem para o preenchimento da lacuna existente nessa linha, colaborando com a expansão e as particularidades da pesquisa local.
Triagens de atividades inseticidas contra S. frugiperda envolvendo extratos de fungos são escassos na literatura, em sua maioria esses estudos são descritos utilizando óleos essenciais ou extratos vegetais como proposto por Niculau et al. (2013) e Tagliari et al. (2020) respectivamente, o que torna os resultados aqui obtidos de grande valia não apenas para pesquisa local como também para o âmbito nacional.
O ensaio realizado demonstrou que os morfotipos F3 e L1 não possuem indícios de toxicidade, visto que a taxa de mortalidade foi muito baixa, e considerando que até 10% de mortalidade é aceitável nas lagartas de controle, essa porcentagem é insignificante no que diz respeito a capacidade inseticida desses isolados. Todavia o fungo F2 apresentou como resultado, indícios de toxicidade, o que o torna significativo do ponto de vista biotecnológico, uma vez que se trata de um ensaio de triagem que visou indicar linhagens com potencial de uso biotecnológico. A concentração e o tempo de exposição utilizados neste estudo podem ter influenciado no ensaio. Zhang et al. (2015) relataram que as doses utilizadas nos bioensaios por eles realizados influenciaram diretamente nas taxas de mortalidade, o que sugere a necessidade de uma otimização da metodologia adotada na triagem.
Novos ensaios podem ser estabelecidos e extratos brutos concentrados de metabólitos de Cladosporium sp. F2 podem ser obtidos visando a reavaliação da toxicidade por meio da metodologia realizada no presente estudo. Adicionalmente, pode ser realizada a avaliação da toxicidade aguda, tal como proposto no bioensaio realizado por Lima et al. (2009), em que a avaliação da toxicidade é realizada em um intervalo de 96 h após a aplicação, além de ser observado os sintomas de neurotoxicidade através do efeito knock-down (efeito imediato dos extratos sobre as lagartas).
Embora um morfotipo não seja uma relação perfeita com espécies taxonômicas, alta riqueza de morfotipos indica potencial alta riqueza de espécies associadas ao hospedeiro. No caso da microbiota fúngica associada à superfície corpórea de S. frugiperda, trata-se de uma comunidade pouco rica, porém bastante abundante, a qual pode e deve ser investigada quantos aos papéis ecológicos exercidos, que potencialmente trazem benefícios à saúde do hospedeiro, tal como relata a literatura sobre fungos associados a insetos (GANTER, 2006; DOUGLAS et al., 2015; MELO et al., 2019; SANTOS et al., 2019). Tais papéis podem fornecer insights para o desenvolvimento de produtos e/ou processos de interesse biotecnológico que podem ir além da atividade inseticida, como a produção de enzimas, antimicrobianos e outros compostos de interesse para a humanidade. 
Apesar da baixa toxicidade, o fungo Cladosporium sp., representante do morfotipo F2, pode ser considerado como um bom candidato a ser explorado na perspectiva de obtenção de produtos biotecnológicos de interesse para a agricultura. Estudos complementares futuros devem ser conduzidos visando caracterizar quantitativamente a atividade inseticida de metabólitos desse fungo contra S. frugiperda, bem como elucidar o(s) composto(s) responsáveis por essa atividade
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