Clonagem de DNA

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Sabrina B 
 
 
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Pontos Principais: 
• Clonagem de DNA é uma técnica 
da biologia molecular para fazer 
muitas cópias idênticas de um 
pedaço de DNA, tal como um gene. 
• Num experimento típico de 
clonagem, um gene alvo é inserido 
num pedaço circular de DNA 
chamado do plasmídeo. 
• O plasmídeo é introduzido em 
bactérias através de um processo 
chamado transformação, e 
bactérias portadoras do plasmídeo 
são selecionadas utilizando-se 
antibióticos. 
• As bactérias com o plasmídeo 
correto são utilizadas para 
produzirem mais DNA do plasmídeo 
ou, em alguns casos, induzidas a 
expressar o gene e produzir 
proteína. 
Introdução 
Quando você ouve a palavra “clonagem,” 
você pode pensar na clonagem de um 
organismo inteiro, como a ovelha Dolly. 
Porém, o significado de clonar alguma 
coisa é fazer uma cópia geneticamente 
exata dela. Num laboratório de genética 
molecular, o que é clonado com maior 
frequência é um gene ou um pequeno 
pedaço de DNA. 
Se sua amiga bióloga molecular disser 
que sua "clonagem" não está 
funcionando, ela quase certamente estará 
falando acerca da cópia de pedaços de 
DNA, não de estar fazendo a próxima 
Dolly! 
Visão geral da 
clonagem de DNA 
Clonagem de DNA é o processo de fazer 
várias cópias idênticas de um pedaço 
específico de DNA. Num procedimento 
típico de clonagem de DNA, o gene ou 
outro fragmento de DNA de interesse 
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(talvez um gene para uma proteína 
humana de interesse médico) é 
primeiramente inserido numa peça 
circular de DNA chamada plasmídeo. A 
inserção é feita utilizando-se enzimas que 
“cortam e colam” DNA, e produz uma 
molécula de DNA recombinante, ou seja, 
DNA montado a partir de fragmentos de 
várias fontes. 
 
Diagrama mostrando a construção de 
uma molécula de DNA recombinante. Um 
pedaço circular de DNA plasmidial tem 
saliências em suas extremidades, que 
coincidem com os de um fragmento do 
gene. Plasmídeo e fragmento de gene são 
unidos para produzir um plasmídeo que 
contém o gene. Esse plasmídeo com o gene 
é um exemplo de DNA recombinante, ou 
de uma molécula de DNA montada a partir 
de DNA de várias fontes. 
Em seguida o plasmídeo recombinante é 
introduzido em bactérias. As bactérias 
contendo plasmídeo são selecionadas e 
cultivadas. Conforme elas se reproduzem, 
replicam o plasmídeo e o transmitem para 
seus descendentes, produzindo cópias do 
DNA que ele contém. 
Qual a finalidade de produzir várias 
cópias de uma sequência de DNA num 
plasmídeo? Em alguns casos, precisamos 
de muitas cópias de DNA para realizar 
experimentos ou construir novos 
plasmídeos. Em outros, o pedaço de DNA 
codifica uma proteína útil, e as bactérias 
são usadas como "fábricas" para 
produção dessa proteína. Por exemplo, o 
gene da insulina humana é expresso em 
bactérias E. coli para produzir a insulina 
usada pelos diabéticos. 
Etapas da clonagem do 
DNA 
A clonagem do DNA é utilizada para várias 
finalidades.Como exemplo, vejamos como 
a clonagem do DNA pode ser utilizada 
para sintetizar uma proteína (como a 
insulina humana) nas bactérias. As 
etapas básicas são: 
1. Cortar e abrir o plasmídeo e 
"inserir" o gene. Esse processo 
baseia-se em enzimas de restrição 
(que cortam o DNA) e na DNA ligase 
(que une/cola o DNA). 
2. Inserir o plasmídeo na bactéria. 
Utilizar a seleção por antibiótico 
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para identificar as bactérias que 
pegaram o plasmídeo. 
3. Cultivar lotes de bactérias 
portadoras de plasmídeo e usá-las 
como "fábricas" para fazer a 
proteína. Colher a proteína das 
bactérias e purificá-la. 
Vamos dar uma olhada mais detalhada 
em cada etapa. 
1. Cortando e colando 
DNA 
Como pedaços de DNA de diferentes 
fontes podem ser unidos? Um método 
comum utiliza dois tipos de 
enzimas: enzimas de restrição e DNA 
ligase. 
Um enzima de restrição é uma enzima 
cortadora de DNA que reconhece uma 
sequência alvo específica e corta o DNA 
em dois pedaços neste sítio ou próximo a 
ele. Muitas enzimas de restrição 
produzem extremidades cortadas com 
saliências curtas de fita simples. Se duas 
moléculas tiverem saliências 
correspondentes, elas podem parear 
bases e permanecer juntas. Contudo, elas 
não irão se combinar para formar uma 
molécula de DNA intacta até que sejam 
unidas pelo DNA ligase, que sela as 
lacunas do eixo do DNA. 
Nossa meta na clonagem é inserir um 
gene alvo (p.e., para insulina humana) 
num plasmídeo. Usando uma enzima de 
restrição cuidadosamente escolhida, 
digerimos: 
• O plasmídeo, que tem um único 
local de corte 
• O fragmento do gene alvo, que tem 
um sítio de restrição (de corte) 
próximo a cada extremidade 
Então, combinamos os fragmentos com 
DNA ligase, que os une para fazer um 
plasmídeo recombinante contendo o gene. 
 
Diagrama mostrando a digestão da 
restrição e a ligação num esquema 
simplificado. 
Começamos com um plasmídeo 
bacteriano circular e um gene alvo. Nas 
duas extremidades do gene alvo estão os 
sítios de restrição, ou sequências de DNA 
reconhecidas por uma enzima de restrição 
particular. No plasmídeo, também há um 
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sítio de restrição reconhecido pela mesma 
enzima, logo após um promotor que vai 
conduzir a expressão nas bactérias 
Tanto o plasmídeo e o gene alvo 
(separadamente) são digeridos com a 
enzima de restrição. Os fragmentos são 
purificados e combinados. Eles têm 
"extremidades", ou saliências de DNA de 
fita simples, correspondentes, assim eles 
podem ficar juntos. 
A enzima DNA ligase une os fragmentos 
com extremidades correspondentes para 
formar uma única molécula de DNA 
íntegra. Isto produz um plasmídeo 
recombinante que contém o gene alvo. 
2. Transformação e 
seleção bacteriana 
Os plasmídeos e outros DNA podem ser 
introduzidos nas bactérias, como as 
inofensivas E. coli utilizadas em 
laboratório, num processo 
chamado transformação. Durante 
a transformação, é dado um choque (por 
exposição a alta temperatura, por 
exemplo) a células bacterianas 
especialmente preparadas que as 
encoraja a incorporar DNA estranho. 
 
O DNA produzido por ligação (que pode 
ser de uma mistura dos plasmídeos 
desejados, de plasmídeos secundários e 
de pedaços lineares de DNA) é adicionado 
às bactérias. As bactérias são submetidas 
a um choque térmico, que as torna mais 
aptas a incorporar o DNA por 
transformação. No entanto, apenas uma 
pequena minoria das bactérias vai ter 
sucesso em pegar um plasmídeo. 
Um plasmídeo geralmente tem um gene 
de resistência aos antibióticos, que 
permite que as bactérias sobrevivam na 
presença de um antibiótico específico. 
Assim, as bactérias portadoras de 
plasmídeo podem ser selecionadas em 
placas com nutrientes contendo o 
antibiótico. As bactérias sem plasmídeo 
morrerão, enquanto bactérias portadoras 
de plasmídeo podem viver e reproduzir-se. 
Cada bactéria sobrevivente dará origem a 
um grupo pequeno, como um ponto, 
ou colônia, de bactérias idênticas em que 
todas carregam o mesmo plasmídeo. 
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Painel esquerdo: Diagrama do plasmídeo, 
mostrando que ele contém um gene de 
resistência aos antibióticos. 
Painel direito: todas as bactérias da 
transformação são colocadas numa placa 
de antibiótico. As bactérias sem plasmídeo 
morrerão devido o antibiótico. Cada 
bactéria com um plasmídeo forma uma 
colônia, ou um grupo de bactérias clonais 
em que todas contêm o mesmo plasmídeo. 
Uma colônia típica se parece com um 
pequeno ponto esbranquiçado do 
tamanho de uma cabeça de alfinete. 
Nem todas as colônias irão 
necessariamente conter o plasmídeo 
certo. Isso acontece porque, durante uma 
ligação, fragmentos de DNA nem sempre 
ficam "colados" exatamente da maneira 
que queremos. Em vez disso, devemos 
coletar o DNA de várias colônias e ver se 
cada uma contém o plasmídeo certo. 
Métodos como digestão por enzima de 
restriçãoe PCR/RCP são comumente 
usados para checar os plasmídeos. 
3. Produção de proteína 
Uma vez que encontramos uma colônia de 
bactérias com o plasmídeo certo, podemos 
cultivar uma grande cultura de bactérias 
portadoras do plasmídeo. Nesse 
momento, damos às bactérias um sinal 
químico que as instrui a produzir a 
proteína alvo. 
As bactérias servem como mini "fábricas," 
produzindo grandes quantidades de 
proteína. Por exemplo, se nosso 
plasmídeo continha o gene da insulina 
humana, as bactérias começariam a 
transcrição do gene e a tradução do RNAm 
para produzir muitas moléculas da 
proteína insulina humana. 
 
Uma colônia selecionada é cultivada em 
uma cultura grande (por exemplo, um 
frasco de 1 litro). As bactérias na cultura 
grande são induzidas a expressar o gene 
contido no plasmídeo, fazendo com que o 
gene seja transcrito em RNAm e o RNmA 
seja traduzido em proteínas. A proteína 
codificada pelo gene acumula-se dentro 
das bactérias. 
Uma vez que a proteína tenha sido 
produzida, as células bacterianas podem 
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ser abertas para liberá-la. Existem muitas 
outras proteínas e macromoléculas 
flutuando nas bactérias além da proteína 
alvo (por exemplo, a insulina). Devido a 
isso, a proteína alvo deve ser purificada, 
ou separada dos outros conteúdos das 
células por técnicas bioquímicas. A 
proteína purificada pode ser usada para 
experimentos ou, no caso de insulina, 
administrada aos pacientes. 
Usos da clonagem de DNA 
As moléculas de DNA construídas a partir 
de técnicas de clonagem são utilizadas 
para vários propósitos em biologia 
molecular. Uma curta lista de exemplos 
inclui: 
• Biofarmacêuticos. A clonagem do 
DNA pode ser usada para produzir 
proteínas humanas com aplicações 
biomédicas, como a insulina 
mencionada acima. Outros 
exemplos de proteínas 
recombinantes incluem o hormônio 
do crescimento humano, que é 
ministrado a pacientes incapazes 
de sintetizá-lo, e o ativador de 
plasminogênio tecidual, que é 
usado para tratar derrames e 
prevenir coágulos sanguíneos. 
Proteínas recombinantes como 
estas. frequentemente são 
produzidas em bactérias. 
• Terapia genética. Em algumas 
desordens genéticas, os pacientes 
não possuem a forma funcional de 
um gene particular. A terapia 
genética tenta fornecer uma cópia 
normal do gene para as células do 
corpo do paciente. Por exemplo, a 
clonagem do DNA foi usada para 
construir plasmídeos com uma 
versão normal do gene que é não 
funcional na fibrose cística. 
Quando os plasmídeos foram 
liberados nos pulmões dos 
pacientes com fibrose cística, a 
função pulmonar deteriorou menos 
rapidamente. 
• Análise genética. Em laboratórios 
de pesquisa básica, os biólogos 
geralmente usam a clonagem de 
DNA para construir versões 
artificiais, recombinantes dos genes 
que os ajudam a compreender como 
é a função normal dos genes num 
organismo.