Técnicas de Diagnóstico molecular

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TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 
MOLECULAR 
Técnicas moleculares: 
• Barateamento com o tempo; 
• Extração de material genético; 
• PCR; 
• Eletroforese em gel de agarose/oliacrilamida; 
• Clivagem com endonucleases de restrição; 
• Hibridização; 
• Clonagem – de proteínas, enzimas; 
• Sequenciamento – analisar variantes; 
• Imunoprecipitação de cromatina; 
• MALDI-TOF – análise de proteínas; 
PCR 
• Essencial para várias técnicas; 
• Reação em cadeia da polimerase; 
• Repete a duplicação de DNA in vitro; 
• Componentes: DNA, nucleotídeos, primers, 
polimerase, tubo de ensaio e tubo de PCR 
Desnaturação proteica via alterações de temperatura – 
abertura da fita para poder sintetizar; 
RT-PCR: pega possível RNA viral e se tiver molde, 
conseguem detectar via continuidade da replicação 
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 
Migração de moléculas ionizadas utilizando suas cargas 
e pesos moleculares em campos elétricos 
• Carga negativa – vai para polo positivo 
• Carga positiva – vai para o polo negativo 
- Fragmentos de DNA carregado negativamente: vai da 
E→D 
Fragmentos maiores: deslocam mais rápido; 
SDS-PAGE 
SDS-PAGE 
Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS 
É um tipo de eletroforese em proteínas. Nesse caso, 
induz a eletricidade nas moléculas artificialmente; 
Diagnóstico de HIV; 
ELETROFORESE BIDIMENSIONAL 
Proteínas marcadas por western blot ou immunoblot 
• Proteínas separadas por seus pontos isoelétricos 
por focalização isoelétrica - horizontalmente 
• Proteínas baseadas por cargas e por pontos 
isoelétricos; 
• Separadas no gel, onde ficam marcadas e cada 
ponto é uma cadeia polipeptídica diferente; 
• Ex.: bactérias cultivadas por mistura de 
aminoácidos e marcadas com radioisótopos – 
proteínas ficam radioativas e são detectadas por 
autorradiografia 
CLIVAGEM C/ ENDONUCLEASE DE RESTRIÇÃO 
Diferentes enzimas que cortam regiões diferentes a 
partir do reconhecimento de sítios; 
Podem gerar moléculas de extremidades cegas – blunt 
ends ou extremidades coesivas 5’ e 3’ 
Os fragmentos podem ser utilizados para construção 
de células, terapia gênica; 
Obtenção de órgãos que evitem rejeição do corpo; 
Facilitam manipulação do DNA 
HIBRIDIZAÇÃO 
Sequências simples fita de material que sejam 
especificas ou complementares a bases; 
Pareamento de fita simples com sequências 
complementares; 
Utiliza-se sondas marcadas com fluoróforos ou 
enzimas 
Utilizadas para marcar sequências de ácidos nucleicos 
Marcação em Southern blot ou Nothern blot 
Diagnóstico: Busca por polimorfismos específicos ou 
busca por patógenos em materiais; 
Análise de transcriptoma – microarray 
Existem testes que utilizam diversas sequências para 
observar polimorfismos de câncer, patógenos diversos; 
Shouthern blot os fragmentos de DNA são gerados por 
meio da digestão de molécula de DNA por enzima de 
restrição. Esses fragmentos são colocados em gel 
agarose, ficando corados e podendo ser possível 
observar os padrões de fragmentos 
Microarranjos: são colocados pequenos segmentos de 
DNA codificantes de um único gene; analisam 
polimorfismos e níveis de expressão de transcritos; 
CLONAGEM: 
Criação de biofármacos, por exemplo, a partir de 
sequências de células bacterianas, vegetais, animais. 
Essas sequências são conjugadas com sequências 
promotoras, forçando a célula a produzir a proteína 
que desejar. Após isso, a proteína é purificada e pode 
ser utilizada. 
Produção de grandes quantidades de proteína por 
meio de uma sequência de DNA que codifica proteína 
clonada em vetores de expressão e induzidas por 
células 
Inserção de plasmídios em bactérias, leveduras, 
insetos, mamíferos → gene inserido é transcrito e 
traduzido 
Caso o gene superexpresso não possui íntrons: clonado 
via DNA genômico por PCR 
Pode ser obtido via cDNA também; 
Insulina: existem diversas, podendo utilizar em 
diferentes fases do dia para que seja possível controlar 
em diferentes condições do dia; 
C-DNA 
Biblioteca de DNA; 
Coleção de moléculas de DNA clonadas, representando 
o genoma inteiro (biblioteca genômica) ou cópias de 
DNA complementar a partir do mRNA produzido por 
uma célula (biblioteca de cDNA). 
Mais fácil de trabalhar do que cromossomos inteiros; 
cDNA: DNA complementar – só o que foi transcrito; 
Como é feita: clivagem do DNA genômico em pequenos 
pedaços por meio de nuclease de restrição (ou corte 
mecânico do DNA) + ligação da coleção inteira dos 
fragmentos de DNA em vetores plasmidiais 
Plasmídios recombinantes são inseridos na E.coli 
SEQUENCIAMENTO 
Contigs: alinhamento de pequenas sequências 
Cadeias diversas sequenciadas na presença de 
didesoxinucleotídeos 
Usados para determinar a sequência de nucleotídeos 
de vários genomas (E. coli, moscas-das-frutas, vermes 
nematódeos, camundongos e humanos) 
IMUNOPRECIPITAÇÃO DA CROMATINA 
Determinação de sequências cis reguladoras do 
genoma ocupadas por reguladores transcricionais 
1. Proteínas covalentemente ligadas ao DNA em 
células vivas 
2. Lise celular 
3. DNA quebrado – fragmentado 
4. Anticorpos são direcionados contra reguladores 
transcricionais → usados na purificação do DNA 
5. O DNA é sequenciado 
6. Determinação dos fragmentos precipitados por 
meio de comparação com a sequência completa 
Pode identificar regulador-chave da transcrição 
responsável por determinar padrão da expressão 
gênica 
MALDI-TOF 
Ionização e dessorção a laser assistida por matriz 
As proteínas são clivadas em peptídeos menores pela 
tripsina (protease); 
Esses peptídeos são misturados com um ácido orgânico 
e então colocados para secar sobre uma lâmina de 
metal ou cerâmica; 
Disparo de laser; 
Nuvem gasosa de peptídeos ionizados; 
Análise dos peptídeos ionizados que carregam uma 
única carga, determinação das suas massas; 
Essa informação é utilizada para analisar bancos de 
dados nos quais as massas de todas as proteínas e de 
todos os seus fragmentos peptídicos preditos foram 
organizadas a partir de sequências genômicas do 
organismo; 
Diagnósticos moleculares 
• Doenças infecciosas e parasitárias; 
• Erros inatos do metabolismo; 
• Doenças hematológicas e imunológicas; 
• Alterações cromossômicas; 
INFECÇÕES E PARASITAS 
Pesquisa básica; Epidemiologia; Diagnóstico lab 
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR 
• Análise de surtos; 
• Análise de variabilidade genética; 
- RFLP, PFGE, MLVA e MLP, MLST, WGS 
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL CONVENCIONAL 
Espécies fenotipicamente semelhantes; 
Crescimento lento, fastidiosos ou não cultiváveis, 
tecidos com microbiota, reações cruzadas; 
Janela imunológica; 
Tempo de crescimento do patógeno; 
DIAGNÓSTICO LAB TÉCNICAS MOLECULARES 
• Rápidas; 
• Específicas; 
• Sensíveis; 
• Podem dispensar cultura; 
• Alto custo – lab de referências e pesquisas 
• Cepas específicas 
• Genes de resistência 
• Diminuição da janela diagnóstica: não depende da 
resposta imune 
Ampliação de material genético: primers específicos 
(PCR, qPCR, RT-PCR) 
Hibridização de ácidos nucleicos: microarraay, 
hibridização in situ, sondas de material genético 
Sequenciamento de DNA: sequenciamento de 16s e 
outras regiões – primers não específicos 
Análise de proteínas: MALDI-TOF 
PCR: é capaz de identificar presença de genoma viral 
em amostras de sangue; 
• Capacidade de amplificar o sinal de uma única 
molécula de ác nucleico; 
• Sensível para detectar traços de vírus em tecidos – 
não necessita de purificar o vírus 
DOENÇAS HEMATOLÓGICAS 
• Diagnóstico diferencial 
• Prognóstico e tratamento 
Análise de mutações: como talassemias, doenças da 
Hb H, anemia falciforme, policetemia vera, hemofilias; 
Análise de genes de fusão: BCR-ABL, cromossomo 
Philadelphia – leucemia 
DOENÇAS IMUNOLÓGICAS 
• Diagnóstico diferencial 
• Tratamento e prognóstico 
• Análise de mutações 
• Doenças autoimunes 
• Erros inatos de imunidade – imunodeficiências 
primárias 
ALTERAÇÕES CROMOSSÔMICAS 
• Citogenética; 
• Número e estrutura dos cromossomos; 
• Insucessos reprodutivos,malformações 
congênitas, deficiência motora e atraso intelectual; 
• Rearranjos: tumores sólidos e leucemias; 
• Citogenética; 
• Hibridização in situ fluorescente – FISH 
• Hibridização genômica comparativa 
• CGH array 
HIBRIDIZAÇÃO IN SITU (FISH) 
Sondas gene-específicas ou lócus-específicas 
Presença, ausência ou localização de um gene em 
particular 
Uso de células em metáfase ou interfase 
Diagnóstico de deleções específicas, duplicações ou 
rearranjos 
Diferentes fluorocromos para marcação das sondas e 
detecção múltiplos loci ao mesmo tempo 
HIBRIDIZAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA 
GHC 
Alterações genéticas numéricas, não balanceadas 
Análise de perdas e ganhos em tumores 
Não detecta translocações se houver número de cópias 
normal dos fragmentos rearranjados 
Marcação de DNA teste com um fluoróforo e DNA 
referência com outro – hibridização dos DNAs e análise 
dos desequilíbrios 
Comparação de perdas e ganhos de regiões 
cromossômicas em relação a uma referência 
CGH ARRAY 
Hibridização em microarray 
Análise do genoma de modo abrangente - lâminas 
contendo uma representação completa do genoma 
Resolução de aberrações cromossômicas complexas 
A análise global de alterações genômicas, identificação 
de aberrações em genes específicos 
Não detecta translocações se houver número de cópias 
normal 
Detecta pequenas variações, que não constituem 
patologias 
APLICAÇÕES DA CITOGENÉTICA 
Diagnóstico em genética humana - pediatria, 
endocrinologia, hematologia, neurologia, ginecologia, 
obstetrícia e outras 
Diagnóstico pré-natal ou pré-implantacional de 
aneuploidias 
Diagnóstico de amplificações e deleções gênicas em 
neoplasias hematológicas e tumores sólidos 
Diagnóstico de microdeleções 
ERROS INATOS DO METABOLISMO 
• Doenças geneticamente determinadas 
• Raras: 10% das genéticas 
• Teste do pezinho 
• Triagens metabólicas e ensaios enzimáticos 
• Técnicas moleculares 
Aula UNIRV: Prof Heliara Spina 
Referências: Biologia Molecular – ALBERTS;