Técnicas de estudo de proteoma_Grazielle SLIDE 7

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BIOLOGIA MOLECULAR 
Prof. Grazielle Ribeiro - Departamento de Bioquímica e Imunologia - UFMG 
Técnicas de estudo de proteoma 
Durante o curso vimos que é possível realizar medidas de presença e abundancia 
de moléculas de mRNA e deste modo realizar inferências sobre a presença de 
proteínas que são os verdadeiros efetores da maioria dos processos celulares. 
 
Entretanto existem mecanismos pós-transcrionais que podem afetar o nível de 
proteínas e que não são levados em conta quando medimos o nível de mRNAs 
 
Os dados de mRNA dão indicação de presença de uma proteína, mas não dão 
nenhuma informação sobre a localização da proteína dentro da celula. 
Genoma 
? 
Lições sobre os Projetos genômicos 
• A complexidade evolucionária não é primariamente determinada pelo maior 
número de genes, mas sim pela variação do número de proteínas 
sintetizadas. 
 
• Isso é alcançado pela geração de múltiplas proteínas a partir de um único 
gene, como por exemplo: 
– Diferentes combinações de exons por splicing alternativo 
– Processamento pós-traducional (ex, clivagem de pró-peptídeos) 
– Modificações pós-traducionais (ex acetilação, glicosilação) 
– Modificações no dogma central: DNA --> RNA --> proteína(s) 
– É importante então realisar análises a partir dos PRODUTOS do gene, e 
não tanto dele mesmo. 
 
Era “Pós-Genômica” 
• GENOMA – DNA – 3,4 bilhões de nt 
• TRANSCRIPTOMA – mRNA – 30 mil genes 
• PROTEOMA – Proteínas – 0,3-1,2 milhão proteínas 
 Homo sapiens Modificações pós-
traducionais? 
Interações entre 
proteínas? 
Proteoma: Proteínas expressas pelo genoma 
Proteômica 
 “Identificação, caracterização e quantificação de todas as 
proteínas envolvidas em uma cadeia particular, organela, 
célula, tecido, órgão ou organismo que pode ser estudado 
com o objetivo de fornecer dados confiáveis para o 
entendimento de determinado sistema.” 
 
 
Genômica DNA (Gene) 
Genômica 
Funcional 
Transcriptômica RNA 
Proteômica PROTEÍNA 
Metabolômica METABÓLITOS 
Transcrição 
Tradução 
Reação 
enzimática 
A nomenclatura ômica… 
Como reconhecemos a proteína que procuramos? 
Capacidade de 
absorção de luz 
Qual componente da 
célula é mais rico da 
proteína de interesse? 
Purificação de proteínas: Solubilidade, Tamanho, Carga 
e Afinidade de Ligação 
Salting Out  A maioria das proteínas é menos solúvel em altas concentrações 
de sais. A concentração de sal em que uma proteína precipita difere de uma para 
outra. 
 
Diálise  Remover sal e outros 
componentes de baixo PM 
 
As proteínas são retidas 
dentro do saco de diálise 
Cromatografia de Filtração em Gel 
Cromatografia de Troca Iônica Cromatografia de Afinidade 
Cromatografia Líquida de alta pressão  HPLC 
Os materiais da coluna são bem mais finamente divididos  Há mais 
pontos de interação e assim, maior poder de resolução. 
Eletroforese em Gel 
• SDS rompe ligações não covalentes  carga 
negativa 
• O complexo SDS-proteína desnaturada tem carga 
negativa e se move de acordo com a massa. 
• Carga da proteína nativa se torna insignificante 
Eletroforese em Gel 
• SDS rompe ligações não covalentes  carga 
negativa 
• O complexo SDS-proteína desnaturada tem carga 
negativa e se move de acordo com a massa. 
• Carga da proteína nativa se torna insignificante 
Focalização isoelétrica 
Ponto isoelétrico (pI)  é o pH no qual seu balanço de cargas é zero 
Um gradiente de pH é estabelicido no gel antes de ser colocada a amostra. 
Eletroforese bidimensional 
Focalização isoelétrica + SDS-PAGE  Separação com alta resolução 
Eletroforese bidimensional 
Focalização isoelétrica + SDS-PAGE  Separação com alta resolução 
Proteoma Comparativo ou Diferencial 
Sobreposição permite identificar diferenças nos padrões de bandas 
Cada ponto representa uma diferente proteína que possui PI e peso 
molecular determinados 
Proteína Purificada… E a sequência de aminoácidos? 
Composição de AA: primeira etapa de seqüenciamento 
Degradação de Edman 
Identificar o aminoácido amino-terminal e clivá-lo sem romper a ligação 
peptídica entre os outros aminoácidos 
Remoção de um aminoácido de 
cada vez, formando um derivado 
com o radical feniltiocarbamil 
Proteínas são clivadas em 
peptídeos para facilitar as análises 
Degradação de Edman 
Identificar o aminoácido amino-terminal e clivá-lo sem romper a ligação 
peptídica entre os outros aminoácidos 
Remoção de um aminoácido de 
cada vez, formando um derivado 
com o radical feniltiocarbamil 
Matrix-assisted laser desorption-ionization (MALDI) 
Time of flight (TOF) 
Espectrometria de massa 
• Moléculas dos peptídeos são ionizadas utilizando diferentes métodos 
• Moléculas ionizadas são aceleradas e diferentes métodos 
espectrometricos podem ser utilizados para medida da sua massa 
Como funciona o sequenciamento de 
proteínas 
• Tandem MS: dois analisadores de massa 
em série com uma célula de colisão no 
meio 
 
• Célula de colisão: um local aonde os 
íons colidem com um gás (He, Ne, Ar) 
resultando em fragmentação do íon 
 
• A fragmentação dos petídeos na células 
de colisão ocorre de maneira predizível, 
principalmente nas ligações peptídicas 
 
• Os íons resultantes tem massas que são 
consistentes com uma database de pesos 
moleculares de dipeptídeos, tripeptídeos, 
tetrapeptídeos... 
Ser-Glu-Leu-Ile-Arg-Trp 
Célula de colisão 
Ser-Glu-Leu-Ile-Arg 
Ser-Glu-Leu 
Ser-Glu-Leu-Ile 
Etc… 
Identificação de proteínas por MS 
Espectro 
artificial 
Tripsinizado 
artificialmente 
Database de 
sequências 
(ex. SwissProt) 
Spot removido 
do gel 
Fragmentação 
com tripsina 
Espectro dos 
Fragmentos 
MATCH 
L
ib
ra
ry
 
Figure 4.17. MALDI-TOF Mass Spectrum of Insulin and b -lactoglobulin. A mixture of 5 pmol 
each of insulin (I) and b-lactoglobulin (L) was ionized by MALDI, which produces predominately 
singly charged molecular ions from peptides and proteins (I + H+ for insulin and L + H+ for 
lactoglobulin). However, molecules with multiple charges as well as small quantities of a singly 
charged dimer of insulin, (2 I + H)+, also are produced. 
Bom e... barato 
5 pmol de mistura I + L 
2D del>>>PM de fragmentos + PM frags bioinformático = 80% 
• Uma analise em larga escala do proteoma de um organismo pode gerar entre 
centenas e milhares de espectros de massa. 
 
• Deste modo são necessárias ferramentas que permitam a interpretação e 
integração destes dados 
 
• Programas do espectrômetro de massa já analisam o espectro e fornecem uma 
lista de valores que correspondem a massa apurada para cada íon 
 
• Programas adicionais irão utilizar estas listas para procurar padrões 
semelhantes em bancos de espectros teóricos formados a partir de bancos de 
dados de proteínas 
Busca em banco de dados 
Conformação de proteínas  Cristalografia com raios X 
Figure 4.51. Myoglobin 
Crystal and X-Ray. (A) 
Crystal of myoglobin. (B) X-
ray precession photograph of 
a myoglobin crystal. 
Figure 4.52. Section of the Electron-Density Map of 
Myoglobin. This section of the electron-density map shows 
the heme group. The peak of the center of this section 
corresponds to the position of the iron atom. 
Anticorpos para o estudo de proteínas 
Preparação de anticorpos 
monoclonais 
Proteínas podem ser detectadas e medidas pelo Ensaio 
com Imuno-Adsorvente Ligado a Enzima 
Utiliza uma enzima, ligada a um anticorpo específico, que reage com um 
substrato incolor, gerando um produto corado. 
Western Blotting 
Figure 4.40. Vasopressin and Synthetic Vasopressin. Structural formulas of (A) vasopressin, a 
peptide hormone that stimulates water resorption, and (B) 1-desamino-8-d-arginine vasopressin, a 
more stable synthetic analog of this antidiuretic hormone. 
É caro mas pode! 
(síntese de peptídeos) 
>>>ANTÍGENO! 
>>>DROGA 
Figure 4.41. Amino Acid Activation. Dicyclohexylcarbodiimide is 
used to activatecarboxyl groups for the formation of peptide bonds. 
Figure 4.42. Solid-Phase 
Peptide Synthesis. The 
sequence of steps in solid-
phase synthesis is: (1) 
anchoring of the C-terminal 
amino acid, (2) deprotection of 
the amino terminus, and (3) 
coupling of the next residue. 
Steps 2 and 3 are repeated for 
each added amino acid. Finally, 
in step 4, the completed 
peptide is released from the 
resin. 
Síntese em fase sólida 
Aplicações da bioinformática 
Análise de 
estruturas 
Análise de 
sequências 
Análise de 
funções 
Predição de 
estruturas de 
proteínas 
Classificação da 
estrutura de 
proteínas 
Comparação da 
estrutura de 
proteínas 
Predição de 
estruturas de 
ácidos nucléicos 
Comparação de 
genomas 
Busca em bancos 
de dados 
Alinhamento de 
sequências 
Predição de genes 
e promotores 
Filogenia 
 
 
Modelamento de 
caminhos 
metabólicos 
Expressão de 
genes 
Predição de 
interação entre 
proteínas 
Predição da 
localização 
subcelular de 
proteínas 
Desenvolvimento de software e 
criação de bancos de dados 
Aplicações biotecnológicas - Desenvolvimento de fármacos 
• Identificação do gene de interesse 
• Identificação da proteína 
• Expressão recombinante da 
proteína 
• Cristalização da proteína 
• Submissão do cristal à linha de 
raios-X 
• Obtenção da estrutura 3D da 
proteína 
• Desenho racional de novos 
compostos moduladores da 
proteína-alvo 
Paradigma contemporâneo para o desenvolvimento 
de novos fármacos: 
Desenvolvimento de drogas 
1. Isolar 1 alvo => Receptor 
Analisar sua estrutura 3D 
2. Selecionar um conjunto de 
candidatos => Ligantes 
Testar interação com receptor 
3. Ligantes com melhor resultado 
são experimentalmente 
sintetizados e testados 
4. Baseado nos resultados dos 
experimentos: Produzir o 
medicamento ou retornar ao passo 1 
Exemplo do processo de drug design. 
Da jararaca ao Captopril 
Classe: Fatores potencializadores de Bradicinina (ação hipotensora) 
ACEN: E.C.3.4.15.1