Técnicas laboratoriais

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→ Importantes no dia a dia, para definir a melhor 
terapêutica possível. 
→ Os imunoensaios são técnicas para a detecção ou 
quantificação de antígenos ou anticorpos, podendo 
utilizar reagentes marcados ou não marcados. 
✓ Não marcados: aglutinação, precipitação e imuno 
difusão. 
✓ Marcados: radioativo, enzimático, fluorescente e 
quimioluminescente. 
→ Os testes sorológicos ou imunoensaios se 
subdividem em: 
✓ Precipitação: são reações que envolvem 
combinação de antígeno solúvel e anticorpo 
solúvel que passam a ser visíveis. Quando as 
quantidades de antígeno e anticorpo são 
equivalentes (zona de equivalência) há formação 
máxima de precipitado, decrescendo à medida em 
que um dos dois reagentes está em excesso. 
A quantidade de precipitação do anticorpo, a zona do 
antígeno e zona de equivalência, a medida em que 
você vai adicionando o antígeno vai havendo essa 
associação, até que chega um ponto onde é possível 
identificar a quantidade presente especificamente de 
antígeno é capaz de ativar essa resposta específica de 
anticorpos e começa a ter uma zona excessiva de 
antígeno. 
 
Quando coloca quantidade excessiva dos antígenos em 
um líquido com anticorpos, vai começar a evoluir com 
a precipitação se continuar aumentando passa a não 
mais gerar o precipitado e passa a haver a zona de 
excesso. Então a quantificação vai dessa formação do 
precipitado, até quando é formado até o momento em 
que você deixa de identificar. 
✓ Imunodifusão radial dupla: semiquantitativo, 
quando ambos os reagentes (antígeno 
desconhecido e moléculas de um anticorpo 
poliespecífico) são colocados em um meio suporte, 
o ponto onde os reagentes se encontram pode ser 
visualizado como uma linha ou banda de 
precipitação. Matrix do ágar com o anticorpo e 
coloca-se o antígeno em pontos diferentes da 
placa, dependendo da quantidade do antígeno e a 
capacidade de ligação com o anticorpo, vai ter a 
formação da linha radial. Embora ele não tenha 
capacidade de expressar exatamente a quantidade 
de antígeno necessário para essa ligação. 
 
Ex.: paciente com pneumonia, coleta-se o material do 
escarro, e suspeita que seja por gram negativo 
específico, e quando coloca as culturas de anticorpos 
ao redor da cultura de bactéria, no local onde tem o 
reconhecimento há a formação dessa linha de 
imunoreconhecimento. 
 
✓ Imunodifusão radial simples: a variação é 
quantitativa em cima da imunoradial dupla, nessa 
técnica o anticorpo é uniformemente distribuído 
no gel e o antígeno (amostra teste) é aplicado em 
um orifício. A amostra difunde radialmente no gel, 
formando um halo de precipitação circular em 
torno do orifício da amostra. 
 
Antígeno em um ponto, e o anticorpo espalhado por 
toda a placa, e acaba tendo o antígeno sendo 
encontrado com o anticorpo, formando halo de 
precipitação. Aqui tem-se quantidades diferentes do 
antígeno em cada ilha e a dispersão do anticorpo é 
igual, quando você tem maior quantidade de antígeno 
tem maior área de halo, se tem menor quantidade de 
antígeno tem menor halo. Então consegue quantificar 
a quantidade do antígeno presente na diluição 
(quantitativo na radial dupla consegue identificar a 
resposta, na simples consegue quantificar a resposta) 
 
 
• A difusão depende do tamanho do orifício, 
temperatura, consistência do gel, concentração do 
anticorpo incluído no gel, tempo de difusão e 
outros parâmetros. 
 
• O diâmetro do halo de precipitação formado é 
proporcional a concentração (do antígeno 
presente na análise) do analito pesquisado na 
amostra. Então consegue quantificar essa presença 
do antígeno para definir o que vai ser a conduta 
terapêutica, identificação da célula ou do antígeno. 
 
• Essa técnica pode ser utilizada principalmente na 
quantificação de proteínas como imunoglobulinas, 
fatores do complemento, proteínas de fase aguda, 
cadeias leves e proteínas de transporte. 
→ Testes envolvendo separação eletroforética: 
✓ Imunoeletroforese: combina a eletroforese em 
gel, seguida da imunodifusão e precipitação das 
proteínas. É realizada em duas etapas: 
• Primeira etapa: envolve a separação 
eletroforética das proteínas (realizado com 
componente elétrico). 
 
• Segunda etapa: imunodifusão de cada 
componente, a partir de seu centro de difusão, 
contra o antissoro específico, e isso forma uma 
linha ou arco de precipitação na região de 
equivalência. 
Então tem a amostra, vai difundir o antígeno, 
espalhar em cada ponto, coloca-se o soro, e vai ter 
uma quantificação dessa linha de equivalência de 
acordo com a quantidade de relação entre um e 
outro. Isso tudo graças a uma divisão elétrica da 
proteína. 
 
Na leitura de eletroforese tem o antígeno 
colocado central e os reagentes pontuais, com a 
presença da carga elétrica tem a migração do 
antígeno (por mais ou menos atração), para um 
determinado ponto de imunodifusão, e então 
identifica a relação direta entre eles. 
 
✓ Imunofixação: deve ser realizada quando um pico 
ou banda é encontrada na eletroforese de 
proteínas séricas ou quando há suspeita de 
gamopatia monoclonal. Combina a eletroforese e a 
imunoprecipitação. 
Uma eletroforese de proteínas normais, da esquerda 
para a direita há alpha 1, alpha 2, beta e gama 
globulina, e quando tem uma gamopatia monoclonal 
tem uma determinada proteína que se fixa de forma 
mais extensa: 
 
É um procedimento realizado em 2 estágios: 
• Primeiro a amostra é aplicada em posições 
diferentes do gel de agarose (placa) e as proteínas 
são separadas por eletroforese de acordo com a 
placa, depois disso aplica-se soro específico para 
IgG, IgA, IgM, cadeia kappa e cadeia lambda 
impregnado em uma fita de papel no acetato. São 
colocados individualmente sobre cada posição, 
seguidos da aplicação de solução fixadora de 
proteínas. 
 
• Quando se coloca as fitas de acetato contento o 
anticorpo em cima da agarose com o soro, ocorrerá 
a precipitação in situ. A revelação a coloração, que 
é feita com corante de prata. 
Então tem por exemplo, teste para detecção de 
proteínas colocou na placa a fita, e ela tem bandas de 
reação diferentes, dependendo da quantidade de 
proteínas. Tem quantificação de nível de anticorpo 
dependendo de cada tipo de proteína, e nesse 
paciente a quantificação de anticorpos IgM é maior, 
quando vai ler esse reativo da fita, vai ter a presença de 
anticorpos em concentração em carga proteica maior 
que deveria, e identifica-se uma eletroforese alterado. 
 
Nessa eletroforese as proteínas são separadas de 
forma eletrostática, e na fita os anti-anticorpos, e 
coloca-se a fita em cima de cada porção separada. É 
como se colocasse na eletroforese já pronta, uma fita 
por cima, que vai fazer fixação da proteína com o 
autoanticorpo presente na fita. Quanto mais 
impregnação é quando tem patologia associada. 
Paciente portador de mieloma múltiplo: 
 
→ Técnicas com dispersão de luz: 
✓ Nefelometria: baseada no princípio de que um 
imunocomplexo em solução dispersa luz em vários 
ângulos em relação à luz incidente. Um 
nefelômetro utiliza uma fonte de luz de alta 
intensidade que incide em uma cubeta contendo 
os imunorreagentes. A quantidade e a natureza da 
dispersão dependem da forma e do tamanho das 
partículas, da concentração, do comprimento de 
onda e do índice de refração do meio. 
 
• Então uma fonte luminosa que é direcionada, 
concentrada contra um substrato do sangue mais 
a proteína dispersa, e dependendo do quando essa 
incidência de luz vai passar e ser refratada, você 
identifica a quantidade de reação que está 
havendo dentro. A dispersão da luz vê quantos 
graus de dispersão aconteceu dessa luz mediante 
aquela substância que estava dispersa no tubo. 
 
• Indicadas para determinações de proteínas 
específicas como alfa-2-antiplasmina, IgG, IgA, 
IgM, C3, C4, apoliproteinas, beta-2-microglobulina, 
ante estreptolisina O,proteína C reativa 
ultrassensível e fator reumatoide. 
• Então a técnica laboratorial vai ser formar um 
imunocomplexo ou prever a formação, onde tem 
anticorpos previamente dispersos no líquido, pinga 
o sangue com a proteína em que teoricamente o 
anticorpo vai se ligar. Com a passagem de luz e 
quanto vai haver de dispersão dessa luz é 
quantificada essa leitura. 
 
→ Reações de aglutinação: a ligação cruzada com 
produção de agregados ocorre quando um anticorpo 
multivalente presente em uma partícula (insolúvel). 
Essa partícula pode ser um antígeno insolúvel nativo, 
antígenos expressos em células (como antígenos 
eritrocitários) ou partículas cobertas com antígenos 
(como partículas de látex). Pinga o anticorpo contra 
determinando antígeno, vai ver quanto eles se ligam, 
aglutinam, mas não necessariamente quanto eles 
precipitam. Tipos: 
 
✓ Aglutinação direta: utiliza partícula de antígeno 
insolúvel em sua forma integra ou fragmentada 
(hemácias, bactérias, fungos e protozoários), 
podem ser aglutinados diretamente pelo 
anticorpo. 
 
• São realizadas diluições em série do anticorpo 
frente a uma quantidade constante do antígeno. 
Após um período de incubação a aglutinação se 
completa e o resultado é geralmente expresso 
como máxima diluição em que ocorre a 
aglutinação. Então identifica até que ponto você 
reconhece a formação do imunocomplexo, depois 
do período de incubação consegue-se expressar e 
identificar a máxima diluição em que ocorre a 
aglutinação. 
Ex.: tipagem sanguínea, o anticorpo presente já no 
líquido e pinga-se o sangue no local, a partir do 
momento em que tem uma concentração de 
anticorpos X, passa a aglutinar a reação entre o 
antígeno e o anticorpo. Quando tem quantidade de 
antígeno baixa, ele não é capaz de fazer a aglutinação. 
 
 
 
 
✓ Aglutinação passiva ou indireta: também pode ser 
utilizadas com hemácias ou partículas inertes 
(como bentonita, látex, sepharose, leveduras e 
gelatina), são sensibilizadas por absorção passiva 
(que é pegar o meio de cultura e colocar os 
anticorpos, adsorve naquele local), depois leva o 
antígeno e vê até que ponto vai ter essa reação. 
Diferente da aglutinação direta, ele não reconhece 
a proteína antigênica, reconhece essas substâncias 
inertes e hemácias. 
 
• Por exemplo, não tem um anticorpo anti-A, tem 
um anti-latex, no qual a proteína látex está ligada, 
é via outra proteína de veículo. 
 
• Na aglutinação em látex as proteínas do látex são 
esferas de poliestireno que é utilizado como 
suporte nessa adsorção de proteína solúvel e 
antígenos polissacarídeos, funcionando como 
sistema indicador da reação antígeno-anticorpo, 
fixa a proteína no látex. E o teste pode ser 
empregado na pesquisa de antígenos ou 
anticorpos, a aplicação mais comum é na detecção 
de fator reumatoide IgM, dirigido contra isotipos 
de IgG, IgA1, IgM ou IgE. 
 
 
 
 
 
• Então tem uma placa, onde já tem um anticorpo 
adsorvido/ligado ao veículo, depois pinga o sangue 
com o anticorpo específico. No caso da caseína do 
leite, tem na placa um anti-anticorpo, que se liga 
ao anticorpo da classe IgE, e a partir daí tem uma 
reação local, e dependendo grau, reconhece e 
quantifica quantos anticorpos tem no sangue 
contra aquela determinada proteína. É visível, é 
indireta por ter esse fator inerte no meio. 
 
• No teste de aglutinação de cristais de colesterol é 
utilizado o VDRL, que tem esses cristais com ligação 
de lecitina e cardiolipina, para pesquisa de 
anticorpos cardiolipídicos da sífilis ou na presença 
de autoanticorpos da síndrome anti-fosfolípide 
primária ou secundária, neste caso em geral 
associada ao lúpus eritematoso sistêmico. É igual 
ao outro, mas com molécula diferente. 
 
 
✓ Reação de inibição de aglutinação: são baseadas 
na competição entre o antígeno praticado e o 
antígeno solúvel, por um número limitado de 
moléculas de anticorpo. A inibição da aglutinação 
é um indicador de ração positiva. 
 
• Um exemplo é a testagem para presença do hCG 
na gravidez, em que tem o soro com presença de 
anticorpo anti-hCG mais urina, que ficam 
incubados em uma placa. Pinga partícula revestida 
do hCG, caso tenha a gravidez positiva, não vai 
haver aglutinação das partículas de hCG com as 
partículas incubadas, porque ele se prende a esse 
anticorpo. Quando não tem a positividade, ao 
pingar a urina e não ter hCG, essas partículas vão 
se ligar aos anticorpos e consequentemente tem a 
aglutinação acontecendo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
→ Floculação: os antígenos são adsorvidos em 
partículas de carbono (micropartículas de carvão 
ativado). Ex.: RPR (Reagina Plásmatica – sífilis.). 
✓ Onde o antígeno é uma suspensão de 
micropartículas de carbono sensibilizadas com 
lipídios complexos (cardiolipina, colesterol e 
lectina) que se aglutinam na presença de reaginas, 
anticorpos presentes em pacientes com sífilis. 
 
✓ Então já tem na solução a presença dos reagentes, 
e pinga o sangue com o anticorpo positivo, e ai ele 
vai ter uma grande atração para cardiolipina ligada 
a essa proteína. 
 
• Presença de floculação: é nítido, fica visual 
formação de floco subnadante. 
 
 
→ Testes fluorescentes: 
✓ Reação de imunofluorescência direta: é a 
detecção direta de antígenos usando anticorpo 
antígeno-específico marcado com substância 
fluorescente. Utilizado para detectar antígenos em 
tecidos biológicos (material de biópsias, vírus, 
bactérias, células etc.), sendo raramente 
quantitativo. 
 
✓ Reação de imunofluorescência indireta: o 
anticorpo presente na amostra do paciente reage 
com um antígeno específico fixado em uma lâmina 
de microscopia. 
• Após a lavagem, é adicionado um anticorpo anti-
humano (conjugado) marcado com substância 
fluorescente. 
• Após um segundo passo de lavagem, a observação 
de fluorescência é feita ao microscópio 
fluorescente em câmera escura. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
→ Ensaios com marcadores radioativos: 
• Radioimunoensaio: utilizam um reagente 
marcado, antígeno ou anticorpo, para quantificar o 
antígeno ou o anticorpo da amostra. O composto 
desconhecido pode ser determinado pela medida 
da radioatividade emitida. 
 
• O termo radioimunoensaio (RIE) é utilizado 
usualmente quando o componente marcado é o 
antígeno e ensaio imunorradiométrico (IRMA) 
quando o componente marcado é o anticorpo. O 
radioisótopo mais utilizado é o iodo-125. 
 
Competição com Antigeno marcado: 
• Inicialmente uma quantidade conhecida de 
anticorpos específicos é colocada na fase sólida. 
Depois adiciona-se o antígeno marcado com 125L. 
• Uma amostra de soro de um paciente suspeito é 
então acrescentada. O antígeno, se presente no 
soro, compete com o antígeno radioativo pelos 
sítios de ligação nos anticorpos. 
• A quantificação é feita em aparelho específico para 
a leitura de radioatividade. A concentração das 
moléculas antigênicas presentes na amostra é 
inversamente proporcional à leitura de 
radioatividade. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
De competição com Anticorpo marcado: 
• Inicialmente os antígenos são fixados na fase 
sólida, a seguir acrescenta-se a amostra do 
paciente. Os anticorpos específicos e marcados 
com o radioisótopo são acrescentados. 
 
• Se a amostra for positiva, haverá a formação do 
complexo Ag/Ac com o Ag do soro. 
 
• Quando maior a quantidade de antígeno na 
amostra, maior será a ligação destes aos 
anticorpos, formando imunocomplexos, que serão 
retirados por lavagem e assim reduzindo a leitura 
da radioatividade. 
 
Coloca o marcador, e quando o anticorpo é marcado 
ele vai ter uma predileção para se ligar a molécula 
antigênica, e esses radioisótopos não vão se ligar aos 
anticorpos, e na hora da leitura vai sobrar antígeno não 
marcado com radioisótopo. 
Havendo ligação entre antígeno anticorpo tem uma 
“precipitaçãodo imunocomplexo” e depois consegue 
ler qual a quantidade de imunocomplexo que 
depositou no tubo e na placa. 
→ Ensaios luminescentes: 
• Quimioluminescência: baseados na emissão de luz 
produzida em algumas reações químicas de 
oxidação, aqui incluídos agentes 
quimiolumiscentes derivados biologicamente. 
 
• A emissão de luz pode ser detectada ou mediada 
utilizando-se luminômetros com tubos 
fotomultiplicadores, diodo de silicone em estado 
sólido ou filme fotográfico como detector. 
 
• As reações mais utilizadas envolvem reações de 
oxidação do luminol e do isoluminol, ésteres de 
acridina e decomposição catalisada pela fosfatase 
alcalina de adamantil 1,2-dioxetano aril fosfato. 
Passos da técnica: 
 
 
 
 
 
 
 
 
Por incidência de luz quantifica quando brilho foi 
emitido, identificando a presença ou não de reação 
local. 
→ Ensaio com marcadores enzimáticos: 
• Enzima imunoensaio: é o termo genético para 
muitos testes que permitem ensaios quali e 
quantitativos, para a detecção tanto de antígenos 
quanto de anticorpos. 
• Estes testes usam o produto da mudança de cor da 
interação da enzima com o seu substrato para 
medir a reação entre o antígeno e o anticorpo. 
 
• ELISA: “Enzyme Linked Immunosorbent Assay” 
técnica realizada em múltiplas fases para a 
quantificação de antígenos ou anticorpos. Um 
desses reagentes é imobilizado na fase sólida, 
enquanto outro pode ser ligado a uma enzima, 
com preservação tanto da atividade enzimática 
como da imunológica do anticorpo. 
 
• O teste detecta quantidades extremamente 
pequenas de antígenos ou anticorpos. 
 
• Os conjugados enzimáticos devem ser preparados 
com anticorpos de alta afinidade e muito 
purificados. Para uma leitura perfeita. 
 
• Os substratos cromogênicos empregados pela 
degradação enzimática dão origem a produtos 
solúveis coloridos, cuja determinação é feita 
medindo-se a densidade ótica da solução por 
espectrofotometria. Tipos: 
 
• ELISA DIRETO: faz a medida do antígeno, então ele 
é fixado em uma placa de proteína bloqueadora, 
para fechar os outros locais reação. Ou seja, só vai 
estar exposto o sítio específico de preferência, 
então quando usa uma proteína onde deixa 
expresso por bloqueio só o receptor de alta 
afinidade para o anticorpo IgE, por exemplo. Marca 
ele e adiciona ele em contato com a enzima 
marcadora, e quando detecta essa ligação 
consegue-se identificar a presença do antígeno 
para aquele anticorpo específico, e vice-versa, se 
colocar o anticorpo e adicionar o antígeno 
marcado, o anticorpo como tem base de ligação 
específica, vai ligar a proteína específica. 
 
 
• ELISA INDIRETO: tem média concentração de 
anticorpo usando o antígeno, ligado a fase sólida, 
onde o anticorpo da amostra vai se ligar. O 
imunocomplexo será evidenciado pelo 
antianticorpo marcado com enzima e a 
subsequente adição do substrato/cromógeno. 
 
Então tem um antígeno, lava e o coloca no 
substrato, faz uma lavagem, coloca o anticorpo 
específico, que quando reconhece se liga, e faz a 
marcação de um antianticorpo e o adiciona. Vai 
reconhecer o antígeno mediante um antianticorpo 
marcado no anticorpo de ligação. Se colocasse o 
anticorpo direto não iria reagir. 
 
 
• ELISA SANDUICHE: o anticorpo para um antígeno 
específico, chamado de anticorpo de captura é, 
inicialmente, adsorvido no poço. Depois, a amostra 
com o antígeno é adicionada e se liga a esse 
anticorpo. A revelação é feita com anticorpo 
marcado por quimiluminescência. 
É indireto, tem o antígeno e o anticorpo se ligando, e 
um anticorpo se ligando, um anticorpo monoclonal que 
reage contra esse antígeno, mas nesse caso ainda é 
acrescentado uma proteína, que quando há essa 
ligação ela emite um feixe de luz. Além desse 
reconhecimento ainda é possível quantificar a 
quantidade de luz emitida, e quantificado a 
importância e reatividade da reação. 
 
 
 
 
 
 
→ Western Blotting: é um procedimento em que as 
proteínas são separadas pelo tamanho por 
eletroforese e, após separação, transferidas para uma 
membrana de nitrocelulose onde ficam imobilizadas. 
Uma vez na membrana, são usados como sonda 
anticorpos específicos para a proteína alvo. 
O anticorpo adsorvido é detectado com um antissoro, 
ou seja, um anticorpo anti-anticorpo específico 
conjugado a enzima. A técnica pode ser empregada 
para a pesquisa de antígenos ou anticorpos, sendo um 
importante auxiliar no diagnóstico de doenças 
infecciosas e autoimunes. 
 
 
 
 
 
 
 
Se houver reconhecimento dos anticorpos a essas 
proteínas que foram fixadas você vai ter essa primeira 
ligação e depois de lavar é colocada o anticorpo 
monoclonal marcado radiologicamente contra essas 
proteínas e ai gradua o quanto de anticorpo está sendo 
identificado. 
 
Método de transferência para membrana: 
Esponja onde o caldo vai estar disperso, do antígeno ou 
do anticorpo, filtro de papel, e membrana carregada do 
antígeno ou do anticorpo. Tem o gel de fixação e outro 
filtro de papel, quando coloca a carga as proteínas 
começa a migrar de um lado para o outro da 
membrana gerando reatividade.