TÉCNICAS DE IMUNODIAGNÓSTICO

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TÉCNICAS DE 
 IMUNODIAGNÓSTICO 
 -respostas imunes são úteis de dois modos para diagnosticar uma doença. 
 1. anticorpos específicos podem ser utilizados para detectar ou identificar um 
 antígeno de interesse . Estes antígenos podem estar associados a um agente 
 infeccioso ou constituírem, simplesmente, moléculas que necessitam ser 
 localizadas ou mensuradas. 
 2. por meio da detecção de anticorpos específicos no soro > é possível 
 determinar se um animal foi previamente exposto a um agente infeccioso > 
 Isto pode estabelecer um diagnóstico ou determinar o grau de exposição da 
 população ao agente ; 
 ● SOROLOGIA: 
 → É a mensuração das interações antígeno-anticorpo com o propósito de 
 diagnóstico; 
 → As técnicas sorológicas podem ser classificadas em três grandes categorias : 
 1. Testes de ligação primária : mensuram diretamente a ligação do antígeno ao 
 anticorpo; Permite a ligação Ag+Ac, e então mensurados os Imunocomplexos; 
 detectam diretamente o Ag ou Ac de interesse; Permitem o reconhecimento 
 do Ag pelo Ac; para mensuração um dos reagentes deve estar quimicamente 
 marcado ; 
 ● Ensaios de imunoflorescências ; 
 ✔ Imunofluorescência Direta; 
 ✔Imunofluorescência Indireta; 
 ● Ensaios Imunoenzimático; 
 ✔ Testes de ELISA; 
 ● Imunocromatográficos 
 2. Testes de ligação secundária: mensuram os resultados da interação 
 antígeno-anticorpo in vitro; usualmente, são menos sensíveis do que os de 
 ligação primária, mas podem ser mais fáceis de serem realizados ou exigirem 
 tecnologias mais simples; 
 Se os anticorpos se conjugam com antígenos suspensos em uma solução, os 
 complexos resultantes podem precipitar ; Anticorpos que reconhecem 
 antígenos particulados (p. ex., bactérias ou eritrócitos) p odem causar 
 agregação ou aglutinação destes ; Se um anticorpo for capaz de ativar a via 
 clássica do complemento e o antígeno estiver na superfície celular, pode 
 ocorrer a lise celular; 
 então pode ocorrer isso: Coagulação, aglutinação ou ativar o C’ 
 ● Precipitação 
 ● Imunodifusão 
 ● Aglutinação 
 ● Hemaglutinação Viral 
 ● Fixação de Complemento 
 3. Testes in vivo: que mensuram o real efeito protetor dos anticorpos em um 
 animal. 
 ● Anafilaxia Cutânea Passiva 
 ➢ Reagentes Utilizados em Testes Sorológicos 
 -Soro: fonte mais comum de anticorpos; soro obtido do sangue coagulado; pode ser 
 armazenado congelado e testado quando for conveniente; Se necessário, pode ser 
 aquecido a 56 °C por 30 minutos para destruir a atividade do complemento. 
 -Antiglobulinas: As imunoglobulinas são antigênicas quando injetadas em animais 
 de espécies diferentes; Por exemplo, uma imunoglobulina purificada de cão pode 
 ser injetada em coelhos. Estes coelhos responderão com a síntese de anticorpos 
 específicos chamados de antiglobulinas; Dependendo da pureza da imunoglobulina 
 injetada, é possível produzir antiglobulinas não específicas que reconhecem todas 
 as classes de imunoglobulinas ou antiglobulinas muito específicas que reconhecem 
 uma única classe de imunoglobulina ; reagentes essenciais em muitos testes 
 imunológicos; 
 -Anticorpos Monoclonais: são específicos para uma única região do antígeno 
 (epítopo); tem como alvo partes específicas das células de certas doenças ou 
 microrganismos como vírus ou bactérias; Anticorpos monoclonais derivados de 
 hibridomas são puros e específicos; podem ser utilizados como padrões de 
 reagentes químicos e podem ser obtidos em quantidades quase ilimitadas; Como 
 resultado, eles frequentemente substituem os antissoros convencionais como 
 reagentes em testes imunodiagnósticos; 
 ➢ Definições importantes 
 -Sensibilidade: Probabilidade do teste dar positivo para os verdadeiros positivos – 
 índice de Positividade 
 -Especificidade: Probabilidade do teste acusar negativo, para os verdadeiros 
 negativos – Normais. 
 ● TESTES DE LIGAÇÃO PRIMÁRIA 
 ➢ Ensaios de Imunofluorescência 
 -corantes fluorescentes são comumente empregados como marcadores em testes de 
 ligação primária, sendo o mais importante o isotiocianato de fluoresceína (FITC) > 
 composto amarelo que pode ser quimicamente acoplado aos anticorpos sem afetar 
 sua reatividade; 
 Quando irradiado com luz ultravioleta invisível ou luz azul, a 290 e 145 nm, o FITC 
 reemite uma luz verde visível a 525 nm > Esta fluorescência pode ser detectada em 
 microscópio de fluorescência > Anticorpos marcados com FITC são utilizados nos 
 testes com anticorpos com fluorescência direta e indireta; 
 -usados nos inquéritos epidemiológicos; 
 -é de fácil execução, Rápido e Barato; 
 A. ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD) 
 -esses testes com anticorpos de fluorescência direta são utilizados para identificar a 
 presença do antígeno em uma amostra de tecido . 
 -Anticorpos dirigidos contra um antígeno específico, como o de uma bactéria ou 
 vírus, são primeiramente acoplados ao FITC. 
 -Um corte de tecido ou esfregaço contendo o organismo é fixado a uma lâmina de 
 vidro, incubado com o antissoro marcado e, então, lavado para remover qualquer 
 anticorpo que não se ligou. 
 -Quando examinados sob iluminação de campo escuro, em um microscópio com 
 uma fonte de luz ultravioleta, os anticorpos marcados que reconheceram e se 
 ligaram aos organismos irão exibir intensa fluorescência. 
 - pode identificar a presença de uma pequena quantidade de bactérias em uma 
 amostra . 
 ex. pode ser utilizado para detectar M. avium da subespécie paratuberculosis nas 
 fezes ou bactérias como Dichelobacter nodosus, Listeria monocytogenes ou 
 Clostridia em tecidos doentes; também pode ser empregado para detectar vírus em 
 cultura de tecidos ou em tecidos de animais infectados > detecção do vírus da 
 raiva no cérebro de animais infectados ou vírus da leucemia felina em 
 leucócitos infectados . 
 B. ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) 
 -esses testes com anticorpos de fluorescência indireta podem ser utilizados para 
 mensurar anticorpos no soro ou para identificar antígenos específicos em tecidos ou 
 em células em cultura . 
 -Quando os níveis de anticorpos são mensurados, o antígeno é utilizado como um 
 esfregaço, um corte de tecido ou cultura celular em uma lâmina ou lamínula > Este, 
 por sua vez, é incubado com soro suspeito de conter anticorpos contra o tal 
 antígeno; 
 -O soro é lavado, deixando apenas os anticorpos específicos ligados ao antígeno >> 
 Estes anticorpos ligados podem, então, ser detectados incubando o esfregaço com 
 antiglobulina marcada com FITC ; 
 -Quando a antiglobulina marcada que não se ligou é removida pela lavagem e a 
 lâmina é examinada, a presença de fluorescência indica que o anticorpo estava 
 presente no soro testado; 
 -A quantidade de anticorpos no soro testado pode ser estimada utilizando diluições 
 crescentes do soro em diferentes preparações de antígenos. 
 ➢ Ensaio Imunoenzimático 
 - As técnicas imunoenzimáticas são baseadas na utilização de Ag ou Ac marcados 
 com enzimas e permitem a detecção, titulação e quantificação de substâncias de 
 interesse biológico. 
 -O marcador é uma enzima que na presença de um substrato altera sua cor, de modo 
 a diferenciar o teste positivo do negativa; 
 A. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay ou ensaio de 
 imunoabsorçãoenzimática) 
 -pode também ser utilizado para detectar e mensurar tanto anticorpos como 
 antígenos. 
 -forma mais comum é utilizada para detectar e mensurar anticorpos específicos. 
 -Para realizar este ensaio, placas com micropoços de poliestireno são 
 primeiramente preenchidas com uma solução de antígeno ; 
 -As proteínas se ligam fortemente na superfície do poliestireno e, em seguida, o 
 antígeno não ligado é removido com lavagens vigorosas 
 -A superfície dos micropoços permanece revestida com uma camada de antígeno . 
 -Estas placas revestidas podem ser armazenadas até a sua utilização. 
 -O soro a ser testado é adicionado aos poços . 
 -Os anticorpos presentes no soro se ligarão ao antígeno que reveste o poço. 
 -Após incubar e lavar a placa para a remoção dos anticorpos não ligados, a 
 presença de qualquer anticorpo que tenha se ligado ao antígeno pode ser detectada 
 adicionando uma solução contendo antiglobulina quimicamente conjugada a 
 uma enzima > Esta antiglobulina marcada liga-se ao anticorpo e, após incubação e 
 lavagem, pode ser detectada e mensurada por meio da adição de uma solução 
 contendo o substrato da enzima; 
 -A utilização de uma enzima e do seu substrato tem sido empregada por garantir que 
 um produto colorido possa ser observado no tubo. 
 -A intensidade da cor que se desenvolve é, portanto, proporcional à 
 quantidade de antiglobulina conjugada à enzima, que também é proporcional à 
 quantidade de anticorpo presente no soro em análise ; 
 - intensidade da cor pode ser estimada visualmente ou, preferencialmente, por 
 espectrofotometria . 
 ● ELISA DIRETO: quando o alvo é um antígeno ligado à placa, e um anticorpo 
 primário conjugado a um emissor de cor é colocado diretamente ao alvo, e é 
 um tipo pouco usado; utilizado na dosagem de anticorpo, logo, identifica se o 
 indivíduo foi exposto a determinada doença ; Nessa reação, o antígeno é 
 fixado a um suporte sólido contendo vários pequenos poços onde a amostra 
 contendo anticorpo é adicionada para reagir. Este anticorpo, ligado a uma 
 enzima, é chamado de anticorpo primário . Nessa etapa, ocorre o 
 reconhecimento de antígeno-anticorpo e, após procedimentos intermediários 
 (incubação e lavagem), há retirada dos componentes não fixados. Em 
 seguida, a reação positiva é visualizada com a adição do substrato específico 
 da enzima utilizada, em que ocorre mudança de cor na solução através de 
 catálise enzimática. A intensidade da cor é estimada colorimétricamente e é 
 proporcional a concentração do anticorpo pesquisado. 
 ● ELISA INDIRETO: antígeno é imobilizado na placa, é uma detecção em 2 
 passos. Primeiro um anticorpo primário é ligado ao antígeno específico 
 depois é adicionado um segundo anticorpo ligado à uma enzima que se liga 
 ao anticorpo primário; 
 ● ELISA DE COMPETIÇÃO: utilizado para mensurar moléculas de haptenos ou 
 antígenos virais. Nesta técnica, o micropoço é revestido por um anticorpo 
 específico antes do teste. Em uma única reação, a amostra a ser analisada e 
 o antígeno marcado com uma enzima são colocados simultaneamente no 
 poço, onde os antígenos da amostra irão competir com aqueles marcados 
 pelos sítios de ligação dos anticorpos; A quantidade de antígenos marcados 
 ligada aos anticorpos presentes nos micropoços será inversamente 
 proporcional à concentração de antígeno na amostra analisada; técnica é 
 mais rápida do que as outras técnicas de ELISA; Ela pode ser feita de modo 
 bastante sensível se o antígeno da amostra puder reagir com o anticorpo 
 antes do antígeno marcado ser adicionado. 
 ● ELISA-SANDUÍCHE: pode ser utilizado para detectar e mensurar um 
 antígeno específico; Os poços nas placas de poliestireno são revestidos com 
 anticorpos específicos ( anticorpos de captura ) antes de realizar o teste; 
 Para conduzir o teste, a solução de antígeno a ser analisada é adicionada a 
 cada poço. Os antígenos presentes na amostra irão se ligar aos anticorpos de 
 captura presentes nos poços; Esta etapa é seguida, após lavagem, da adição 
 de anticorpos específicos, que também se ligam ao antígeno ( anticorpos de 
 detecção) . Após lavagem para remoção dos anticorpos não ligados, são 
 adicionados antiglobulina marcada e o substrato, como foi descrito 
 anteriormente na técnica de fluorescência indireta ( é importante que o 
 anticorpo de captura e o anticorpo de detecção sejam de espécies 
 diferentes e que a antiglobulina utilizada seja espécie-específica para 
 poder reconhecer o anticorpo de detecção. Isto evitará resultados falsos 
 positivos causados pela ligação da antiglobulina ao anticorpo de captura na 
 ausência do antígeno); Neste ensaio, a intensidade da reação da cor está 
 diretamente relacionada à quantidade de antígeno ligado. Como estes testes 
 envolvem a formação de camadas de anticorpo-antígenoanticorpo, eles são 
 chamados de ELISA-sanduíche; Estes ensaios, tipo sanduíche, são 
 utilizados para detectar vírus circulantes no sangue de gatos com 
 leucemia felina . 
 ➢ Imunocromatográfico 
 A. TESTE RÁPIDO - DPP ( TR-DPP- Dual Path Platfo) 
 - Métodos Imunocromatográficos; 
 -desenvolvido pelo Instituto Biomanguinhos/Fiocruz; 
 -ensaio imunocromatográfico de triagem que emprega de um lado, a combinação da 
 ptn A conjugada a partículas de ouro coloidal e de outros antígenos recombinantes 
 específicos de Leishmania ligados a uma membrana nitrocelulose; 
 -se houver a presença de anticorpos anti-leishmania na amostra testada , estes 
 reagirão com os antígenos recombinantes, e em sequência se ligarão à combinação 
 de ptn A e ouro coloidal, fornecendo o resultado + por meio de reação de cor; 
 -teste rápido, simples e de fácil uso; 
 -amostra pode ser Sangue, Soro, Plasma; 
 B. KALAZAR DETECT - INBIOS 
 - Método imunocromatográfico; 
 -valiado pela primeira vez em 2003 em 128 casos de LV e 50 controles, 
 apresentando ; 
 -Uma recente descoberta, tem sido a identificação do antígeno K39 de leishmania, 
 membro da família das kinesinas. A detecção de anticorpos IgG anti-K39 tem se 
 mostrado bastante sensível e específica para VL. A clonagem do antígeno K39 tem 
 resultado na produção do antígeno recombinante K39 (rK39/ (antígeno recombinante 
 L. chaga), o qual foi adsorvido em fitas de nitrocelulose para serem usadas no 
 diagnóstico de leishmaniose visceral; 
 -destinado a determinação qualitativa de anticorpos no soro (da presença de IgG 
 anti-r), contra o antígeno recombinante K39 L.(L.) chagasi . 
 ● TÉCNICAS DE LIGAÇÃO SECUNDÁRIAS 
 -reações entre antígenos e anticorpos são comumente seguidas por uma reação 
 secundária (Ag+Ac) 
 -Se os anticorpos se conjugam com antígenos suspensos em uma solução, os 
 complexos resultantes podem precipitar . 
 -Anticorpos que reconhecem antígenos particulados (p. ex., bactérias ou eritrócitos) 
 podem causar agregação ou aglutinação destes. 
 -Se um anticorpo for capaz de ativar a via clássica do complemento e o antígeno 
 estiver na superfície celular, pode ocorrer a lise celular . 
 -podem ser empregadas em vários ensaios sorológicos; 
 ➢ Testes de Precipitação 
 -Se uma suspensão de antígeno solúvel for misturada a um antissoro concentrado, a 
 mistura torna-se turvaem poucos minutos e, posteriormente, apresenta floculações. 
 Finalmente, um precipitado deposita-se no fundo do tubo dentro de uma hora . 
 -Este precipitado é formado por complexos antígeno-anticorpo . 
 -Se quantidades crescentes do antígeno solúvel forem misturadas com uma 
 quantidade constante de anticorpo, a quantidade do precipitado depositado é 
 determinada pelas proporções relativas dos reagentes; 
 -Nenhum precipitado visível é formado com baixas concentrações de antígeno; 
 -Conforme a quantidade de antígenos aumenta, quantidades maiores de precipitado 
 serão formadas, até o ponto máximo > Entretanto, adicionando-se mais antígeno, a 
 quantidade de precipitado diminui gradualmente até não ser observado nenhum 
 precipitado com quantidades excessivas de antígeno; 
 -Anticorpos IgG3 de equinos se comportam de maneira diferente, produzindo uma 
 floculação distinta com uma concentração muito limitada de antígeno 
 -No primeiro estágio destas reações, apenas uma pequena quantidade de antígeno 
 se complexa ao anticorpo, assim, pouco precipitado é depositado. Nos tubos onde 
 há mais precipitação, tanto o antígeno quanto o anticorpo estão completamente 
 complexados e nenhum deles pode ser detectado no sobrenadante ]. Esta fase em 
 que há uma proporção ideal entre antígeno e anticorpo é denominada zona de 
 equivalência ; 
 -Quando o antígeno está em excesso, não se forma um precipitado, apesar de 
 imunocomplexos solúveis estarem presentes e o antígeno livre poder ser detectado 
 no sobrenadante > Este padrão de resultados deve-se ao fato dos anticorpos 
 serem bivalentes e, portanto, podem se ligar de maneira cruzada a dois epítopos 
 por vez, mas a ntígenos complexos são, geralmente, bi ou 
 polivalentes/multivalentes possuindo muitos epítopos; 
 - Reação pode ser afetada pelo numero de sítios de ligação que cada Ac possui 
 para o Ag; 
 -Quando existe excesso de anticorpos, cada molécula de antígeno é reconhecida 
 por várias moléculas de anticorpo, evitando a ligação cruzada e, portanto, a 
 precipitação; 
 -Quando os reagentes estão em proporções ótimas, a relação do antígeno para o 
 anticorpo é tal que ocorre uma maior quantidade de ligação cruzada e formação de 
 malhas > Conforme esta malha cresce, ela se torna insolúvel e, eventualmente, 
 precipita; 
 - Nas misturas nas quais o antígeno está em excesso, cada molécula de anticorpo 
 liga-se a duas moléculas de antígeno; Não ocorre a ligação cruzada e, uma vez que 
 estes complexos são pequenos e solúveis, não ocorre a precipitação; 
 -Os fagócitos mononucleares são os mais eficientes no reconhecimento e remoção 
 dos complexos formados em concentrações ótimas e com excesso de anticorpos. 
 -Os pequenos imunocomplexos formados com excesso de antígeno não são 
 eficientemente removidos por células fagocíticas, mas são depositados nas paredes 
 dos vasos e nos glomérulos, onde eles causam hipersensibilidade tipo III; 
 ➢ Imunodifusão ou difusão em gel 
 - Método simples de demonstrar a precipitação de Ac-Ag; 
 -Poços redondos, de cerca de 5 mm de diâmetro e distantes cerca de 1 cm, são 
 cortados em uma camada de ágar claro (gel transparente). Um poço é preenchido 
 com antígeno solúvel e o outro com antissoro; os reagentes se difundem 
 radialmente. No local onde os reagentes se encontrarem em proporções 
 ótimas, surgirá uma linha branca opaca de precipitad o; 
 -Se as soluções utilizadas contiverem vários anticorpos e antígenos diferentes, os 
 componentes provavelmente não atingirão proporções ótimas na mesma posição. 
 Consequentemente, uma linha separada de precipitado é produzida em cada grupo 
 de interações de antígeno e anticorpo. 
 -pode ser utilizado para determinar a relação entre antígenos; 
 -Se forem preparados dois poços contendo antígenos e um com anticorpo, serão 
 formadas linhas entre cada poço com antígeno e o poço com anticorpo. 
 1. Se estas linhas se unirem, provavelmente os dois antígenos são idênticos. 
 2. Se as linhas se cruzarem, os dois antígenos são completamente diferentes. 
 3. Se as linhas se unirem havendo a formação de um esporão, existe uma 
 identidade parcial, indicando que um antígeno possui epitopos que não estão 
 presentes no outro. 
 -Baseia-se na migração radial dupla de antígeno e anticorpo através do gel de ágar 
 -O encontro dos reagentes, em proporções ótimas, leva à formação de complexos 
 Ag-Ac insolúveis que precipitam, tornando-se visíveis sob a forma de uma linha ou 
 banda de precipitação; 
 ➢ Imunodifusão Radial 
 -Se uma solução de antígeno se difundir em um ágar onde foi incorporado um 
 antissoro específico, será formado um halo de precipitado ao redor do poço 
 contendo o antígeno. 
 -A área deste halo é proporcional à quantidade de antígeno no poço. 
 -Pode-se fazer uma curva padrão utilizando-se quantidades conhecidas do antígeno; 
 -Soluções com concentrações desconhecidas do antígeno podem ser avaliadas de 
 forma precisa comparando o diâmetro do halo da amostra desconhecida com o da 
 curva padrão; 
 -utilizado para mensurar os níveis de imunoglobulina sérica em potros 
 recém-nascidos. 
 ➢ Aglutinação 
 -Como os anticorpos são bivalentes, eles podem se ligar de forma cruzada com 
 antígenos particulados como bactérias ou eritrócitos estranhos, resultando em 
 coagulação ou em aglutinação; 
 -Os anticorpos diferem em sua capacidade de causar aglutinação; 
 ex. os anticorpos IgM são mais eficazes do que os anticorpos IgG; 
 -Se for adicionado um excesso de anticorpos em uma suspensão de partículas 
 antigênicas, então, do mesmo modo como acontece na reação de precipitação, cada 
 partícula será ligada aos anticorpos e a aglutinação será inibida > Esta falta de 
 reatividade de altas concentrações de anticorpos é denominada pró-zona . 
 -Outra causa de formação da pró-zona é a utilização de anticorpos que não causam 
 aglutinação > anticorpos não aglutinizantes ou anticorpos incompletos ; uma 
 razão para a falta de atividade aglutinante é que os epitopos com os quais os 
 anticorpos reagem estejam em regiões não expostas na superfície da partícula, 
 impedindo que a ligação cruzada ocorra; Uma alternativa é que esses anticorpos 
 possuem movimentos restritos na sua região de dobradiça, permitindo que eles se 
 tornem funcionalmente monovalentes. 
 -A aglutinação das partículas indica a presença de anticorpos específicos para o 
 antígeno; 
 - A reação de aglutinação é mais sensível que a reação de precipitação; 
 ➢ Aglutinação Passiva 
 - conjugando quimicamente um antígeno solúvel a partículas inertes como 
 eritrócitos, bactérias ou esferas de látex. 
 -Os eritrócitos são considerados as melhores partículas para esta finalidade 
 -os testes que empregam eritrócitos revestidos são denominados testes de 
 hemaglutinação passiva. 
 -Ag solúveis associados a outras superfícies (Partículas de látex ou superfície de 
 hemácias); 
 -Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas: • As hemácias 
 são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação covalente) e então distribuídas nos poços 
 da placa. • O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diluídos, 
 são adicionados aos poços da referida placa. • Se houver Ac específico contra o Ag, 
 as hemácias se aglutinam e formam uma camada no fundodo poço. Quando não 
 existe Ac específico, as células formam um botão no fundo do poço. 
 ➢ Fixação do Complemento 
 -A ativação da via clássica do complemento por anticorpos ligados a antígenos 
 resulta na geração de complexos terminais do complemento que podem romper as 
 membranas celulares; 
 -Se os anticorpos se ligarem a eritrócitos, eles serão rompidos e ocorrerá a 
 hemólise; 
 - útil para mensurar os níveis séricos de anticorpos; 
 -O complemento é um constituinte normal do soro fresco, mas o complemento 
 proveniente do soro fresco e não aquecido de cobaias é o mais eficiente em testes 
 hemolíticos; O soro a ser utilizado como uma fonte de complemento para aplicações 
 sorológicas deve ser armazenado congelado em alíquotas de pequeno volume; Uma 
 vez descongelado, ele deve ser utilizado de imediato. Esta amostra não pode ser 
 congelada e descongelada repetidamente. 
 -Ativação da via clássica do C’ → Complexo de ataque a membrana rompendo as 
 membranas celulares; 
 -Ac+Eritrócitos= Hemólise; 
 -realizado em duas etapas. 
 1. Primeiramente, os antígenos e anticorpos (o soro a ser analisado deve ter o 
 complemento inativado aquecendo-se a amostra a 56 °C) são misturados e 
 incubados na presença de soro de cobaia normal como fonte de 
 complemento. 
 Após a mistura antígeno-anticorpocomplemento reagir, a quantidade de 
 complemento livre que permanece na mistura é mensurada adicionando um 
 sistema indicador que consiste em eritrócitos de ovelha recobertos por 
 anticorpos. 
 A lise destas células (observada com o surgimento de uma solução vermelha 
 transparente) é um resultado negativo indicando que o complemento não foi 
 ativado e que o anticorpo estava ausente do soro analisado; 
 2. A ausência de lise (observada como uma suspensão turva de células 
 vermelhas) indica que o complemento foi consumido (ou fixado) e é um 
 resultado positivo. 
 -Normalmente, titula-se o soro a ser analisado de modo que, se os anticorpos 
 estiverem presentes naquele soro, a reação em cada tubo será gradativa, variando 
 de nenhuma lise (positivo) para lisado (negativo). 
 -O título é a maior diluição de soro na qual não mais que 50% dos eritrócitos estejam 
 lisados. 
 ● Testes In vivo 
 ➢ TESTE DE ANAFILAXIA CUTÂNEA 
 -identificação de anticorpos IgE específicos para alérgenos no soro do animal; 
 -testes cutâneos de leitura imediata 
 -baseados em injetar várias substâncias capazes de causar alergia sob a pele e 
 observar a reação do organismo do animal (basicamente vermelhidão e inchaço); 
 - Soro teste injetados na pele em locais diferentes 
 -24-48hrs o Ag IV > vc tem a reação inflamatória; 
 -adiciona-se o corante de Evans IV; 
 -objetivo é avaliar a sensibilidade alérgica que auxilia a identificar a causa da 
 alergia e determinar as opções de tratamento específico.