DIFUSÃO EM MEIO SÓLIDO A PARTIR DE ORIFÍCIO E TÉCNICA DE MICRODILUIÇÃO EM CALDO PARA A DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM)

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DIFUSÃO EM MEIO SÓLIDO A PARTIR DE ORIFÍCIO E TÉCNICA DE 
MICRODILUIÇÃO EM CALDO PARA A DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO 
INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) 
V. DAVID, T.S. GARBIM, G.M. PASINATO, G. TANSINI 
Universidade Comunitária da Região de Chapecó – UNOCHAPECÓ 
Curso de Engenharia de Alimentos e Engenharia Química 
 
Resumo - Vários óleos essenciais oriundos dos vegetais tem um grande potencial 
antimicrobiano, sua eficácia é testada basicamente com as técnicas de MIC (Minimum 
Inhibitory Concentration) e difusão por orifício em meio sólido. Para o experimento foi 
utilizado o óleo essencial de canela derivado da casca ou folha de árvore, 
principalmente o gênero Cinnamomum, possui propriedades que combatem as 
infecções, controlam o açúcar no sangue, entre vários outros benefícios. Esse óleo é 
derivado da espécie Cinnamomum cassia (Canela-cassia). Os resultados de halo de 
inibição obtidos pela técnica de difusão foram de 32 mm e 33mm para o 
Staphylococcus aureus e um halo de 25 mm e 27mm para a Escherichia coli. Para a 
técnica de MIC encontrou-se uma concentração mínima do óleo essencial que inibiu 
o crescimento da S.aureus que está entre as linhas C e D, entre os valores 2500 e 
1250, porém para E.coli não houve uma concentração estudada que inibisse o seu 
crescimento. 
Palavras-chave: Concentração Inibitória Mínima (MIC), difusão em ágar, óleo essencial de 
canela. 
 
1. INTRODUÇÃO 
As plantas constituem fontes naturais de diversas substâncias medicinais. A 
exploração desses compostos vegetais vem desde a antiguidade, pois são capazes 
de auxiliar no tratamento de doenças. Com isso, as plantas se tornaram uma 
importante fonte de produtos naturais biologicamente ativos, muitos dos quais, pode-
se utilizar para a produção de inúmeros fármacos. (WALL e WANI, 1996). 
Atualmente vem se desenvolvendo inúmeros estudos sobre a eficácia de agentes 
antimicrobianos provenientes de extratos vegetais e outros produtos naturais, com 
atividade comparada ou melhor dos já utilizados para combate de micro-organismos 
patogênicos, porém gerando menor impacto ambiental e sendo de mais fácil 
obtenção. (M7-A6, 2003). 
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Há diversos métodos laboratoriais que podem ser usados para medir a 
sensibilidade in vitro os mais conhecidos são método de difusão em ágar por poço, 
disco-difusão e métodos de macrodiluição e microdiluição, os quais são realizados em 
caldo. O método de microdiluição em caldo como sendo o mais confiável para avaliar 
agentes antimicrobianos, por fornecer resultados quantitativos e não ser influenciado 
pela velocidade de crescimento do micro-organismo. (Ostrosky et al., 2008). 
Dessa forma o presente trabalho tem como objetivo verificar a atividade microbiana 
do óleo essencial de Cinnamomum cassia (canela) frente aos microrganismos 
Staphylococcus aureus e Escherichia coli por meio técnica de difusão em meio sólido 
a partir de orifício e também determinação inibitória mínima (CIM) do mesmo 
utilizando-se a metodologia descrita pela Clinical and Laboratory Standards Institute. 
 
2. MATERIAIS E MÉTODOS 
2.1 Técnica de microdiluição em caldo para a obtenção da 
concentração inibitória mínima (CIM) 
Com o auxílio da alça de inoculação retirou-se algumas colônias bacterianas e 
colocou-se em solução salina estéril, fez-se o ajuste até obter uma concentração de 
108 UFC. mL-1, utilizou-se a escala McFarland para a obtenção da concentração de 
microrganismos. Utilizou-se microplacas com 48 micropoços, colocou-se 100 µL de 
BHI (Brain Heart Infusion) nos micropoços de número 1, 2, 3, 5, 7 e 8 da linha A até F 
utilizando micropipetas, em seguida adicionou-se 200 µL de óleo essencial de canela 
cássia (Cinnamomum cassia) nas colunas 1, 2 e 3. Fez-se a homogeneização das 
amostras começando pela linha A, transferiu-se 100 µL de solução da linha A para B, 
de B para C, de C para D e assim sucessivamente até a linha F. 
Após adicionou-se 100 µL de inóculo de suspensão bacteriana 108 UFC mL-1 de 
Escherichia coli (E. coli), representada pela letra A e Staphylococcus aureus (S. 
aureus) representado pela letra B. Para o controle positivo (coluna número 5), 
adicionou-se 100 µL de BHI e 5 µL de suspenção bacteriana. Na coluna 7 (controle 
negativo), inseriu-se 100 µL de BHI, 100 µL de solução de Tween 80 e 5 µL de 
suspensão bacteriana. Na coluna 8 colocou-se apenas 100 µL de BHI, representando 
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o “branco”, e para as colunas 4 e 6 nada foi adicionado. Após feito o processo, 
incubou-se as microplacas em estufa, durante 20h. 
 
2.1. Difusão em meio sólido a partir de orifício 
Realizou-se esta técnica utilizando os microrganismos Staphylococcus aureus e 
Escherichia coli. Com o swab, emergiu-se em solução salina preparada na técnica 
anterior, e semeou-se os microrganismos no ágar solidificado. Utilizou-se uma 
ponteira de 1000 µL, para fazer um orifício central de 8 mm em cada placa, após 
colocou-se dentro do orifício uma solução concentrada de óleo de canela cássia 
(Cinnamomum cassia). Após o procedimento, incubou-se as placas em estufa durante 
24 h com uma temperatura de 35 °C. 
 
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES 
3.1. Difusão em meio sólido a partir de orifício 
 Para Staphylococcus aureus em NPs-ZnO obteve-se como diâmetro externo 
formado pela ação do agente antimicrobiano sobre os microrganismos (Dex), após ser 
mensurado com o auxílio de uma régua milimétrica, o valor de 40 mm e 41 mm 
respectivamente como apresenta a imagem abaixo. 
 
 O Halo de inibição é dado pela equação: 𝐻𝑎𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 = 𝐷𝑒𝑥 − 𝐷𝑖𝑛, ou 
seja, seguindo a ordem das imagens 1 e 2, obteve-se: 
 
𝐻𝑎𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 1 = 40 − 8 = 32𝑚𝑚 
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𝐻𝑎𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 2 = 41 − 8 = 33 𝑚𝑚 
𝑀é𝑑𝑖𝑎 =
(𝐻𝑎𝑙𝑜1 + 𝐻𝑎𝑙𝑜2)
2
=
32 + 33
2
= 32,5 𝑚𝑚 
 
 Já para Escherichia coli obteve-se como Dex os valores de 33 mm e 35 mm, 
simultaneamente como a seguinte imagem: 
 
𝐻𝑎𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 1 = 33 − 8 = 25 𝑚𝑚 
𝐻𝑎𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 2 = 35 − 8 = 27 𝑚𝑚 
𝑀é𝑑𝑖𝑎 =
(𝐻𝑎𝑙𝑜1 + 𝐻𝑎𝑙𝑜2)
2
=
25 + 27
2
= 26 𝑚𝑚 
 Analisando junto aos resultados obtidos pelo estudo do artigo publicado por 
Ana P. Capelezzo, dado como nome de seu trabalho: “polímero biodegradável 
antimicrobiano através da aditivação com compostos à base de zinco”, percebe-se 
que seus valores de halo de inibição com NPs-ZnO foram relativamente menores que 
os valores apresentados neste trabalho. Sendo obtidos à S. aureus e E. coli os halos 
de inibição de 7,3±0,6 mm e 2,0±1,0 mm, respectivamente. 
 
3.2. Técnica de microdiluição em caldo para a determinação da 
concentração inibitória mínima. 
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 Obtive-se como resultado da técnica, cores diferentes para cada bactéria em 
cada microplaca, como pode-se analisar na seguinte imagem, sendo na primeira 
microplaca Staphylococcus aureus e na segunda microplaca Escherichia coli. 
 
 A cor amarela representa que a bactéria não cresceu e a cor vermelha 
representa que ali houve crescimento bacteriano. 
 Para Staphylococcus aureus não houve crescimento nas colunas 1,2,3 nas 
linhas A, B e C pois sua MIC para concentração de 108 UFC ml-1 está entre as linhas 
C e D. Não houve crescimento também na coluna 8 pois é a coluna que está 
caracterizada como branco. 
 Para Escherichia coli todas as colunas (exceto a 8 caracterizada como branco) 
obtiveram crescimento microbiano, isso representa que nenhuma concentração foi 
suficiente para inibir o crescimento bacteriano. 
 
4. CONCLUSÃO 
Concluiu-se que esse trabalho identifica o óleo essencial de canela-cássia um 
eficaz combatente antimicrobiano para a bactéria S.aureus, pois houve uma 
concentração mínima adequada para sua inibição, entretanto para a E.coli encontrou-
se uma concentração mínima que pudesse inibir sua proliferação. A efetividade do 
óleo está a frente em relação ao microrganismo S.aureus e evidencia um halo de 
inibição maior do que a comparação com a E.coli.6 
 
5. REFERÊNCIAS 
CAPELEZZO, A. P. Avaliação da atividade antimicrobiana de filmes poliméricos 
biodegradáveis aditivados com compostos à base de zinco. 124 f. Dissertação 
(Mestrado em Ciências Ambientais). Universidade Comunitária da Região de Chapecó 
– Unochapecó. Chapecó, SC, 2017. 
C.H.S. Atividade antimicrobiana de óleos essenciais e compostos isolados 
frente aos agentes patogênicos dde origem clínica e alimentar. Departamento de 
Ciência dos Alimentos, Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG, Brasil, 2017 
M7-A6—Metodologia dos Testes de Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos por 
Diluição para Bactéria de Crescimento Aeróbico; Norma Aprovada—Sexta Edição 
(ISBN 1- 56238-486-4) do NCCLS. que pode ser vista em 
https://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/clsi/clsi_opasm7_a6.pdf 
WALL, M. E; WANI, M. C. Camptothecin and taxol. From discovery to clinic. Journal 
for Ethnopharmacology, 51: 239-254, 1996. 
OSTROSKY, E.A.; MIZUMOTO, M.K.; LIMA, M.E.L.; KANECO, T.M.; NISHIKAWA, 
S.O.; FREITAS, B.R. Métodos para a avaliação da atividade antimicrobiana e 
determinação da concentração mínima inibitória (CIM) de plantas medicinais. Revista 
Brasileira de Farmacognosia, São Paulo, v.18, n.2, 2008. 
 
 
https://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/clsi/clsi_opasm7_a6.pdf