CLONAGEM DE DNA

Prévia do material em texto

CLONAGEM DE DNA
Pontos Principais:
· Clonagem de DNA é uma técnica da biologia molecular para fazer muitas cópias idênticas de um pedaço de DNA, tal como um gene.
· Num experimento típico de clonagem, um gene alvo é inserido num pedaço circular de DNA chamado do plasmídeo.
· O plasmídeo é introduzido em bactérias através de um processo chamado transformação, e bactérias portadoras do plasmídeo são selecionadas utilizando-se antibióticos.
· As bactérias com o plasmídeo correto são utilizadas para produzirem mais DNA do plasmídeo ou, em alguns casos, induzidas a expressar o gene e produzir proteína.
Introdução
Quando você ouve a palavra “clonagem,” você pode pensar na clonagem de um organismo inteiro, como a ovelha Dolly. Porém, o significado de clonar alguma coisa é fazer uma cópia geneticamente exata dela. Num laboratório de genética molecular, o que é clonado com maior frequência é um gene ou um pequeno pedaço de DNA.
Se o sua amiga bióloga molecular disser que sua "clonagem" não está funcionando, ela quase certamente estará falando acerca da cópia de pedaços de DNA, não de estar fazendo a próxima Dolly!
Visão geral da clonagem de DNA
Clonagem de DNA é o processo de fazer várias cópias idênticas de um pedaço específico de DNA. Num procedimento típico de clonagem de DNA, o gene ou outro fragmento de DNA de interesse (talvez um gene para uma proteína humana de interesse médico) é primeiramente inserido numa peça circular de DNA chamada plasmídeo. A inserção é feita utilizando-se enzimas que “cortam e colam” DNA, e produz uma molécula de DNA recombinante, ou seja, DNA montado a partir de fragmentos de várias fontes.
Diagrama mostrando a construção de uma molécula de DNA recombinante. Um pedaço circular de DNA plasmidial tem saliências em suas extremidades, que coincidem com os de um fragmento do gene. Plasmídeo e fragmento de gene são unidos para produzir um plasmídeo que contém o gene. Esse plasmídeo com o gene é um exemplo de DNA recombinante, ou de uma molécula de DNA montada a partir de DNA de várias fontes.
Em seguida o plasmídeo recombinante é introduzido em bactérias. As bactérias contendo plasmídeo são selecionadas e cultivadas. Conforme elas se reproduzem, replicam o plasmídeo e o transmitem para seus descendentes, produzindo cópias do DNA que ele contém.
Qual a finalidade de produzir várias cópias de uma sequência de DNA num plasmídeo? Em alguns casos, precisamos de muitas cópias de DNA para realizar experimentos ou construir novos plasmídeos. Em outros, o pedaço de DNA codifica uma proteína útil, e as bactérias são usadas como "fábricas" para produção dessa proteína. Por exemplo, o gene da insulina humana é expresso em bactérias E. coli para produzir a insulina usada pelos diabéticos.
Etapas da clonagem do DNA
A clonagem do DNA é utilizada para várias finalidades. Como exemplo, vejamos como a clonagem do DNA pode ser utilizada para sintetizar uma proteína (como a insulina humana) nas bactérias. As etapas básicas são:
1. Cortar e abrir o plasmídeo e "inserir" o gene. Esse processo baseia-se em enzimas de restrição (que cortam o DNA) e na DNA ligase (que une/cola o DNA).
2. Inserir o plasmídeo na bactéria. Utilizar a seleção por antibiótico para identificar as bactérias que pegaram o plasmídeo.
3. Cultivar lotes de bactérias portadoras de plasmídeo e usá-las como "fábricas" para fazer a proteína. Colher a proteína das bactérias e purificá-la.
Vamos dar uma olhada mais detalhada em cada etapa.
1. Cortando e colando DNA
Como pedaços de DNA de diferentes fontes podem ser unidos? Um método comum utiliza dois tipos de enzimas: enzimas de restrição e DNA ligase.
Um enzima de restrição é uma enzima cortadora de DNA que reconhece uma sequência alvo específica e corta o DNA em dois pedaços neste sítio ou próximo a ele. Muitas enzimas de restrição produzem extremidades cortadas com saliências curtas de fita simples. Se duas moléculas tiverem saliências correspondentes, elas podem parear bases e permanecer juntas. Contudo, elas não irão se combinar para formar uma molécula de DNA intacta até que sejam unidas pelo DNA ligase, que sela as lacunas do eixo do DNA.
Nossa meta na clonagem é inserir um gene alvo (p.e., para insulina humana) num plasmídeo. Usando uma enzima de restrição cuidadosamente escolhida, digerimos:
· O plasmídeo, que tem um único local de corte
· O fragmento do gene alvo, que tem um sítio de restrição (de corte) próximo a cada extremidade
Então, combinamos os fragmentos com DNA ligase, que os une para fazer um plasmídeo recombinante contendo o gene.
Diagrama mostrando a digestão da restrição e a ligação num esquema simplificado.
Começamos com um plasmídeo bacteriano circular e um gene alvo. Nas duas extremidades do gene alvo estão os sítios de restrição, ou sequências de DNA reconhecidas por uma enzima de restrição particular. No plasmídeo, também há um sítio de restrição reconhecido pela mesma enzima, logo após um promotor que vai conduzir a expressão nas bactérias
Tanto o plasmídeo e o gene alvo (separadamente) são digeridos com a enzima de restrição. Os fragmentos são purificados e combinados. Eles têm "extremidades", ou saliências de DNA de fita simples, correspondentes, assim eles podem ficar juntos.
A enzima DNA ligase une os fragmentos com extremidades correspondentes para formar uma única molécula de DNA íntegra. Isto produz um plasmídeo recombinante que contém o gene alvo.
2. Transformação e seleção bacteriana
Os plasmídeos e outros DNA podem ser introduzidos nas bactérias, como as inofensivas E. coli utilizadas em laboratório, num processo chamado transformação. Durante a transformação, é dado um choque (por exposição a alta temperatura, por exemplo) a células bacterianas especialmente preparadas que as encoraja a incorporar DNA estranho.
O DNA produzido por ligação (que pode ser de uma mistura dos plasmídeos desejados, de plasmídeos secundários e de pedaços lineares de DNA) é adicionado às bactérias. As bactérias são submetidas a um choque térmico, que as torna mais aptas a incorporar o DNA por transformação. No entanto, apenas uma pequena minoria das bactérias vai ter sucesso em pegar um plasmídeo.
[Por que um choque de calor faz bactérias incorporarem DNA?]
^1start superscript, 1, end superscript
Um plasmídeo geralmente tem um gene de resistência aos antibióticos, que permite que as bactérias sobrevivam na presença de um antibiótico específico. Assim, as bactérias portadoras de plasmídeo podem ser selecionadas em placas com nutrientes contendo o antibiótico. As bactérias sem plasmídeo morrerão, enquanto bactérias portadoras de plasmídeo podem viver e reproduzir-se. Cada bactéria sobrevivente dará origem a um grupo pequeno, como um ponto, ou colônia, de bactérias idênticas em que todas carregam o mesmo plasmídeo.
Painel esquerdo: Diagrama do plasmídeo, mostrando que ele contém um gene de resistência aos antibióticos.
Painel direito: todas as bactérias da transformação são colocadas numa placa de antibiótico. As bactérias sem plasmídeo morrerão devido o antibiótico. Cada bactéria com um plasmídeo forma uma colônia, ou um grupo de bactérias clonais em que todas contêm o mesmo plasmídeo. Uma colônia típica se parece com um pequeno ponto esbranquiçado do tamanho de uma cabeça de alfinete.
Nem todas as colônias irão necessariamente conter o plasmídeo certo. Isso acontece porque, durante uma ligação, fragmentos de DNA nem sempre ficam "colados" exatamente da maneira que queremos. Em vez disso, devemos coletar o DNA de várias colonias e ver se cada uma contém o plasmídeo certo. Métodos como digestão por enzima de restrição e PCR/RCP são comumente usados para checar os plasmídeos.
3. Produção de proteína
Uma vez que encontramos uma colonia de bactérias com o plasmídeo certo, podemos cultivar uma grande cultura de bactérias portadoras do plasmídeo. Nesse momento, damos às bactérias um sinal químico que as instrui a produzir a proteína alvo.
As bactérias servem como mini "fábricas," produzindo grandes quantidades de proteína. Por exemplo, se nosso plasmídeo continha o gene dainsulina humana, as bactérias começariam a transcrição do gene e a tradução do RNAm para produzir muitas moléculas da proteína insulina humana. 
Uma colônia selecionada é cultivada em uma cultura grande (por exemplo, um frasco de 1 litro). As bactérias na cultura grande são induzidas a expressar o gene contido no plasmídeo, fazendo com que o gene seja transcrito em RNAm e o RNmA seja traduzido em proteínas. A proteína codificada pelo gene acumula-se dentro das bactérias.
Uma vez que a proteína tenha sido produzida, as células bacterianas podem ser abertas para liberá-la. Existem muitas outras proteínas e macromoléculas flutuando nas bactérias além da proteína alvo (por exemplo, a insulina). Devido a isso, a proteína alvo deve ser purificada, ou separada dos outros conteúdos das células por técnicas bioquímicas. A proteína purificada pode ser usada para experimentos ou, no caso de insulina, administrada aos pacientes.
Usos da clonagem de DNA
As moléculas de DNA construídas a partir de técnicas de clonagem são utilizadas para vários propósitos em biologia molecular. Uma curta lista de exemplos incluem:
· Biofarmacêuticos. A clonagem do DNA pode ser usada para produzir proteínas humanas com aplicações biomédicas, como a insulina mencionada acima. Outros exemplos de proteínas recombinantes incluem o hormônio do crescimento humano, que é ministrado a pacientes incapazes de sintetizá-lo, e o ativador de plasminogênio tecidual (tPA/ APt), que é usado para tratar derrames e prevenir coágulos sanguíneos. Proteínas recombinantes como estas. Frequentemente são produzidas em bactérias.
· Terapia genética. Em algumas desordens genéticas, os pacientes não possuem a forma funcional de um gene particular. A terapia genética tenta fornecer uma cópia normal do gene para as células do corpo do paciente. Por exemplo, a clonagem do DNA foi usada para construir plasmídeos com uma versão normal do gene que é não funcional na fibrose cística. Quando os plasmídeos foram liberados nos pulmões dos pacientes com fibrose cística, a função pulmonar deteriorou menos rapidamente^22start superscript, 2, end superscript.
· Análise genética. Em laboratórios de pesquisa básica, os biólogos geralmente usam a clonagem de DNA para construir versões artificiais, recombinantes dos genes que os ajudam a compreender como é a função normal dos genes num organismo. 
[Veja um exemplo]
Estes são apenas alguns exemplos de como a clonagem de DNA é usada atualmente na biologia. A clonagem de DNA é uma técnica muito comum usada numa enorme variedade de aplicações de biologia molecular.
Este artigo está autorizado sob licença CC BY-NC-SA 4.0. Referências:
1. Superbest. (2014, June 11). How does heat shock transformation work? In Biology stack exchange. Disponível em http://biology.stackexchange.com/questions/19038/how-does-heat-shock-transformation-work.
2. Alton, E. W. F. W., Armstrong, D. K., Ashby, D., Bayfield, K. J., Bilton, Diana, Bloomfield, E. V., ... Wolstenholme-Hogg, P. (2015). Repeated nebulisation of non-viral CFTR gene therapy in patients with cystic fibrosis: A randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2b trial. Lancet Respiratory Medicine, 3(9), 684-691. http://dx.doi.org/10.1016/S2213-2600(15)00245-3.
Outras referências:
Affibody. (n.d.). Insulin capture from human serum. Disponível em http://affibody.com/upload/Research%20Reagents/Application%20notes/Insulin%20AFF%20application%20note%202007-03-30.pdf.
Amgen Biotech Experience. (2015). Student guide. Disponível em https://www.amgenbiotechexperience.com/sites/abe.edc.org/files/abe_english_student_all_sequences_05.15.15.pdf.
Biotechnology. (23 de março de 2016). Acesso em 29 de março de 2016 em Wikipedia: https://en.wikipedia.org/wiki/Biotechnology.
Gebel, E. (2013). Making insulin: A behind-the-scenes look at producing a lifesaving medication. In Diabetes forecast. Disponível em http://www.diabetesforecast.org/2013/jul/making-insulin.html?referrer=https://www.google.com/.
Gene therapy breakthrough for cystic fibrosis. (2015, July 3). In NHS choices. Disponível em http://www.nhs.uk/news/2015/07July/Pages/Gene-therapy-breakthrough-for-cystic-fibrosis.aspx.
R&D Systems. (2016). Recombinant human growth hormone (GH) protein. In Growth hormone. Disponível em https://www.rndsystems.com/products/recombinant-human-growth-hormone-gh-protein_1067-gh.
Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., and Jackson, R. B. (2011). DNA tools and biotechnology. Em Campbell biology(10th ed., pp. 408-435). San Francisco, CA: Pearson.
Wilkin, D. (2016, March 23). Gene cloning - advanced. In CK-12 biology advanced concepts. Disponível em http://www.ck12.org/book/CK-12-Biology-Advanced-Concepts/section/9.2/.