Unidade Unica I - Teorico

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Laboratório de 
Microbiologia Geral 
e Clínica Aplicada 
à Farmácia
Material Teórico
Responsável pelo Conteúdo:
Prof.ª Me. Camilla de Paula Pereira Uzam
Revisão Textual:
Prof.ª Dr.ª Selma Aparecida Cesarin
Introdução à Microbiologia
• Introdução da Unidade;
• Anexo I;
• Orientações para Leitura Obrigatória.
• Desenvolver as habilidades para o manuseio adequado das vidrarias e equipamentos 
de Laboratório, além de conhecer as técnicas adequadas de preparo e da manutenção 
de culturas;
• Promover o raciocínio crítico e integrar o conhecimento básico de Microbiologia, por meio 
da avaliação e da refl exão dos resultados das práticas realizadas;
• Reconhecer as rotinas de Laboratório e as regras de biossegurança;
• Desenvolver novas formas de estudo, o trabalho em grupo, a comunicação oral e escrita. 
OBJETIVOS DE APRENDIZADO
Introdução à Microbiologia
Orientações de estudo
Para que o conteúdo desta Disciplina seja bem 
aproveitado e haja maior aplicabilidade na sua 
formação acadêmica e atuação profissional, siga 
algumas recomendações básicas: 
Assim:
Organize seus estudos de maneira que passem a fazer parte 
da sua rotina. Por exemplo, você poderá determinar um dia e 
horário fixos como seu “momento do estudo”;
Procure se alimentar e se hidratar quando for estudar; lembre-se de que uma 
alimentação saudável pode proporcionar melhor aproveitamento do estudo;
No material de cada Unidade, há leituras indicadas e, entre elas, artigos científicos, livros, vídeos 
e sites para aprofundar os conhecimentos adquiridos ao longo da Unidade. Além disso, você tam-
bém encontrará sugestões de conteúdo extra no item Material Complementar, que ampliarão sua 
interpretação e auxiliarão no pleno entendimento dos temas abordados;
Após o contato com o conteúdo proposto, participe dos debates mediados em fóruns de discus-
são, pois irão auxiliar a verificar o quanto você absorveu de conhecimento, além de propiciar o 
contato com seus colegas e tutores, o que se apresenta como rico espaço de troca de ideias e de 
aprendizagem.
Organize seus estudos de maneira que passem a fazer parte 
Mantenha o foco! 
Evite se distrair com 
as redes sociais.
Mantenha o foco! 
Evite se distrair com 
as redes sociais.
Determine um 
horário fixo 
para estudar.
Aproveite as 
indicações 
de Material 
Complementar.
Procure se alimentar e se hidratar quando for estudar; lembre-se de que uma 
Não se esqueça 
de se alimentar 
e de se manter 
hidratado.
Aproveite as 
Conserve seu 
material e local de 
estudos sempre 
organizados.
Procure manter 
contato com seus 
colegas e tutores 
para trocar ideias! 
Isso amplia a 
aprendizagem.
Seja original! 
Nunca plagie 
trabalhos.
UNIDADE Introdução à Microbiologia
Introdução da Unidade
A Química Orgânica está presente em nosso dia a dia de forma muito inten-
sa, desde os alimentos que consumimos, combustíveis que utilizamos, roupas que 
vestimos, móveis e diversos outros produtos. Nosso organismo funciona graças às 
diversas reações orgânicas, que classificamos como bioquímicas, “bio” por serem 
reações que ocorrem no organismo vivo.
Para o farmacêutico, em especial, a Química Orgânica é a base para diversas 
outras áreas como a Farmacotécnica, a Química Medicinal e a Bioquímica.
Esse material apresenta a sugestão de várias atividades práticas, além de algu-
mas informações sobre Práticas Laboratoriais.
Seja proativo e estude o material, inclusive as leituras complementares, e partici-
pe das práticas propostas, que serão fundamentais para a sua formação.
Segurança no Laboratório
• É obrigatório o uso do EPIs para permanecer nos Laboratórios de Microbiolo-
gia: avental de manga longa, touca, óculos de proteção, luvas e máscara fazem 
parte da rotina desse Laboratório; 
• Os sapatos devem ser fechados e todas as partes do corpo devem estar pro-
tegidas, portanto, não é permitido bermudas e saias nos Laboratórios. Para 
as alunas que, por motivos religiosos, não utilizam calças, providenciar uma 
legging para colocar embaixo da saia durante as aulas para proteger as pernas; 
• Os cabelos devem estar presos;
• Não é permitido o uso de celular durante as aulas;
• No Laboratório de Microbiologia não é permitido comer, beber, fumar, aplicar 
cosméticos ou levar à boca qualquer objeto no Laboratório ou que possa ter 
sido contaminado na bancada de trabalho;
• Não colocar as mãos na boca nem coçar os olhos;
• Lavar bem as mãos e os antebraços antes e após os procedimentos;
• Todo e qualquer incidente deverá ser comunicado ao docente responsável e, 
no caso e quebra de placa ou tubo de ensaio contendo soluções contaminadas, 
deve-se deixar o material no local até a orientação do docente e/ou do técnico;
• No Laboratório de Microbiologia, trabalha-se com microrganismos potencial-
mente patogênicos, devendo-se ter sempre cuidado para evitar uma possível 
contaminação (a boca é porta de entrada para muitas infecções);
• Na bancada de trabalho, não deve haver acúmulo de objetos, nela permanecendo 
apenas os indispensáveis para o experimento em execução.
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Biossegurança
Todas as ações realizadas para prevenir, controlar, diminuir e eliminar riscos à 
saúde e meio ambiente, provenientes de atividades como procedimentos labora-
toriais, manuseio de produtos químicos e biológicos e trato com o paciente, entre 
outros, são interesse da biossegurança.
Biossegurança: é o conjunto de medidas voltadas para ações de prevenção, minimização 
ou eliminação de riscos inerentes às atividades de pesquisa, produção, ensino, desenvolvi-
mento tecnológico e prestação de serviços, que podem comprometer a saúde do homem, 
dos animais e do meio ambiente ou a qualidade dos trabalhos desenvolvidos (BRASIL, 2017). 
Ex
pl
or
Adotar as Boas Práticas Laboratoriais garante a execução de procedimentos e 
ações adequadas para garantir a biossegurança e, consequentemente, a proteção à 
vida. A segurança depende de todos.
Um acidente é um evento não previsto que acontece e pode levar a danos pes-
soais, patrimoniais ou ao meio ambiente, por exemplo, um corte com fragmento 
de vidraria, uma queimadura com ácido, uma lesão causada ao tentar reencapar 
uma agulha de medicação. Todo acidente, mesmo os leves, devem ser investigados 
e ações tomadas para que não ocorram repetições. 
Consideramos agentes de risco quaisquer componentes que podem compro-
meter a saúde do homem, animais e meio ambiente, independentemente de sua 
origem (químicos, biológicos, físicos e radioativos).
Orientações gerais de segurança
• No Laboratório de Microbiologia, o uso do EPI é imprescindível. Avental, touca, 
luva, óculos de proteção e máscara fazem parte da rotina desse Laboratório;
• Todo e qualquer incidente deverá ser comunicado ao docente responsável e no 
caso de quebra de placa ou tubo de ensaio contendo soluções contaminadas 
deixar o material no local até a orientação do docente e/ou do monitor;
• No Laboratório de Microbiologia, não é permitido comer, beber, fumar, 
aplicar cosméticos ou levar à boca qualquer objeto no Laboratório ou que 
possa ter sido contaminado na Bancada de Trabalho. Os piercings expostos 
devem ser retirados;
• Não utilizar o celular na Bancada de Trabalho e não segurar o telefone ou ma-
nipular qualquer outro objeto externo à área analítica quando estiver com luvas;
• As unhas devem estar cortadas e limpas;
• No Laboratório de Microbiologia, trabalha-se com microrganismos potencial-
mente patogênicos, devendo-se ter sempre cuidado para evitar uma possível 
contaminação (a boca é porta de entrada para muitas infecções);
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UNIDADE Introdução à Microbiologia
• Na Bancada de Trabalho, não deve haver acúmulo de objetos, nela permane-
cendo apenas os indispensáveis para o experimento em execução.
Sempre lavar as mãos com água e sabão antes e após a realização de cada pro-
cedimento.
Figura 1 – Técnica de higienização das mãos
Fonte: anvisa.gov.br
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É importante observar, ainda:
• É proibido pipetar com a boca; 
• Não armazenar alimentose artigos de uso pessoal no Laboratório: mochilas e bol-
sas devem ser armazenadas nos locais indicados pelo técnico e/ou pelo professor;
• Não utilizar os ventiladores durante os procedimentos;
• Não manter plantas e animais que não são relacionados ao trabalho na área 
analítica;
• Descontaminar as superfícies das Bancadas de Trabalho antes e após os pro-
cedimentos e sempre que houver respingos ou derramamentos.
Importante!
Alguns procedimentos, como a centrifugação, formam aerossóis, nos quais microrga-
nismos podem estar dispersos. Evitar, sempre que possível, essa formação e, em casos 
inevitáveis, aguardar cerca de 10 minutos para conduzir o experimento e usar máscara 
de filtração adequada.
Importante!
Descontaminação
Os ambientes e os equipamentos devem ser descontaminados diariamente e 
após o uso. As soluções mais utilizadas são o álcool 70% e a solução de hipoclorito, 
mas é importante avaliar o contaminante que está sendo manipulado para escolha 
do agente de limpeza adequado.
As soluções com agentes contaminantes devem ser inativadas (por autoclavação 
ou descontaminação química) antes de descartadas, obedecendo regras de descarte 
quando contiverem agentes químicos que não podem ser desprezados no lixo comum.
Os jalecos utilizados durante procedimentos com agentes biológicos devem ser 
segregados até a descontaminação (não colocar o avental diretamente na bolsa ou 
dentro de armários).
Cabines de segurança biológica
As cabines, estruturas muito parecidas com as capelas de exaustão, são utiliza-
das para a manipulação de produtos biológicos, protegendo o ambiente e o mani-
pulador de aerossóis e borrifos com agentes infectantes, além de proteger também 
o produto que está sendo manipulado de contaminação externa.
A grande diferença das cabines de segurança quando comparadas às capelas 
de exaustão de gases é a presença de filtros especiais denominados “filtros de alta 
eficiência”, ou HEPA.
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UNIDADE Introdução à Microbiologia
As cabines devem ser instaladas longe da área de circulação de pessoas e longe 
da porta. Durante sua utilização, manter portas e janelas fechadas para que o fluxo 
de ar não interfira na eficiência da cabine. 
Observar, também, os seguintes tópicos para a utilização das cabines:
• Higienizar o interior da cabine antes e após cada procedimento;
• Ligar a cabine 20 minutos antes da utilização e manter ligada por mais 20 
minutos após o término do trabalho;
• Não armazenar objetos no interior da cabine;
• Não colocar cadernos, lápis, blocos e anotação, borracha, caneta ou quaisquer 
outros materiais dentro da cabine.
Periodicamente, a cabine deve ser inspecionada e manutenções preventivas de-
vem ser realizadas para garantir a eficiência da filtração.
Tabela 1 – Comparação do tipo de cabine de segurança 
biológica (CSB) quanto às características e indicação de uso
Tipo
Velocidade 
frontal
Padrão de fluxo do ar
Substâncias 
químicas
Classes 
de risco 
biológico
Proteção 
do produto
Classe I 0,38 a 0,5m/s Frontal: atrás e acima através do filtro HEPA Não 2 e 3 Não
Classe II 
Tipo A 0,38m/s
70% do ar recirculado através do filtro HEPA 
30% de ar exaurido através de filtro HEPA Não 2 e 3 Sim
Classe II 
Tipo B1 0,5m/s
30% de ar recirculado através de filtro HEPA 
70% de ar exaurido através de filtro HEPA e 
tubulação rígida
Sim 
(Níveis baixo/ 
volatilidade)
2 e 3 Sim
Classe II 
Tipo B2 0,5m/s
Nenhuma ventilação de ar: 100% de ar 
exaurido via filtros HEPA e tubulação rígida Sim 2 e 3 Sim
Classe II 
Tipo B3 0,5m/s
Idêntida às Cabines II A, mas o sistema de 
ventilação sob pressão negativa para a sala e o 
ar é liberado através de tubulação rígida
Sim 2 e 3 Sim
Classe III Entradas e saídas de ar através de filtros HEPA Sim 3 e 4 Sim
Fonte: BRASIL, 2005
Classificação dos agentes biológicos
Classificam-se os agentes biológicos de acordo com sua virulência e modo de 
transmissão, a estabilidade do agente no meio, a origem do material e sua concen-
tração, o volume e a dose infectante. 
Deve-se observar, ainda, se existem medidas profiláticas e de tratamento efica-
zes disponíveis, o tipo de ensaio que será realizado:
• Classe de risco 1: baixo risco individual e coletivo. Fazem parte dessa classe 
os microrganismos que, geralmente, não provocam doenças em humanos e 
animais como os lactobacillu;
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• Classe de risco 2: risco individual moderado e risco coletivo limitado. Nessa 
categoria, estão os agentes que podem provocar doenças no homem ou nos 
animais, mas seu potencial de propagação coletiva é limitado. Para os micror-
ganismos dessa categoria, existem medidas profiláticas e terapêuticas eficazes. 
Fazem parte dessa categoria Escherichia coli, Salmone ssp, Candida albicans, 
Vírus da dengue e Rotavirus, entre outros.
Alguns agentes podem se enquadrar na categoria de risco 2 ou 3, como o HIV, de-
pendendo do procedimento que será realizado.
• Classe de risco 3: risco individual alto e risco coletivo moderado. Encontra-
mos nessa classe os agentes que são transmitidos pelas vias respiratórias e são 
potencialmente letais. Representam risco para comunidade e ambiente pois 
podem ser transmitidos de uma pessoa para outras pessoas. Para os micror-
ganismos dessa categoria, existem medidas profiláticas e terapêuticas eficazes. 
Nesse grupo, temos: Bacillus anthracis, Clostridium botulinum, Escherichia 
coli enterohemorragica, Vírus influenza H1N1 etc.;
• Classe de risco 4: alto risco individual e coletivo. Nesta classe, consideramos 
os agentes patogênicos altamente infecciosos, que se propagam facilmente pela 
via respiratória (ou por outro meio desconhecido) e causam doenças graves ao 
homem ou animais. Representam risco elevado tanto para os profissionais que 
manipulam esses produtos e para a coletividade. Podem levar à morte, pois 
não existem medidas profiláticas ou terapêuticas eficazes. São exemplos de 
agentes desse grupo: Ebola, Herpes vírus Simiae e Varíola (major).
Ao se conhecer a classe de risco do agente, é possível determinar o nível de 
biossegurança que será adotado.
Tabela 2 – Resumo com alguns requisitos exigidos aos níveis de Biossegurança
Nível de Biossegurança
Barreiras de Contenção
Barreiras de contenção primárias Barreiras 
de conteção 
 secundárias
Procedimentos/ 
práticas
Equipamentos de proteção
EPI EPC
1
Nível de contenção 
adequado para o 
trabalho com agentes 
biológicos de classe 
de risco 1, que não 
causam doenças
em seres humanos
ou animais,
adultos sadios.
Boas práticas
Sinal de risco biológico 
afixado na porta
Treinamento
Jaleco
Luvas
Touca
Não são necessários Pias para lavagem 
das mãos próximas 
à saída
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UNIDADE Introdução à Microbiologia
Nível de Biossegurança
Barreiras de Contenção
Barreiras de contenção primárias Barreiras 
de conteção 
secundárias
Procedimentos/ 
práticas
Equipamentos de proteção
EPI EPC
2
Nível de contenção 
adequado para 
o trabalho com 
agentes capazes 
de causar doenças 
em seres humanos 
ou animais, porém 
sem risco grave aos 
profissionais, 
à comunidade 
ou ambiente.
Prática de NB-1 mais:
 · acesso limitado
 · precauções 
com materiais 
perfurocortantes
 · manual de 
Biossegurança
 · exame médico 
periódico e vacinação
 · Jaleco
 · Luvas
 · Toucas
 · Máscaras
Cabines de 
classe I ou II nos 
procedimentos que 
gerem aerossóis
Autoclave no prédio
Parede, teto e piso 
em acabamento liso, 
impermeável, sem 
juntas e reentrâncias
3
Nível de conteção 
adequado para 
trabalho com agentes 
com potencial de 
transmissão aérea, 
que causam doenças 
em humano e animais 
e representam risco 
se disseminado 
na comunidade.
Prática de NB-2 mais:
 · acesso controlado
 · descontaminação de 
todos os resíduos e EPI
Macacão
Proteção 
respiratória
Protetor de face e 
olhos
Cabine de classe 
I ou II
Autoclave dentro do 
laboratório
NB-2 mais:
 · controle 
automatizado de 
acesso
 · intertravamento 
de portas
 · exaustão por filtro 
absoluto
 · pressão negativa 
de ar
4
Nível de contenção 
adequado para 
trabalhocom agentes 
potencialmente letais 
aos seres humanos 
e animais, em que 
não há medidas de 
tratamento ou de 
profilaxia eficazes.
NB-3 mais:
 · banho de 
escontaminação
 · incineração de resíduos
Macacão de pressão 
positiva
Cabines de classe II 
B 2 ou Classe III
NB-3 mais:
 · edifício separado 
ou área isolada
 · leitor biométrico
 · exaustão através 
de dois filtros 
absolutos
 · descontaminação 
de efluentes
Fonte: Ministério da Saúde, 2013
O manual de biossegurança, disponibilizado pelo Governo do Estado do Espírito Santo, apre-
senta informações mais completas sobre o tema. Disponível em: http://bit.ly/375RdmJEx
pl
or
Meio de Cultivo e Preparo de Material 
para o Laboratório de Microbiologia
Meios de Cultura
Os microrganismos encontram-se no meio ambiente formando populações 
mistas, ou seja, vários tipos de microrganismos fazem parte do mesmo habitat. 
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Para estudar microrganismos, é necessário obter uma biomassa microbiana na 
forma de populações puras, ou seja, isolar o microrganismo do meio, por meio de 
técnicas que irão proporcionar seu crescimento. 
Quando conseguimos esse crescimento isolado de uma população isolada, te-
mos uma cultura pura ou axênica, populações cultivadas em meios de cultura, 
homogêneas (um tipo de microrganismo), sem a presença de outras formas de 
vida contaminantes.
Podemos proporcionar esse crescimento em tubos específicos, frascos e Placas 
de Petri.
Quando desejamos um crescimento em grande escala, para fins industriais, es-
sas colônias podem ser cultivadas em tanques especiais. 
Mas como conseguimos essa separação de populações puras e como deve ser 
o meio de cultura?
Atualmente, diversas técnicas e diversos meios de cultura existem para se con-
seguir o isolamento (obtenção de uma cultura pura a partir de uma mista) e cres-
cimento adequados.
Deve-se prever, no meio de cultivo, as substâncias exigidas pelos microrganis-
mos e necessárias para seu crescimento e multiplicação como as proteínas e os 
carboidratos e as fontes de nitrogênio, os sais e as vitaminas.
Para conseguir promover o crescimento de uma cultura dentro de um La-
boratório, é importante conhecer e reproduzir as condições do habitat natural 
do microrganismo.
Além disso, é fundamental reproduzir as condições ambientais favoráveis, não 
somente as nutricionais, proporcionando temperatura, atmosfera de incubação, 
pH, pressão osmótica e umidade ajustados às necessidades do microrganismo. 
Para se obter o isolamento, realiza-se a semeadura, técnica que consiste na 
adição de microrganismos na superfície de um meio de cultura sólido, permitindo, 
assim, a formação de diversas colônias (populações isoladas que crescem na su-
perfície do meio de cultura). Das populações, é possível, então, isolar os microrga-
nismos desejados.
Os meios de cultura têm como objetivo obter crescimento bacteriano, isolar mi-
crorganismos para estudo, compreender a morfologia da colônia, pesquisar pa-
togenicidade e mecanismo de resistência, compreender e estudar características 
bioquímicas, compreender e estudar o comportamento de microrganismos frente a 
diversas substâncias (estudos de fármacos por exemplo), entre outros. 
Classificação dos meios de cultura
Quanto à consistência, os meios podem ser líquidos, semissólidos e sólidos: 
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UNIDADE Introdução à Microbiologia
• Meios de culturas líquidos: são denominados de meios líquidos ou caldos os 
meios nos quais os nutrientes estão em solução aquosa. São utilizados para 
crescimento em massa, ou seja, não promovem a formação de colônias e o 
crescimento pode ser verificado pela turvação do meio;
• Meios de culturas sólidos: são denominados de meios sólidos ou solidifica-
dos e são obtidos pela adição de um agente gelificante à cultura, geralmente, 
o ágar, na concentração de 1,5% a 2%. O cultivo do meio sólido é feito em 
Placas de Petri ou tubos, de acordo com o objetivo da cultura. Nesse tipo de 
cultura, a formação de colônias ocorre sobre ou dentro do substrato sólido e é 
indicado o isolamento de colônias;
• Meios de cultura semissólidos: são denominados de semissólidos os meios 
obtidos pela adição de pequena quantidade de agente gelificante, utilizando 
o mesmo exemplo do ágar, que seria utilizado na concentração de 0,5% a 
0,75%. Essa cultura é, geralmente, comercializada em tubos e, por ser mais 
fluida, possibilita a verificação de motilidade do microrganismo. 
Os meios podem também ser classificados quanto à função, em meios simples, 
seletivos, diferenciais e de manutenção:
• Meios simples: apresentam em sua composição os elementos essenciais que 
proporcionam o crescimento dos microrganismos. Útil para microrganismos 
que não necessitam de grandes exigências de nutrientes para se desenvolver; 
• Meios de enriquecimento: é o meio simples adicionado de substâncias, ou 
seja, enriquecido. São exemplos desse meio o ágar chocolate e o ágar sangue, 
mas também podem ser adicionados ao meio soro, ovo, leveduras etc.;
• Meios seletivos: são meios que favorecem o crescimento de alguns microrga-
nismos, mas inibem o crescimento de outros. Essa inibição ocorre, geralmente, 
pela adição de uma substância inibidora;
• Meios diferenciados: uma variação do meio seletivo, permite o crescimento 
de um grupo de microrganismos com características definidas, utilizados para 
diferenciar grupos ou espécies;
• Meios de manutenção: utilizados quando queremos manter uma cultura viável. 
É possível, ainda, classificar um meio quanto à sua natureza. Nesse caso, temos 
os meios animados e inanimados:
• Meios animados: formados por células vivas, por exemplo, tecidos vivos e 
ovos embrionados, ou células de animais de Laboratório;
• Meios inanimados: neste meio, não temos células vivas. Podem ser naturais, 
quando as substâncias que compõem o meio são obtidas na natureza ou sintéti-
cos, quando contém em sua composição substâncias obtidas em Laboratórios. 
Os semissintéticos são obtidos com materiais das duas origens. 
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Encontramos, ainda, em algumas literaturas, outras classificações, como:
• Meios de transporte: apropriados para garantir que os microrganismos per-
maneçam viáveis até o momento que será possível realizar a cultura;
• Meios de triagem: são meios de cultura úteis para a identificação presuntiva 
ou para segregar bactérias em grandes grupos;
• Meios complexos: denominam-se complexos os meios que apresentam em 
sua composição componentes essenciais ao crescimento da maior parte de 
microrganismos quimio heterotróficos. A composição química exata não é in-
teiramente conhecida. Exemplo: caldo nutriente;
• Meios indicadores (ou diferenciais): são meios de cultura que permitem uma 
identificação pela análise de resultado de uma reação bioquímica, podendo ser 
seletivo ou não;
• Meios redutores: são meios de cultura utilizados para promover o cresci-
mento de bactérias obrigatoriamente anaeróbias. Em sua composição, en-
contram-se substâncias que reagem com o oxigênio dissolvido, eliminando-o 
do meio de cultura;
• Meios quimicamente definidos: são meios que possuem a composição quí-
mica exatamente conhecida. 
Para manter um meio de cultura adequado, ele deve ser estéril e a conservação 
deve preservar essa condição, ou seja, devemos garantir que a conservação e o ma-
nuseio não propiciem o crescimento de quaisquer outras formas de vida. Para isso, 
é necessária uma técnica asséptica, que garante que, ao introduzir um microrga-
nismo no meio estéril (inoculação), não ocorra contaminação externa (ambiental). 
Atualmente, é muito comum a aquisição de meios de culturas prontos, chama-
dos de meios comerciais.
Tabela 3 – Meios de cultura e utilizações principais
Meios de cultura para transporte e conservação
Cary Blair Meio carente em nitrogênio que impede o crescimento do microrganismo, porém é nutritivo e permite sua sobrevivência até análise. Indicado para transporte de material fecal. 
Salina tamponada Meio líquido que mantém a bactéria viável. Indicado para o transporte de fezes.
Meio StuartAssim como o Cary Blair, é um meio carente de nitrogênio, porém nutritivo. Indicado para 
transporte de diversos microrganismo, incluindo patogênicos como Haemophilus spp., Streptococcus 
pneumoniae, Salmonella spp., Shigella spp. etc.
Ágar nutriente
Meio simples e barato, muito utilizado em Laboratórios de Microbiologia por sua versatilidade.
É indicado para análises de água, alimentos e leite, cultura preliminar, isolamento para obtenção 
de culturas puras, para conservação e manutenção de culturas e para observação de esporulação de 
bacilos Gram positivos. 
17
UNIDADE Introdução à Microbiologia
Meios para crescimento e isolamento
Ágar chocolate
Meio elaborado com sangue de 
cavalo, carneiro ou coelho, 
suplementos com NAD e cisteína 
em uma base achocolatada. 
Utilizada para microrganismos exigentes 
como Haemophilus spp., Neisseria spp., 
Branhamella catarrhalis e Moraxella spp.
Figura 2
Fonte: ENCRYPTED, 2019
Ágar Thayer-Martin 
chocolate
Superior a outros meios e rico 
em nutrientes, é utilizado para 
isolamento de Neisseria gonorrhoeae 
e Neisseria meningitidis. 
Em sua composição, possui 
antibióticos que inibem o crescimento 
de outros microrganismos.
Figura 3
Fonte: ENCRYPTED, 2019
Ágar SS (salmonella-
shigella)
Em sua composição, possui componentes 
que inibem o crescimento de outros 
microrganismos. Em sua composição, 
apresenta lactose (indica bactérias que 
produzem fermentação) e tiossulfato 
de sódio (que identifica bactérias que 
produzem ácido sulfídrico). 
Utilizado para selecionar e isolar espécies 
de Salmonella e Shigella. Figura 4
Fonte: RESEARCHGATE, 2019
Caldo selenito 
com novobiocina
Inibe o crescimento de coliformes e espécies naturais da flora intestinal. 
Utilizado para detectar Salmonella e Shigella em amostras (fezes, alimentos, urina). 
Caldo tetrationato
Utilizado como meio de enriquecimento para Salmonella spp. Contém sais de bile que inibem o 
crescimento de bacilos Gram positivos. É possível adicionar iodo e verde brilhante para inibição de 
crescimento de espécies da flora intestinal.
Caldo tioglicolato 
com indicador
Utilizada para cultivo de microrganismos aeróbios, microaerófilos e anaeróbios, bem como para 
controle de esterilidade de diversos materiais. Apresenta em sua composição o azul de metileno e 
a resazurina, que são indicadores de oxidação de aeróbios. Esse meio contém, também, dextrose 
como fonte de carboidrato e promotor de crescimento. 
Caldo tioglicolato 
sem indicador
Utilizada para microrganismos anaeróbios, por ter em sua composição componentes 
redutores como tioglicolato, cisteína e sulfito, que produzem uma anaerobiose adequada para 
microrganismos exigentes.
Ágar Mac Conkey
Apresenta violeta genciana (cristal 
violeta) em sua composição, que inibe 
o crescimento de Gram positivos, mas é 
menos seletivo para Gram negativos que 
o Ágar SS. 
Utilizado para isolar diversos bacilos 
Gram negativos como enterobactérias e 
microrganismos não fermentadores. Figura 5
Fonte: ENCRYPTED, 2019
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Meios para crescimento e isolamento
Ágar sangue
Meio enriquecido que propicia o 
crescimento da maior parte dos 
microrganismos. Utilizada para 
diferenciar Streptococcus spp. e 
Stephylococcus spp (hemólise), 
isoladamente de microrganismos não 
fastidiosos e identificação presuntiva de 
Haemophilus spp.
Figura 6
 Fonte: ENCRYPTED, 2019
Ágar CLED - cystine 
lactose electrolyte
deficiente
Apresenta deficiência de eletrólitos 
em sua composição, inibindo o véu 
de cepas Proteus. Utilizado para isolar 
e quantificar microrganismos Gram 
positivos, Gram negativos e leveduras. 
Figura 7
Fonte: ENCRYPTED, 2019
Caldo BHI - brain heart 
infusion
Em sua composição, contém nutrientes do cérebro, coração e fontes de nitrogênio, carbono, 
vitaminas e enxofre. Utilizada para cultivo de streptococcos, pneumococos, meningococos, 
enterobactérias, não fermentadores, leveduras e fungos. 
Löwenstein Jensen
Meio à base de ovos integrais, permite 
grande crescimento e isolamento 
primário de microbactérias. 
Permite crescimento satisfatório 
para o teste da niacina (positivo para 
Mycobacterium tuberculosis)
Figura 8
Fonte: ENCRYPTED, 2019
Meio bifásico: 
Löwenstein e 
Middlebrook
Meio constituído de uma fase líquida (Löwenstein Jensen) e uma fase sólida (7H-9), utilizado para 
isolamento de microbactérias isoladas, extraídas de materiais nobres como líquor, líquido pleural, 
biópsias, sangue etc.
Ágar Mycosel Apresenta antimicrobianos (cicloheximida e cloranfenicol) em sua composição, que permite o isolamento de fungos patogênicos, especialmente dermatófitos.
Ágar Sabouraud 
Dextrose
Utilizado para o cultivo e crescimento de 
fungos leveduriformes e filamentosos, 
como espécies de Candidas. 
Permite a caracterização macroscópica 
do fungo filamentoso. 
Figura 9
Fonte: Wikimedia Commons
19
UNIDADE Introdução à Microbiologia
Meios comerciais para provas de identificação
Base de nitrogênio 
para leveduras – Yeast 
Nitrogen Base
Utilizado para identificar espécies de leveduras, por sua capacidade de assimilar carboidratos. É um 
meio à base de nitrogênio, com discos de carboidratos impregnados, nos quais é possível verificar o 
crescimento ao redor. 
Ágar Citrato Simmons
Utilizado para diferenciar espécies de 
enterobactérias e não fermentadores, 
pela análise da capacidade do 
microrganismo de utilizar o citrato de 
sódio como fonte de carbono.
Figura 10
Fonte: ENCRYPTED, 2019
Ágar Bílis-Esculina
Utilizada para identificação dos 
Stretococcus e Enterococcus bile-esculina 
positivos dos negativos. 
Baseia-se na capacidade de alguns 
microrganismos hidrolisarem a esculina 
na presença de bílis (Para identificação 
de não fermentadores Gram negativos e 
enterobactérias, usar o meio sem bílis). 
Figura 11
Fonte: FISHERSCI, 2019
Ágar Sangue – CAMP
Utilizado para separação de 
Streptococcus beta hemolítico do grupo 
B de Lancefield (S. agalactiae) e Listeria 
monocytogenes Camp positivo de outros 
do mesmo grupo.
Figura 12
Fonte: Wikimedia commons
Caldo base de Moeller
Utilizada para analisar a capacidade de microrganismos em usar descarboxilases (enzimas que 
reagem com grupos carboxilas) obtendo produtos como cadaverina, putrescina e citrulina. Entre 
eles, as enterobactérias, os bacilos Gram negativos não fermentadores e os estafilococos. 
Ágar Dnase
Meio utilizado para identificar grupos 
de microrganismos que produzem uma 
enzima que hidrolisa o DNA presente 
no meio de cultura, diferenciando 
microrganismos DNase positivos e 
negativos, entre eles, Stpahilococcus 
aureus, Serratia spp. e Proteus spp, 
Stenotrophomonas maltophila, 
Cryseobacterium meningosepticum 
e Moraxella catarrhalis (positivos) e 
Staphylococcus coagulase negativa, e 
outras enterobactérias e bacilos Gram-
negativos não fermentadores (negativos).
Figura 13
Fonte: ENCRYPTED, 2019
20
21
Meios comerciais para provas de identifi cação
Ágar Esculina
Algumas espécies de bactérias são capazes de hidrolisar a esculina, formando a esculetina, que 
reage com o ferro presente no meio tornando o meio marrom escuro ou preto. 
Utilizado para diferenciar espécies de enterobactérias e não fermentadores.
Ágar Fenilalanina Utilizado para diferenciar gêneros de enterobactérias, a partir de sua capacidade de produzir ácido fenilpirúvico a partir da fenilalanina adicionada ao meio.
CTA – Cystine
Tryticase Agar
Utilizado para diferenciar espécies 
de Haemophilus spp., Neisseria
spp., Branhamella catarrhalis e 
Corynebacterium spp. 
Esse meio fornece condições para estudo 
de fermentação de carboidratos de 
microrganismos exigentes. 
Figura 14
Fonte: ENCRYPTED, 2019
Caldo Triptona e SIM Meio que permite a diferenciação de gêneros de enterobactérias, não fermentadores, Haemophiluse anaeróbios, a partir da habilidade do microrganismo de metabolizar o triptofano em indol. 
Caldo Malonato
Neste meio, é avaliada a capacidade de o organismo utilizar o malonato de sódio como fonte 
exclusiva de carbono, o que resulta em alcalinização do meio, utilizadopara diferenciar gêneros e 
espécies de enterobactérias e não fermentadores.
Caldo Nitrato Neste meio, o nitrato é reduzido a nitrito ou gás nitrogênio e é um meio de diferenciação de enterobactérias, não fermentadores, anaeróbios, Haemophilus, Neisseria e Mycobacterium.
Meio base p/ oxidação 
e fermentação – OF
Este meio avalia a capacidade de o microrganismo utilizar os carboidratos pela via oxidativa ou 
fermentativa. Utilizado para diferenciar bacilos Gram negativos.
Ágar TSI – triplo
açúcar ferro
Este meio contém três açucares e 
indicares e permite identificar no mesmo 
meio a via aeróbia e anaeróbia, por meio 
da inoculação em tubo inclinado. 
Utilizado para diferenciar bacilos
Gram negativos.
Figura 15
Fonte: ENCRYPTED, 2019
Ágar base ureia 
(Christensen)
Utilizado para testes de bacilos Gram negativos fermentadores e não fermentadores, 
Staphylococcus e Haemophilus, por meio da determinação da capacidade do microrganismo em 
degradar a ureia. 
Fonte: Adaptado de ANVISA, 2010
Para saber mais detalhes sobre os meios citados como preparo, controle de qualidade, com-
posição e procedimento de utilização, e também informações sobre outros produtos para 
identificação, acesse o Material completo disponibilizado pela Agência Nacional de Vigilân-
cia Sanitária Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção Relacionada à Assistên-
cia à Saúde – Módulo 5 – Tecnologias em Serviços de Saúde: Descrição dos Meios de Cultura 
Empregados nos Exames Microbiológicos. Disponível em: http://bit.ly/2Sm09z7
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UNIDADE Introdução à Microbiologia
De modo geral, os meios comerciais devem ser preparados para utilização, hi-
dratados, inicialmente, com pequena quantidade de água purificada, de modo que 
todo meio fique úmido, para, então, adicionar o restante da água.
Para os meios preparados em Laboratório, temos uma fase adicional de pesa-
gem dos componentes sólidos e, na sequência, deve-se seguir o mesmo procedi-
mento de umedecer o pó para somente após adicionar o restante da água.
Para alguns meios pode ser necessário aquecimento para solubilização. Utilizar 
sempre vidros apropriados e aquecer com auxílio de bico de Bunsen e tripé ou 
chapa de aquecimento.
Os meios preparados em Laboratório devem ser esterilizados antes de serem 
utilizados nas culturas.
A esterilização por autoclave é a mais comum e, quando não houver outra des-
crição em procedimento, recomenda-se 15 minutos na temperatura de 121°C.
Nesse método, geralmente, adiciona-se o meio já nos recipientes e na cultura e 
se esterilizam juntos a embalagem e o meio, lembrando-se de que, nesse caso, a 
esterilização deve ser realizada com o recipiente aberto. É possível esterilizar o meio 
separadamente e adicionar depois em um recipiente estéril.
Quando o meio preparado não for compatível com altas temperaturas, a micro-
filtração é o método de escolha para esterilizar o meio.
Utiliza-se o filtro com 0,22 micrômetros de porosidade para esta atividade. Para 
este método de esterilização, o filtrado obtido deve ser adicionado em um recipiente 
previamente esterilizado.
A eficácia da esterilização pode ser verificada após o processo. Uma amostra de 10% 
do lote preparado deve ser analisada, por aquecimento em estufa – 35ºC por 24 
horas, não deve aparecer crescimento de colônias ou mudança de cor do meio, ou 
ainda, pode-se utilizar cepas de referência ATCC para controle.
Após o preparo do meio e sua devida esterilização, é possível, então ,realizar a 
inoculação, ou seja, a adição da amostra no meio de cultura, para que seja possível 
verificar o crescimento do microrganismo, que deve, então, ser incubado em local 
apropriado, de acordo com a temperatura exigida para o crescimento do microrga-
nismo, geralmente, em estufa ou temperatura ambiente. 
A visualização do crescimento, geralmente, é possível a olho nu, por alteração 
do meio de cultura. Meios líquidos apresentam turvação ou mudança da coloração, 
e nos meios semissólidos ou sólidos, a formação de massas de colônias. 
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A Farmacopeia Brasileira apresenta as formulações para diversas soluções e meios de cultura 
utilizados em Microbiologia. Disponível em: http://bit.ly/3bgpR0lEx
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Preparo dos Materiais Utilizados
Além dos meios de cultura, vários materiais são utilizados, desde as alças para 
realizar a inoculação das amostras no meio, as embalagens para acondicionar a 
cultura, os ambientes, os acessórios e outros materiais de Laboratório. 
As vidrarias, por exemplo, são fundamentais em um Laboratório de Microbiolo-
gia, e devem estar perfeitamente higienizadas e esterilizadas. 
Todo material que será utilizado deve ser esterilizado. Para isso, devem ser bem 
embalados em papel Kraft, de modo que não fiquem partes expostas ou que per-
mitam abertura após a esterilização. 
Existem fita adesivas apropriadas que, além de fechar a embalagem, possuem 
indicador de cor que indica se o material já foi esterilizado. 
Ao término do processo de esterilização, o material deve ser armazenado em 
local limpo e seco. 
Técnicas de Plaqueamento
Plaquear é inocular uma amostra em um meio de cultura, que irá formar colô-
nias originadas de um ou mais microrganismos. 
Para plaqueamento, são utilizados quatro procedimentos básicos:
• Plaqueamento em profundidade (pour plate);
• Plaqueamento em superfície (spread plate);
• Plaqueamento em gotas (drop plate);
• Filtração em membrana.
Plaqueamento em profundidade
• Limite de detecção de 10UFC/g para sólidos ou 1UFC/ml para líquidos;
• Aplicada a ensaios de contagem total de aeróbios mesófilos, contagem de clos-
trídios sulfito redutores e contagem de enterobactérias lácticas;
• Desvantagem: necessidade de fusão do meio de cultura antes do uso limita seu 
uso a meios e microrganismos que não são sensíveis ao calor. 
23
UNIDADE Introdução à Microbiologia
Plaqueamento em superfície
• Não há necessidade de fusão do meio, a amostra é inoculada diretamente na 
superfície do meio de cultura sólido;
• Não expõe o microrganismo ao meio quente (pela fusão como ocorre no pla-
queamento em profundidade);
• Permite a diferenciação em diversas colônias;
• Desvantagem: o volume que pode ser inoculado é limitado, não mais do que 
0,5ml por placa, sendo padrão o uso de 0,1ml por placa;
• Limite de detecção 100 UFC/g para sólidos e 1UFC/ml para líquidos;
• Aplicada para ensaios de contagem total de aeróbios psicrotróficos, contagem 
de bolores e leveduras, contagem de S. aureus e contagem de B. cereus. 
Plaqueamento em gotas
• Técnica de inoculação em superfície, portanto apresenta as mesmas vantagens 
já citadas;
• Nesta técnica, o inóculo não é espalhado e sim depositado no meio de cultura 
(gotas de 0,01ml);
• Permite inocular em triplicata diluições diferentes;
• Limite de detecção de 1000 UFC/g para sólidos e 100 UFC/ml para líquidos. 
Filtração em membrana
• Limitado a amostras líquidas límpidas;
• Amostra é filtrada em membrana de 0,45 micrômetros; 
• Permite inoculação de volume maior de amostra. Os microrganismos ficam 
concentrados na membrana na quantidade inoculada;
• Limite de detecção 1UFC por volume inoculado;
• Indicado para amostras com contagem abaixo do limite de detecção pelos 
outros métodos;
• Utilizada para ensaios de contagem total de aeróbios mesófilos, contagem de 
bolores e leveduras, contagem de bactérias lácticas, contagem de enterococos, 
coliformes fecais e e-coli, especialmente em alimentos e bebidas. 
Técnicas de inoculação (semeadura) 
• Estrias múltiplas: muito utilizadas para Isolamento de microrganismo. Nesta 
técnica, espalha-se o material utilizando uma alça de platina ou alça bacterio-
lógica descartável. As estrias são realizadas de modo sucessivo até se esgotar 
a amostra da alça;
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25
Figura 16
Fonte: Acervo do conteudista
• Método do “espalhamento”: auxilia na obtenção de um tapete uniforme de 
colônias. Neste método, a amostra é espalhada com auxílio de um swab (para 
obtenção de tapete uniforme) ou uma alça de Drigalski (quando se desejaobter 
colônias isoladas após diluição). A semeadura é realizada em toda a superfície 
da Placa de Petri e é importante que toda a superfície da Placa seja semeada. 
Recomenda-se que se faça o procedimento de semeadura com o swab em três 
direções distintas, com a alça em toda a superfície rodando a Placa ;
Figura 17
Fonte: Getty Images
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UNIDADE Introdução à Microbiologia
• Técnica de profundidade ou incoporação: nesta técnica, mistura-se 1ml de 
amostra em 20ml de um meio de cultura fundido (resfriado em temperatura 
que não favoreça novo endurecimento). A homogeneização deve ser feita em 
movimentos circulares; 
Figura 18
Fonte: Getty Images
Como fazer semeios em meio de cultura? Disponível em: https://youtu.be/qIoPo4wSnWk
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• Técnica de esgotamento de alça em tubo: feita em meio realizado em tubo, 
os microrganismos podem ser inoculados em estrias, na qual se faz a semea-
dura do meio para extremidade do tubo, ou de forma uniforme da base para a 
extremidade. Utilizada, geralmente, para crescimento ou observação de carac-
terísticas bioquímicas do microrganismo;
• Técnica de semeadura em picada em tubo: realizada com uma agulha de 
semeadura. Neste caso, não é com o meio inclinado; utilizada para observar 
funções metabólicas de microrganismos.
Técnicas de Coloração
As colorações auxiliam na observação dos microrganismos e células. Geralmen-
te ao se visualizar sem coloração, as células estão vivas ou em grandes culturas 
que podem ser visualizadas a olho nu. Nesses casos, observa-se comportamento 
e mobilidade, sendo, muitas vezes, necessário um microscópio de campo escuro.
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27
A utilização de corantes é muito útil para identificações, pois microrganismos 
e células são de difícil visualização. As bactérias por exemplo, são quase incolo-
res, dificultando sua observação in natura. Os corantes reagem à estrutura celular 
facilitando a visualização de características estruturais. Esta técnica é realizada em 
microrganismos, que não estão viáveis, e as lâminas preparadas podem ser trans-
portadas e armazenadas. 
Nas colorações simples utilizamos somente um corante, promovendo uma dife-
renciação entre a bactéria e o meio. Para essas colorações, utiliza-se, geralmente, o 
azul de metileno (1-2 minutos), o cristal violeta (20-60 segundos) e a carbolfucsina 
(15-30 segundos).
As colorações diferenciais contêm mais de um corante, que utilizam as diferenças 
químicas estruturais das células. Geralmente, são aplicadas para classificação e diag-
nóstico, distinguindo, por exemplo, diferentes tipos de bactérias e suas estruturas.
A coloração de Gram é a mais famosa das colorações diferenciais, porém, outras 
são de grande importância, como a coloração Albert-Laybourn, Ziehl-Neelsen e 
Fontana-Triboundeau.
Técnicas de Coloração em Microbiologia
Simples Diferencial
Seleção de Grupos
Microbianos
Visualização de
estruturas celulares
• Gram
• Ziehl-Neelsen
• Esporros
• Cápsulas
• Flagelos
Figura 19 – Técnicas de Coloração em Microbiologia
Fonte: Adaptado de DINIZ, 2018
Antes de iniciar uma coloração, é necessário preparar o esfregaço e fixar a 
amostra. Um esfregaço é uma aplicação de uma fina camada de amostra biológica 
sobre a lâmina de vidro, elaborada para possibilizar a visualização por microscópi-
co, realizada para fins acadêmicos, clínicos ou de pesquisa. 
O material biológico deverá ser preparado antes da realização do esfrega-
ço. Pode-se utilizar um caldo ou uma diluição em solução fisiológica, já alguns
materiais, como o sangue, podem ser aplicados in natura e a lâmina deverá estar 
limpa e desengordurada.
Após a realização do esfregaço, deve-se aguardar a secagem antes de iniciar o 
processo de fixação.
27
UNIDADE Introdução à Microbiologia
A etapa da fixação é importante para que o material biológico não seja perdido 
durante a coloração, fazendo com o material fique aderwdido à lâmina. Essa etapa 
lisa (destrói) as células dos microrganismos, porém, preserva as estruturas na posi-
ção necessária para visualização e identificação. 
O processo de fixação por calor é o mais utilizado. 
Os vídeos a seguir demonstram duas técnicas de esfregaço:
Esfregaço de cultura. Disponível em: https://youtu.be/c2BPE7wIK20
Esfregaço sanguíneo. Disponível em: https://youtu.be/wqvrP2gb5XI
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Técnica de esfregaço de culturas de microrganismos:
• Do lado oposto da lâmina em que será realizado o esfregaço, desenhe um cír-
culo, do tamanho de moeda pequena;
• Para células provenientes de um meio de cultura sólido:
 » Pingar uma gota de solução salina (fisiológica) na lâmina (no centro do círculo 
desenhado). Com a alça de cultura, é possível capturar uma gota e adicionar 
à lâmina. Não esqueça de flambar a alça caso ela não seja descartável;
• Com a alça, pegue uma pequena porção de cultura, espalhe na lâmina, mistu-
rando com a solução salina, dentro do espaço do círculo delimitado;
• Para células provenientes de um meio de cultura líquido:
 » Fazer algumas voltas com a alça cheia com cultura no espaço delimitado na 
lâmina (duas pelo menos);
 » Aguardar a secagem das lâminas ao ar (não assoprar);
 » Fixar o esfregaço seco passando a lâmina três vezes através chama do bico 
de Bunsen;
 » Armazenar os esfregaços em local adequado até coloração.
Coloração de Gram
É a coloração mais comum em Laboratórios de Microbiologia, sendo, atualmen-
te, importante ferramenta auxiliar de diagnóstico. 
Após os processos de coloração, as bactérias irão apresentar coloração roxa ou 
rosa, que serão indicativos de sua classe “gram-positivas” ou “gram-negativas”.
Essa característica bacteriana auxilia, por exemplo, na determinação da melhor 
forma de tratamento. 
As bactérias Gram-positivas se coram de roxo e as Gram-negativas de rosa
A técnica de coloração baseia-se na utilização de corantes, geralmente, o cris-
tal violeta (violeta genciana ou metil-violeta) e tratamento com solução iodetada, 
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que são retidos pelas bactérias gram-positivas, depois de a lâmina receber um tra-
tamento com álcool, que consegue remover parte dessa coloração nas bactérias 
gram-negativas.
Para finalizar, utiliza-se a fucsina ou a safranina, que atuam como corante 
secundário, fazendo com que as células que foram descoradas apresentem uma 
cor diferente da coloração inicial proporcionada pela violeta genciana + iodo (co-
loração diferencial).
De modo bem resumido, podemos dizer que essa diferença de adesão do coran-
te entre as bactérias gram-negativas e gram-positivas ocorre pela diferença entre as 
estruturas da parede celular entre esses dois grupos.
A camada mais espessa das positivas evita o descoramento pelo álcool, enquan-
to a parede mais fina das gram-negativas, junto à membrana rica em fosfolipídeos, 
são permeáveis ao álcool.
Você pode encontrar pequenas diferenças entre técnicas de coloração, mas que 
não irão influenciar no resultado final.
Outer membrane: membrana externa (lipoproteína + lipopolissacarídeos – LPS);
Lipoproteins: lipoproteínas;
Peptidoglycan: parede celular (peptideoglicano);
Priplasmic space: espaço periplasmático;
Cytoplasmic membrane: membrana plasmática;
Lipoplysaccharides: lipopolissacarídeos – LPS;
Porin: porinas;
Protein: proteínas.
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As etapas para realização da coloração de gram são:
1. Preparar o esfregaço;
2. Corar com solução de violeta genciana (cobrir a lâmina com o corante e 
aguardar 60 segundos);
3. Lavar com água destilada;
4. Cobrir a lâmina com solução Lugol (solução de iodo) por 60 segundos;
5. Lavar com água destilada;
6. Descorar com álcool a 95%, ou acetona, 10-20 segundos;
7. Lavar água destilada;
8. Corar com solução de fucsina ou safranina por 20 segundos;
9. Lavar com água destilada
10. Aguardar secagem ao ar, por no mínimo 20 minutos e observar ao mi-
croscópio.
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UNIDADE Introdução à Microbiologia
Etapas da coloração Gram: http://bit.ly/2TFri25 
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1. Aplicação de cristal violeta (corante púrpura);
2. Aplicada de solução de iodo (mordente); 
3. Lavagem com álcool (descoloração);4. Aplicação de safranina (contracorante).
Gram Positive
Cocci Bacilli
Corynebacterium
Clostridium
Listeria
Bacillus
Streptococcus
catalase - 
Staphylococcus
catalase +
S. aureus
coagulase +
coagulase -
S. epidermidis
Novobiocin
sensitive
S. saprophyticus
Novobiocin
resistant
�-hemolytic
(clear)
�-hemolytic �-hemolytic
(green)
S. pyogenes
Group A,
bacitracin
sensitive
S. agalactiae
Group B,
bacitracin
resistant
Enterococcus
E. faecalis,
E. faecium S. pneumoniae
optochin sensitive
bile soluble
capsule
(quellung +)
Viridans
S. mutans, S. sanguis
optochin resistant
not bile soluble
no capsule
Figura 20
Coloração de Ziehl-Neelsen
Esta técnica é aplicada em alguns gêneros de bactérias (Micobacterium e 
Nocardia). Esses gêneros são tratados com uma solução de fcsina fenicada, e após 
coloração, resistem ao descoramento utilizando uma solução álcool-ácido, e man-
tém a cor vermelha.
Essa resistência ao descoloramento é decorrente da estrutura de membrana des-
sas espécies, que apresentam fortes ligações lipídicas e são altamente lipofílicas, 
impedindo a entrada de corantes aquosas, mordentes e diferenciadores.
Mordente: substância química que pode ser adicionada ao processo de coloração e tem 
como objetivo intensifica-la, aumentando a afinidade da coloração pela amostra ou reves-
tindo estruturas e facilitando, assim, a visualização após coloração.
Diferenciador: substâncias que conseguem descorar certas estruturas da bactéria que ha-
viam sido previamente coradas. São utilizadas quando existe a necessidade de uma colora-
ção policromática (mais de uma cor).
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Denominamos estas espécies de BAAR – Bacilo-Álcool-Ácido-Resistente
Essa coloração é útil para diagnóstico de tuberculose. Visualizamos os bacilos BAAR como 
bastonetes corados em vermelho em um fundo azul e é feito geralmente com escarro, mas 
também pode ser utilizado lavado brônquico e gástrico, swab de laringe, biópsias e outros. 
A quantidade de bacilos visualizadas no campo determina se o resultado é negativo ou po-
sitivo para Tuberculose.
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As etapas para realização da coloração de Ziehl-Neelsen são:
1. Preparar o esfregaço;
2. Cobrir o esfregaço com solução de fucsina de Ziehl, aguardar 5 a 10 minutos 
aquecendo com chama fraca até o desprendimento de vapores (não ferver);
3. Lavar com água corrente;
4. Descorar com solução de álcool-ácido clorídrico 1%;
5. Cobrir o esfregaço com solução de azul de metileno e deixar por 30 segundos;
6. Lavar com água destilada;
7. Aguardar secagem, examinar sob imersão .
Tabela 4 – Outros métodos
Método Descrição
Coloração de Fontana Tribondeau
Técnica de impregnação pela prata utilizado para visualização de bactérias 
espiraladas como a causadora da leptospirose. Não é uma técnica muito utilizada, 
pois é possível utilizar a microscopia em campo escuro a fresco para visualizar 
estas espécies, mas quando coradas as espiroquetas coradas são visualizadas em 
marrom-escuro ou negras, e o fundo é amarelo-castanho ou marrom claro.
Coloração de Albert-Laybourn
Nesta técnica a solução de Lugol forte coram os corpúsculos metacromáticos 
(Babes Ernst), corpúsculos citoplasmáticos presentes em regiões polares. 
Esta coloração é utilizada para detectar corinebactérias, sendo aplicado como 
diagnóstico auxiliar de difteria. 
Coloração Para esporos com verde 
Malaquita (Wirtz-Conklin)
Apesar da estrutura rígida do esporo, o corante verde malaquita ou carbolfucsina 
podem atravessá-lo com aquecimento. Esta mesma proteção da estrutura do 
esporo, evita a descoloração com álcool, deixando os esporos com a aparência 
verde. Para esta técnica, utiliza a safranina como contra-corante que cora as 
demais estruturas em vermelho permitindo a diferenciação dos esporos. 
Fonte: Brasil, 2001
A técnica para esses métodos segue a mesma sequência de preparo da lâmi-
na por esfregaço, adição do corante, adição do descorante e, por fim, adição do 
contra-corante, porém na fase de coloração, todas elas passam por aquecimento 
da lâmina.
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UNIDADE Introdução à Microbiologia
Anexo I
Prática 1 – Métodos de Desinfecção
Materiais
• Água purificada fervendo;
• Cultura de e-coli em suspensão;
• Tubo de ensaio;
• Banho de água quente;
• Álcool 70%;
• Placa de ágar (preferência Mueller Hinton);
• Alça para cultivo microbiano;
• Bico de Bunsen.
Procedimento
Dividir uma placa com o meio de cultura ágar em quatro quadrantes (identificar 
os quadrantes);
I II
III IV
• No primeiro quadrante, semear a cultura de e-coli;
• No segundo quadrante, limpar a alça de cultura utilizada para semear no pri-
meiro quadrante com álcool 70% e semear com o álcool 70%;
• Colocar pequena porção de cultura de e-coli em um tubo de ensaio pequeno e 
mergulhar em água fervente por 10 minutos. Após este tempo, semear em III;
• Voltar o tubo de ensaio para a água fervente e manter por mais 10 minutos 
(total 20 minutos), retirar do banho e semear em IV;
• Incubar as placas no mínimo por 48 horas e verificar o crescimento.
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Resultados
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_______________________________________________________________
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Responda
1 – Diferencie esterilização, desinfecção, antissepsia e assepsia.
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2 – A desinfecção pode ser realizada com auxílio de agentes químicos ou físicos. 
Descreva quais são os agentes químicos mais utilizados em Microbiologia:
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3 – Descreva detalhadamente a diferença entre os agentes físicos utilizados para 
desinfecção (calor, radiação e filtração):
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Prática 2 – Semeadura de Cultura Bacteriana
Materiais
• Alça de platina ou níquel-cromo; 
• Alça de semeadura descartável (opcional);
• Placa de semeadura com meio de cultura ágar;
• Cultura de bactéria crescida;
• Bico de Bunsen.
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UNIDADE Introdução à Microbiologia
Procedimento
• As alças de platina deverão ser flambadas antes e depois da semeadura (manter 
a alça no bico de Bunsen a 45° até que fique incandescente);
• Esfriar a alça na parede do tubo ou no meio da placa (desde que ainda não 
esteja inoculada);
• Flambar a boca do tubo de ensaio contendo a cultura logo após a retirada da 
tampa (retirar a tampa “abraçando” com o dedinho);
• Retirar a amostra com a alça e flambar a boca do tubo novamente, antes de 
fechar;
• Semear de acordo com as técnicas (estrias, esgotamento etc.).
• Observar os crescimentos após tempo de incubação.
Resultados
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Prática 3 – Coleta e Amostragem 
Materiais
• Placa de Petri, com meio de cultura ágar enriquecido;
• Placa com meio de cultura contendoantibiótico (ampicilina);
• Placa com meio de cultura contendo antifúngico (anfotericina);
• Swabs para coleta em ambiente (umidificado em solução fisiológica);
• Alças para semeadura;
• Bico de Bunsen.
Procedimento
• Dividir a turma em grupos de modo que cada grupo colete amostras em locais 
diferentes (maçanetas de portas, celulares, teclados de computadores, notas de 
dinheiro, sola do sapato, entre os dedos da mão etc.);
• Deixar uma das amostras aberta (ao ar, durante o período da coleta);
• Identificar as placas (com o nome do grupo e o número da amostra);
• Para realizar a semeadura, utilizar os próprios swabs de coleta;
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• Incubar as placas a 30°C até a próxima aula;
• Verificar o crescimento das colônias a olho nu.
Resultados
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_______________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
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Observação
A critério do professor, essas culturas podem ser utilizadas para fazer a colora-
ção de Gram.
Prática 4 – Coloração de Gram
Materiais
• Solução de violeta genciana;
• Lugol;
• Solução álcool-acetona;
• Solução de fucsina diluída;
• Lâminas para microscopia;
• Placas com culturas bacterianas (pelo menos uma espécie Gram positiva e 
uma Gram negativa).
Procedimento
• Identificar as lâminas com as amostras que serão utilizadas; 
• Realizar o esfregaço e deixar secar;
• Cobrir o esfregaço com o corante Violeta de genciana e aguardar 1 minuto;
• Escorrer o corante da lâmina (não precisa lavar) e adicionar solução de lu-
gol, também em quantidade suficiente para cobrir o esfregaço e aguardar 
mais 1 minuto;
• Escorrer o lugol da lâmina e lavar com água (sem esfregar a lâmina);
• Adicionar sobre a lâmina gota a gota, a solução de álcool-acetona para desco-
rar, por 15 segundos;
• Pingar na lâmina e deixar escorrer sobre o esfregado. Não pingar direto 
no esfregado;
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UNIDADE Introdução à Microbiologia
• Adicionar o corante de fucsina sobre o esfregado e aguardar mais 1 minutos;
• Lavar a lâmina com água corrente e secar com papel filtro (não esfregar a lâ-
mina com o papel, somente colocar suavemente o papel ao lado do esfregaço 
para que ele absorva o excesso de água;
• Aguardar secar e visualizar o material em microscópio ótico. 
Resultados
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Responda
1 – Qual a diferença entre uma bactéria Gram positiva e uma Gram negativa?
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2 – Qual a importância clínica da identificação das bactérias pela técnica de Gram?
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Prática 5 – Identificação de bactérias através de testes 
bioquímicos (PADILLA, 2017)
Estas técnicas são utilizadas como método diagnóstico para enterobactérias, 
para diferenciar microrganismos da mesma família, porém de gêneros distintos.
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Sugere-se a utilização de microrganismos do gênero Enterobacteriaceae
(Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Shigella, Salmonella e Proteus), 
porém, a quantidade de testes, bem como a escolha dos microrganismos fica a cri-
tério do professor.
Materiais
• Placa com o meio TSA;
• Placa MacConkey;
• Tubo com meio EPM;
• Tubo com meio MILI;
• Tubo com meio Citrato;
• Culturas pré-determinadas pelo docente e identificadas por números;
• Alças bacteriológicas;
• Bico de Bunsen;
• Reativo de Kovac (dimetilaminobenzaldeído).
Procedimento
Parte 1
• Com a alça bacteriológica, tocar em uma colônia e inoculá-la na placa 
MacConkey (estriar para isolar colônias);
• Tocar em uma colônia com a agulha e perfurar o meio MILI (não encostar no 
fundo do tubo);
• Flambar a alça e repetir o mesmo procedimento para o meio EPM (por estrias 
na superfície do tubo);
• Estriar uma colônia na superfície inclinada do meio contendo CITRATO;
• Incubar por 24 h a 37ºC. 
Parte 2
• Realizar as leituras da série bioquímica dos resultados para identificação dos 
gêneros .
Agar MacConkey
• Indicador de bactérias fermentadoras de Lactose;
• Lactose positiva: cor vermelha;
• Lactose negativa: incolores .
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UNIDADE Introdução à Microbiologia
Meio EPM
• Os testes de produção de CO2, H2S e urease são verificados na base e teste 
para a enzima L-triptofanodesaminase a observação é na superfície do meio;
Teste de CO2
• Observa-se a presença de bolhas resultantes da fermentação da glicose;
• C6H12O6 → Etanol + CO2
gás;
• Prova positiva: base amarela com presença de bolhas de ar;
• Prova negativa: base amarela sem bolhas de ar.
Teste de H2S
• H2S Na2SO3 → H2S (reage com Fe dando coloração preta);
• Prova positiva: base preta;
• Prova negativa: base amarela ou inalterada.
Teste de urease
• As bactérias que sintetizam urease convertem a ureia em amônia e gás carbônico;
• Prova positiva: base azul;
• Prova negativa: base amarela ou inalterada. 
Teste de Triptofanodesaminase
• Prova positiva: superfície verde escuro;
• Prova negativa: superfície azulada, amarelada ou inalterada.
Meio de Mili (Motilidade, Indol e Lisina decarboxilase)
• Prova positiva (Motilidade): meio turvo; 
• Prova negativa (Motilidade): meio límpido ou crescimento só no local 
do inoculo;
• Prova positiva (Indol): coloração vermelha;
• Prova negativa (Indol): coloração amarela;
• Prova positiva (L-lisina descarboxilase): coloração roxa.
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Agar Citrato de Simmons
• A presença de bactérias que podem utilizar citrato como fonte de carbono mo-
dificam o meio de verde para azul (pH>7.5); 
• Prova positiva: coloração azul;
• Prova negativa: coloração do meio inalterada.
Resultados
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UNIDADE Introdução à Microbiologia
Orientações para Leitura Obrigatória
Desinfecção e esterilização. Disponível em: http://bit.ly/2H01vKr 
Segurança do paciente – Manual de Higienização das mãos. 
Disponivel em: http://bit.ly/36ZtC7a 
Manual de Coleta para exames microbiológicos do Hospital Universitário – Universida-
de Federal de Santa Catarina. Disponível em: http://bit.ly/2S2uWC6 
Procedimentos Laboratoriais: da Requisição do Exame à Análise Microbiológica e Laudo 
Final. Anvisa. Disponível em: http://bit.ly/2OA6QMO
Ex
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or
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Referências
BRASIL. Governo do Estado do Espírito Santo. Secretaria Estadual de Saúde, 
Laboratório Central de Saúde Pública. Manual de Biossegurança. Vitória: Lacen, 
2017. Disponível em: <https://saude.es.gov.br/Media/sesa/LACEN/Manuais/
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________. Ministério da Saúde. Comissão Técnica de Biossegurança da FIOCRUZ. 
Procedimento para manipulação de microrganismos patogênicos e/ou 
recombinates na FIOCRUZ. Rio de Janeiro: FIOCRUZ, 2005. 221p
DINIZ, C. G. Apostila da Universidade Federalde Juiz de Fora – Roteiro de 
Aulas Práticas de Bacteriologia, versão 02.2018. Disponível em: <http://www.ufjf.
br/Microbiologia/files/2013/05/ROTEIRO-PARA-AULAS-PR%C3%81TICAS-
bacteriologia-2018-vers%C3%A3o-02-2018.pdf >. Acesso em: nov. 2019.
PADILLA, G. Apostila de Aulas Práticas Microbiologia Básica para Farmácia
– BMM0160 – Diurno. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de 
Microbiologia. São Paulo: Universidade de São Paulo, 2017. Disponível em: 
 <https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/4101474/mod_resource/content/1/
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SALVATIERRA, C. M. Microbiolgoia – aspectos morfológicos, bioquímicos e 
metodológicos. São Paulo: Érica, 2014.
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