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Autor: Prof. Francisco Benedito Kuchinski Colaboradores: Profa. Fernanda Torello de Mello Prof. Fábio Mesquita do Nascimento Citologia Professor conteudista: Francisco Benedito Kuchinski Francisco Benedito Kuchinski, nascido em 1946, em São Paulo – SP, graduado em 1972 em Ciências Biológicas pela Universidade de Mogi das Cruzes (UMC), portador de três especializações em Ciências Morfológicas pelas Universidades: de Brasília (UnB), de Mogi das Cruzes (UMC) e Brás Cubas (UBC). Doutor em Ciências (Histologia) pela Universidade Mackenzie. Professor de Ciências Físicas e Biológicas do Ensino Fundamental e de Biologia do Ensino Médio, nas escolas e colégios estaduais do governo do estado de São Paulo (1969/1978). No ambiente universitário, é coordenador de cursos da área da saúde (UMC, Uniararas, Faculdades Integradas de Guarulhos) e como docente universitário, das disciplinas de Citologia, Histologia e Embriologia, desde o ano de 1973. Professor titular das Faculdades de Guarulhos (FG) (1980/2013). Professor assistente, adjunto e titular dos cursos de Medicina, Odontologia, Ciências Biológicas e Ciências Biomédicas da UMC (1973/2003), professor assistente e titular dos cursos de Biologia, Biomédicas e Odontologia da Uniararas (1975/1998), professor da Universidade São Judas Tadeu nos cursos de Ciências Biológicas e Farmácia (1998/até a presente data), professor adjunto da Universidade Paulista – Unip, dos cursos de Odontologia, Medicina Veterinária, Ciências Biológicas e Ciências Biomédicas (1980/até a presente data). Material didático publicado: livro de Histologia Dental e Periodontal pela editora Graftipo, 8ª edição, 1998; Resumos e Apontamentos de Biologia Marinha/Oceanografia, v. 1, 2, 3 e 4, pela editora Graftipo, 2001; Glossário de Enfermagem, Editora Graftipo, 1980; Apontamentos de Citologia, Histologia e Embriologia/Laboratório, Editora Graftipo, 3ª edição, 1999; Resumos de Embriologia Animal, no Professor Online do curso de Medicina Veterinária da UNIP. Resumos de Citologia, Histologia e Embriologia e de Histologia Dental e Periodontal, no Professor Online do curso de Odontologia da UNIP. © Todos os direitos reservados. Nenhuma parte desta obra pode ser reproduzida ou transmitida por qualquer forma e/ou quaisquer meios (eletrônico, incluindo fotocópia e gravação) ou arquivada em qualquer sistema ou banco de dados sem permissão escrita da Universidade Paulista. Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) K95c Kuchinski, Francisco Benedito. Citologia. / Francisco Benedito Kuchinski. São Paulo: Editora Sol, 2020. 160 p. il. Nota: este volume está publicado nos Cadernos de Estudos e Pesquisas da UNIP, Série Didática, ISSN 1517-9230. 1. Citologia. 2. Constituição química. 3. Mitose e meiose. I. Título CDU 576.3 U507.07 – 20 Prof. Dr. João Carlos Di Genio Reitor Prof. Fábio Romeu de Carvalho Vice-Reitor de Planejamento, Administração e Finanças Profa. Melânia Dalla Torre Vice-Reitora de Unidades Universitárias Prof. Dr. Yugo Okida Vice-Reitor de Pós-Graduação e Pesquisa Profa. Dra. Marília Ancona-Lopez Vice-Reitora de Graduação Unip Interativa – EaD Profa. Elisabete Brihy Prof. Marcello Vannini Prof. Dr. Luiz Felipe Scabar Prof. Ivan Daliberto Frugoli Material Didático – EaD Comissão editorial: Dra. Angélica L. Carlini (UNIP) Dr. Ivan Dias da Motta (CESUMAR) Dra. Kátia Mosorov Alonso (UFMT) Apoio: Profa. Cláudia Regina Baptista – EaD Profa. Betisa Malaman – Comissão de Qualificação e Avaliação de Cursos Projeto gráfico: Prof. Alexandre Ponzetto Revisão: Virgínia Bilatto Amanda Casale Sumário Citologia APRESENTAÇÃO ......................................................................................................................................................7 INTRODUÇÃO ...........................................................................................................................................................7 Unidade I 1 CÉLULAS EUCARIÓTICAS: MÉTODOS DE ESTUDO E CONSTITUIÇÃO QUÍMICA ..........................9 2 CONSTITUIÇÃO QUÍMICA DA CÉLULA EUCARIÓTICA (CÉLULA TÍPICA) ...................................... 36 3 MEMBRANA PLASMÁTICA ........................................................................................................................... 40 3.1 Estrutura e constituição química................................................................................................... 40 3.2 Transportes (passagens) pela membrana plasmática ............................................................ 43 3.3 Especializações da membrana plasmática ................................................................................. 49 4 ORGANELAS CITOPLASMÁTICAS ............................................................................................................... 52 4.1 Retículo endoplasmático................................................................................................................... 52 4.2 Ribossomos ............................................................................................................................................. 54 4.3 Complexo de Golgi .............................................................................................................................. 57 4.4 Lisossomos............................................................................................................................................... 58 4.5 Peroxissomos .......................................................................................................................................... 61 4.6 Mitocôndrias .......................................................................................................................................... 61 Unidade II 5 MICROFILAMENTOS, MICROTÚBULOS E FILAMENTOS INTERMEDIÁRIOS................................. 80 6 INCLUSÕES E PIGMENTOS CELULARES .................................................................................................. 86 Unidade III 7 COMPONENTES DO NÚCLEO INTERFÁSICO .......................................................................................... 94 8 MITOSE E MEIOSE ..........................................................................................................................................108 7 APRESENTAÇÃO A citologia, também denominada nos dias atuais de biologia celular, abrange o estudo micromorfológico da estrutura dos seres vivos. Trata-se de uma ciência básica, que fornece diversos tipos de subsídios para outras ciências; portanto, é de suma importância. O conhecimento adequado sobre os microscópios, propicia a compreensão da diversidade química constituinte da célula, como meios para a identificação das organelas citoplasmáticas e dos componentes do núcleo celular, além das inclusões e dos pigmentos presentes no citoplasma ao nível da microscopia óptica. Ao término deste estudo, você deverá caracterizar os diferentes tipos celulares constituintes do ser humano, ter domínio dos processos citofisiológicos, reconhecer a importância da citologia para sua formação profissional e utilizar diversos aprendizados que propiciem a atualização na disciplina com reflexão ética, crítica e de aplicabilidade. INTRODUÇÃO Foi no século XIX que diversos pesquisadores iniciaram a descrição de conhecimentos sobre as células (Teoria Celular) e, até a presente data, novas descobertas são realizadas e descritas sobre a estrutura e função das células eucarióticas e procarióticas. O desenvolvimento científico em relação à ciência química e bioquímica, nas formulações de reagentes químicos para elucidar estrutura e funcionamento celular, foi e é preponderante, bem como novas tecnologias que a física desenvolveu, como os microscópios eletrônicos. Este material possui um texto didático dirigido primordialmente para fundamentação básica do estudante, isto é, para proporcionar uso racional de horas de estudo, permanência mais constante dosconhecimentos teóricos, facilidades nos conceitos citológicos. A organização deste conteúdo segue a sequência didática dos livros tradicionais de citologia/biologia celular, com atualizações, referendada com base nas normas da ABNT e com ênfase para o desenvolvimento de uma citologia educacional. Nosso estudo tem início com a apresentação dos diferentes tipos de classificações celulares, suas localizações e dimensões. Há um destaque especial para células-tronco. Em sequência, são apresentados os procedimentos técnicos para observação da constituição química da célula, bem como de tipos celulares e seus principais constituintes inorgânicos e orgânicos, além dos fundamentos básicos sobre microscopia óptica. Depois, o estudo torna-se específico sobre membrana plasmática, citoplasma, organelas citoplasmáticas e núcleo, bem como sobre os processos de reprodução celular em células somáticas e na elaboração dos gametas. Por fim, apresentaremos um atlas de citologia que possui imagens de lâminas de citologia, com métodos citológicos e citoquímicos, o qual muito contribuirá para a compreensão das estruturas celulares. 9 CITOLOGIA Unidade I 1 CÉLULAS EUCARIÓTICAS: MÉTODOS DE ESTUDO E CONSTITUIÇÃO QUÍMICA A Citologia é a ciência que estuda células eucarióticas, que estruturam plantas e animais e células procarióticas, que formam as bactérias. As células eucarióticas também são denominadas de células típicas. Um organismo animal é constituído por diferentes sistemas, como o respiratório. Sistemas são formados por órgãos, como o pulmão. Órgãos são formados por tecidos, como o tecido epitelial das vias respiratórias. Tecidos são formados por células e por material extracelular fibrilar e afibrilar. Células eucarióticas são formadas por três componentes básicos: membrana plasmática, citoplasma e núcleo. No citoplasma, há inúmeras organelas citoplasmáticas, como as mitocôndrias, e, no núcleo, há também elementos distintos, como o nucléolo e os cromossomos (Figura 1). Centrossomo Cromatina Ribossomo LisossomoCitoesqueleto Mitocôndria Núcleo Sistema golgiense Retículo endoplasmático Membrana plasmática Nucléolo Figura 1 – Esquema de célula eucariótica animal com base na microscopia eletrônica de transmissão (MET) Exemplo de aplicação Identifique os componentes celulares: membrana plasmática, citoplasma com suas organelas e núcleo (vide Figura 5). 10 Unidade I Assim, a Citologia é a parte da Biologia que estuda células e seus componentes celulares e citoplasmáticos: organelas, inclusões, pigmentos; além dos mecanismos de divisões – reprodução celular (mitose e meiose) – processos de apoptose e necroses, diferenças entre células animais e vegetais, mecanismos de diferenciação celular, comunicação celular, células-tronco, entre muitos outros conteúdos desta ciência morfológica microscópica, que comprova, já há alguns séculos, a importância das células na organização dos seres vivos. É interessante ressaltar que a Biologia Molecular realiza estudos do DNA (ácido desoxirribonucleico), dos diferentes tipos de RNAs (ácidos ribonucleicos), das proteínas e das enzimas envolvidas com as diferentes reações químicas por que passam os ácidos nucleicos, como replicação, transcrição e tradução do DNA. Estuda ainda os diferentes tipos de técnicas (PCR – reação de polimerase em cadeia, Wester Blot – para detectar proteínas e enzimas; e RFLP – polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição para o sequenciamento do DNA/sequenciamento de bandas no DNA), que envolvem estes ácidos e proteínas. Neste campo científico, também é desenvolvido o manuseio correto de equipamentos (ferramentas, como a cuba de eletroforese, termociclador, solventes estratores de ácidos nucleicos, primer/tipo de reagente), utilizados para tais estudos envolvendo todos os componentes celulares e citoplasmáticos, com ênfase em elementos do núcleo celular. A dedicação do estudante pela história da ciência Citologia trará aquisições de conhecimentos, como o dado marcante, em 1838/1839, quando Schleiden e Schwann propuseram a Teoria Celular: “todos os seres vivos são formados por células”. Procure saber sobre: Nehemias Grew e Marcelo Malpighi (1862), Rudolf Virchow, Wilson, Brachet, entre outros. Paralelamente à história da Citologia, a história e a evolução dos aparelhos denominados de microscópios também contribuíram e continuam contribuindo nas descobertas dos componentes e do funcionamento celular (microscópios de Robert Hooke – 1665, de Leewenhoek – 1674). O microscópio de luz atual (microscópio óptico composto) e os microscópios especiais, como os eletrônicos de transmissão e o de varredura, entre muitos outros tipos destes aparelhos ampliadores da potencialidade sensorial humana (a visão), continuam contribuindo nas descobertas sobre a estrutura e o funcionamento celular. O tamanho das células é diminuto, sabemos que um centímetro dividido por dez é igual a um milímetro, e um milímetro dividido por mil será igual a um micrômetro. Células apresentam tamanho na ordem de micrômetros. No final do século passado, pesquisadores propuseram mudanças em relação à nomenclatura e à quantidade de reinos que agrupam todos os seres vivos formados ou não por células (mais de dez reinos). Estabeleceram, ainda, o agrupamento dos reinos em nível ainda superior ao reino, o que chamaram de “domínios” (Bacteria, Archeaea e Eukarya). Os organismos procariontes ficam agrupados nos dois primeiros “domínios” citados e todos os organismos eucariontes no “domínio” Eukarya. Como células são estruturas diminutas, é interessante que o estudante adapte a nomenclatura de dimensões celulares, assim, quando da divisão de um micrômetro por mil, obtém-se a unidade nanométrica (um nanômetro). Apenas para concluir unidades de medidas, um nanômetro dividido por dez é igual a um angstrom. Observe todas elas representadas a seguir: 1mm = 1cm/10 1µm = 1mm/1000 1nm = 1µm/1000 1Å = 1nm/10 11 CITOLOGIA As células eucarióticas animais podem ser classificadas de diferentes maneiras, levando-se em consideração vários aspectos, como: morfológicos, funcionais, embriológicos, genéticos, histológicos, patológicos, entre outros. O sistema de classificação com base nos graus de diferenciação e maturidade (potencialidade) celular reúne os diferentes tipos em: lábeis, estáveis e permanentes; já os com base nos graus de individualidade relativa das células são reunidos em: livres, federadas, anastomosadas, sincício e plasmódios. O mecanismo da diferenciação entre as células promove essas especializações morfológicas (na forma) e fisiológicas (na função). No ser humano, esse mecanismo tem início por volta do quinto dia após a fecundação, aproximadamente após a formação das primeiras duzentas células, num estágio embrionário bem próximo à formação do blastocisto. Em todo o período do desenvolvimento embrionário (desde a fecundação até a oitava semana/dois meses/sessenta dias) ocorrem inúmeros processos de especializações, diferenciando as células que constituirão os tecidos. Toda a coordenação destas especializações encontra-se no ácido desoxirribonucleico (DNA), o principal constituinte dos 46 cromossomos. Células lábeis: são células dotadas de ciclo vital curto, produzidas de forma contínua pelo organismo. Fornecem e/ou produzem o crescimento e a renovação constante dos tecidos onde ocorrem, por exemplo, as células epiteliais constituintes das mucosas intestinais, da mucosa gástrica, da epiderme (na pele) e células sanguíneas, como os glóbulos brancos (leucócitos) e glóbulos vermelhos (hemácias/eritrócitos). Células estáveis: são células dotadas de ciclo vital médio ou longo, podendo durar meses ou anos, produzidas durante o período de crescimento do organismo (na vida intrauterina – períodos embrionário e fetal, como também pós-nascimento – até o início da vida adulta). Essas células só voltam a ser formadas em condições excepcionais, como na regeneração de tecidos (uma fratura óssea, por exemplo).São exemplos de células estáveis: célula óssea (osteoblasto), célula do fígado (hepatócito), célula do pâncreas (acinosa pancreática), célula muscular lisa (fibra muscular lisa involuntária). Células permanentes: são células de ciclo vital muito longo, coincidindo, geralmente, com o tempo de vida do indivíduo, produzidas apenas durante os períodos embrionário e fetal e com desenvolvimento após o nascimento. Quando da morte destes tipos celulares, não há reposição, algumas destas células aumentam em volume (hipertrofia celular), acompanhando o crescimento do indivíduo. São exemplos de células permanentes: células nervosas (neurônios), células musculares estriadas (fibras musculares estriadas esqueléticas e cardíacas). Células livres: apresentam autonomia, são isoladas, vivem nos ambientes líquidos (seres unicelulares – protozoários), células sanguíneas (glóbulos vermelhos e brancos). Células federadas: organizam-se sob a forma de tecidos. Tornam-se especializadas e perdem parte de sua autonomia em favor do conjunto, passando a viver umas na dependência das outras. Apresentam certa individualidade, estabelecem com as células vizinhas certas relações, trocam nutrientes entre si, através dos líquidos intersticiais. Células anastomosadas: são células fusionadas umas às outras, por meio de ligações citoplasmáticas, são alguns exemplos: células mesenquimais indiferenciadas do tecido conjuntivo e células ósseas jovens (osteoblastos). 12 Unidade I Sincícios: são células que apresentam vários núcleos mergulhados no citoplasma, com ausência de individualidade celular, casos típicos ocorrem nas células musculares estriadas esqueléticas (fibras musculares esqueléticas), nas células placentárias (sincíciotrofoblasto) e células do tegumento da lombriga (Ascaris lumbricoides). Todos os exemplos dados surgem pela fusão de células uninucleadas. Plasmódios: originam-se de células mononucleadas, que sofrem sucessivas divisões do núcleo sem ocorrer divisão do citoplasma. Outras denominações celulares: Células somáticas: são exemplos as células epiteliais (de origem dos três folhetos embrionários: ectoderma, mesoderma e endoderma); as células conjuntivas (de origem mesenquimal – o mesênquima origina-se do mesoderma); as células musculares (de origem mesodérmica); e as células nervosas (de origem ectodérmica). As células somáticas possuem 46 cromossomos ou 23 pares de cromossomos, isto é, são células diploides (2n), portanto, o genoma destas células é igual a 46 cromossomos. Células gaméticas (ou germinativas): são exemplos o espermatozoide e o oócito ou ovócito de segunda ordem (óvulo como denominação geral, porém incorreta). As células gaméticas possuem 23 cromossomos, isto é, são haploides, o genoma destas células é igual a 23 cromossomos. Células diploides: como (n) representa 23 cromossomos, estas células são portadoras de 46 cromossomos, sendo 23 cromossomos maternos e 23 cromossomos paternos; portanto, são assim denominadas (2n). Também se pode afirmar tal expressão para um indivíduo que apresenta cariótipo normal com 2n cromossomos (homem = 22 pares de cromossomos autossomos e 1 par de cromossomos sexuais 22A + XY, e mulher 22A + XX). Células haploides: como (n) representa 23 cromossomos, estas células são produzidas para reprodução da espécie. Nos testículos o processo do ciclo meiótico (meiose) reduz o número de cromossomos inicialmente, de 46 para 23 cromossomos no espermatozoide. Em relação aos oócitos (ovócitos de 2ª ordem), uma menina, ao nascer, já é portadora destes em seus folículos nos dois ovários, porém estas células ainda não terminaram o ciclo meiótico, e quando do processo da ovulação, são eliminadas na fase da anáfase II da meiose (com 46 cromossomos). Se caso ocorrer a fecundação, a penetração do espermatozoide no oócito faz com que ele termine sua meiose, isto é, passa para a fase de telófase II, eliminando um corpúsculo polar (célula com núcleo portador de 23 cromossomos e com pequeníssima quantidade de citoplasma), e, desde a entrada do espermatozoide, tal figura celular deixa de ser denominada de oócito e passa a ser denominada de óvulo. Portanto, a célula com dois núcleos, cada um com 23 cromossomos é a célula óvulo. Após o encontro destes dois núcleos e consequente pareamento cromossômico (anfimixia), forma-se a célula ovo ou zigoto (100 micrômetros), restabelecendo o genoma humano. Esta célula formada realizará a primeira divisão celular mitótica (mitose) após trinta horas, formando duas células denominadas de blastômeros, as quais realizarão 13 CITOLOGIA suas mitoses sucessivamente, processo este que será descrito na ciência Embriologia, conhecido por segmentação ou clivagem celular. Deve-se registrar que as primeiras duzentas células deste processo de clivagem no ser humano são consideradas células-tronco embrionárias (aproximadamente quatro/ cinco dias após a fecundação). Células vegetais: são células eucarióticas desprovidas de lisossomos e de centríolos, com a presença de parede celulósica impregnada por lignina (polissacarídeo) e revestida por pectatos (polissacarídeo) de cálcio e de magnésio, que constituem a lamela média. Possui um vacúolo grande que armazena água e uma série de compostos orgânicos (ácido húmico e betalaínas, que é uma glicoproteína) e inorgânicos, como cristais de cálcio (drusas) e de silício (ráfides). A membrana do vacúolo é denominada de tonoplasto. Nas células vegetais providas de cloroplastos ocorre a fotossíntese, porém, nas células desprovidas de cloroplastos, como as da raiz de um tronco do interior de um fruto e de uma semente, não há síntese de glicose. O cloroplasto é uma organela de membrana dupla, portadora de ácido desoxirribonucleico (DNA), na forma de um único cromossomo em formato de anel, semelhante ao DNA bacteriano e da organela mitocôndria. Possui também ribossomos em seu estroma. Nas plantas superiores (gimnospermas e angiospermas), os núcleos das células vegetais geralmente não possuem nucléolos. Organelas como o retículo endoplasmático, Golgi e mitocôndrias se fazem presentes nas células das plantas e a divisão celular ocorre do centro para a periferia, já nas células animais é ao contrário (Figura 2). Vacúolo Mitocôndria Lisossomo Citoplasma Ribossomo Poro Retículo endoplasmático Membrana nuclear Parede celular Membrana celular Complexo de Golgi Cloropasto Núcleo Figura 2 – Esquema de célula vegetal eucariótica com base na microscopia eletrônica de transmissão (MET) Observe a parede celular e vacúolo, componentes citoplasmáticas que não ocorrem em células eucarióticas animais. Quando de uma comparação entre células procarióticas (bactérias) com eucarióticas que formam animais e vegetais, podem-se resumir as seguintes características marcantes: o tamanho é muito maior nas eucarióticas, chegam até a 40 µm, enquanto nas procarióticas esse está 14 Unidade I compreendido entre 0,5 até 5 µm, possuindo em sua parede celular polissacarídeos e aminoácidos, pois, nas plantas há celulose, e nos fungos, a quitina. As células dos animais não apresentam tal parede. O material genético (DNA) nos organismos procariontes mantém contato direto com o citoplasma (há um nucleoide), enquanto nos eucariontes há um ou mais núcleos protegidos por um envoltório, a membrana do núcleo. As organelas de membrana, como retículo endoplasmático, Golgi, mitocôndrias e cloroplastos, só se fazem presentes nas células eucarióticas. Há ribossomos em ambos os tipos celulares, porém muito pequenos nas bactérias. As estruturas respiratórias das células procarióticas são representadas pela membrana e pelo citoplasma, já nas eucarióticas essa representação é feita pelas mitocôndrias e também pelo citoplasma. A fotossíntese nas bactérias ocorre por lamelas, enquanto nas células eucarióticas das plantas, pelos cloroplastos. A célula animal eucariótica não realiza fotossíntese. Nas células bacterianas, especializações como os flagelos são simples e não apresentamrevestimento de membrana plasmática. Em células procarióticas, os flagelos são estruturas representadas por um complexo citoesqueleto celular, e ainda são revestidos por membrana plasmática (Figura 3). Pili Citoplasma Cápsula Ribossomos Flagelos Novelo de DNA (nucleoide) Membrana citoplasmática Parede celular Figura 3 – Esquema de célula procariótica (de uma bactéria) Os vírus são agregados de proteínas e ácidos nucleicos (DNA ou RNA, nunca os dois ácidos se apresentam juntos num vírus). Bactérias e cianofíceas são maiores que os vírus, com organização físico-química bem mais complexa, porém são mais simples do que as células eucarióticas (Figura 4). 15 CITOLOGIA Figura 4 – Esquema de vírus com base na microscopia eletrônica de varredura (MEV) As riquétsias situam-se entre bactérias e vírus. Em relação aos tamanhos, podem-se citar: vírus do mosaico do tabaco de 150/180 até 3.000 angstrom; bactérias do tipo bacilo, de 0,5 até 3 micrômetros; bactéria Escherichia coli, de 1 até 2 micrômetros; e célula glóbulo vermelho, de 7 micrômetros. A maioria das células eucarióticas que constitui o ser humano fica compreendida entre 30 até 50 micrômetros, na média 20 micrômetros. A célula vegetal em média possui cerca de 30 micrômetros. A organela citoplasmática mitocôndria possui tamanho de 0,2 a 3 x 10 micrômetros, já os ribossomos, 250 angstrom, e a molécula da hemoglobina (Hb), 64 x 55 x 50 angstrom. Lembrete Uma das principais ferramentas de trabalho do biólogo é o microscópio óptico composto; logo, o conhecimento da estrutura fundamental dos seres vivos, as células, tanto animais como vegetais, constitui base sólida para o futuro biólogo. A forma celular (morfologia) pode ser constante e/ou variável, dependendo de influências internas, como rigidez da membrana, viscosidade ou tensão superficial do citoplasma; como também de externas, como pressões das células vizinhas. Assim, podem-se classificar morfologicamente as células em: Células planas (pavimentosas) ou achatadas: são encontradas no tecido epitelial, juntas são chamadas de epitélio pavimentoso. Essas células estão localizadas na camada mais superficial celular da epiderme, abaixo da queratina, e, quando localizadas na camada mais interna dos vasos sanguíneos, são denominadas de células endoteliais (endotélio). Células colunares (prismáticas) ou cilíndricas: são encontradas no epitélio gástrico e também no intestinal e em ductos de glândulas exócrinas. 16 Unidade I Células cúbicas: possuem três dimensões semelhantes, lembram um “dado”, localizadas, por exemplo, na glândula endócrina tiroide. Células esféricas: como os glóbulos brancos (leucócitos) do sangue, oócito. Os glóbulos vermelhos são discos bicôncavos (células discoides). Células estreladas: como os neurônios multipolares (células nervosas), essas células possuem ramificações (os dendritos e o axônio). Células fusiformes: são células afiladas nas extremidades, típicas fibras musculares lisas dos órgãos, como estômago, intestino, útero, vagina, vasos sanguíneos. Observação A célula eucariótica possui núcleo organizado, já as células procarióticas não o possuem, são desprovidas do envoltório nuclear (a carioteca). Estas células procarióticas constituem organismos primitivos unicelulares (procariontes), como as bactérias e algas cianofíceas. Em todo o mundo, inclusive no Brasil, que foi o pioneiro em transplantes de células-tronco de medula óssea, descobertas e relatos sobre este tipo celular ocorrem anualmente, e, devido à importância destas descobertas, segue descrição sumária com o intuito de estimular o estudante no envolvimento e na pesquisa sobre estes tipos de células: Células-tronco: pesquisas com células-tronco (CT) têm suscitado controvérsias científicas, religiosas e éticas. É bom estimular a reflexão sobre as seguintes relações: CT x alma, alma x embriões congelados e alma x cultura de tecidos. A célula é a unidade fundamental e básica do ser vivo. Suas partes fundamentais são: membrana, citoplasma e núcleo. A maioria das células é uninucleada, algumas são binucleadas e as células musculares (fibras musculares estriadas esqueléticas) são multinucleadas. As células que apresentam a mesma origem e desempenham as mesmas funções formam os tecidos fundamentais: epiteliais, conjuntivos, muscular e nervoso. Estes quatro tecidos apresentam vários subtipos, os quais constituem órgãos dos diferentes sistemas que formam o organismo. Alguns tecidos apresentam mais material extracelular que outros, caso típico são os tecidos conjuntivos, material extracelular que pode estar mineralizado (caso dos tecidos ósseos) e não mineralizado, (caso dos demais tecidos conjuntivos). O núcleo apresenta no seu interior, além do nucléolo (responsável pela produção dos RNAs ribossômico-RNAr e transportador-RNAt), a cromatina (DNA + proteína histona), material que forma os cromossomos, que por sua vez contém os genes. Estes contêm o material genético do indivíduo. O conjunto de genes é o genoma. Há também material genético no citoplasma, mais precisamente nas mitocôndrias (esse DNA existente na mitocôndria é originário somente de nossas mães). Células gaméticas ou sexuais apresentam apenas 23 cromossomos, enquanto as células somáticas apresentam 46 cromossomos. O processo de fertilização – fecundação dos gametas – pode ocorrer por meio natural, 17 CITOLOGIA através de uma relação sexual ou mediante um procedimento laboratorial in vitro denominado de reprodução assistida (não é clonagem). Fertilização são os meios, e fecundação é o ato do encontro das células gaméticas ou sexuais. Quando uma célula apresenta potencialidade, ou seja, é capaz de se diferenciar dando origem às demais células do organismo, como musculares, ósseas, nervosas, entre outras, ela ainda não possui especialização, ainda não se diferenciou. Todas as células não diferenciadas (células indiferenciadas) são células-tronco (CT) e na espécie humana essas células existem até o 5º dia após a fecundação, quando há no máximo um número de 200 células, aproximadamente. Após trinta horas da fecundação, há 2 blastômeros, denominação dada às células provenientes da primeira divisão da célula ovo ou zigoto. Depois do estágio de 9 células, os blastômeros mudam de forma e aderem firmemente uns aos outros, formando uma bola compacta de células, é a fase de compactação, a qual irá possibilitar a formação de uma massa de células mais internamente denominada de embrioblasto. Com 3 dias após a fecundação, há um número de 12 até 16 células (blastômeros) que constituem a figura embriológica mórula. Do quarto ao quinto dia, surgem 32, 64, 128 células. No quinto dia ocorre a chegada desta figura embrionária no útero. Neste quinto dia, já há 256 células. No sexto dia, a figura embrionária se encontra bem encostada/aderida na mucosa uterina e, no sétimo dia, a nidação já teve início (penetração do blastocisto na mucosa uterina). Neste sétimo dia ocorre o surgimento do hipoblasto, que dará origem ao primeiro folheto embrionário, o endoderma. No nono dia, o blastocisto está totalmente implantado num local escolhido por ele mesmo. Essas células (200 células aproximadamente) são totipotentes, pois são capazes de originar os 216 tecidos, inclusive os anexos embrionários: placenta, cordão umbilical, âmnio e alantoide. A partir do 5º dia, as CT presentes no embrião serão praticamente as mesmas encontradas no recém-nascido e durante toda a sua vida (infância, puberdade, adulta e senil). O período embrionário compreende um espaço de tempo: vai desde a fecundação até o final do 2º mês (oito semanas aproximadamente), enquanto o período fetal inicia-se a partir do 3º mês (9º semana) até o nascimento, por volta da 38ª semana. A partir do 5º dia, as CT do embrião já são denominadas de pluripotentes, uma vez que não originam a placenta e outros anexos embrionários. A terapia com CT é a possibilidade do uso das CT, isto é, de empregá-las como células em tecidos lesadosou doentes, como nos casos de Alzheimer, Parkinson, doenças neuromusculares em geral, diabetes, entre outras. O Brasil é pioneiro em terapia com CT de medula óssea. As terapias estão relacionadas principalmente ao tratamento de cardiopatias: doenças coronárias, isquemias agudas e infartos agudos e crônicos. Atualmente, as pesquisas avançam no tratamento para a cura da doença de Chagas. Células-tronco embrionárias (CTE) ainda não são usadas em pacientes, apenas as da medula óssea e as do cordão umbilical. As CTE não são reconhecidas pelo organismo que a recebeu, porque não expressa compatibilidade e porque também não expressa incompatibilidade (há certas controvérsias dos cientistas). Quando células-tronco tornam-se maduras, diferenciam-se, passam a expressar os antígenos de onde vieram e passam também a ser reconhecidas pelos receptores existentes em outras células constituintes do organismo como corpo estranho e sofrem rejeição. Portanto, não é solução. A solução é a clonagem terapêutica ou o uso de CTE como vetor. As CTE apresentam características interessantes: poderão num 18 Unidade I futuro bem próximo ser usadas na terapia de doenças genéticas, ao contrário do “autotransplante”, uma vez que todas as células do corpo estão geneticamente afetadas. Assim, a Engenharia Genética traz esperanças para pacientes com distrofia muscular (consulte o capítulo sobre citoesqueleto). Na terapia com CT, o que importa é a sua capacidade de se fundir com a célula doente, construir uma nova célula, reconstruir a função inicial da célula, sem o risco de ser reconhecida como corpo estranho e sofrer rejeição. As células-tronco embrionárias (CTE) carecem ainda de muita pesquisa. Por serem indiferenciadas, são capazes de formar uma grande variedade de tipos de tumores. São tipos de células-tronco: CTE (altamente eficientes), CT do cordão umbilical (CTCU), que são moderamente eficientes, e CT da medula óssea (CTMO), que são eficientes. As CTCU e as CTMO são pluripotentes, como as existentes na pele e no couro cabeludo, cérebro, retina, músculo e no tecido adiposo. Os órgãos citados a seguir são passíveis de reposição para CT: cérebro, pulmão, coração, fígado, rins, pâncreas, ossos, músculos, vasos e, num futuro bem próximo, assim se espera, medula espinhal (medula nervosa). As CTMO podem regenerar órgãos como o fígado e o coração (trabalhos já provam a regeneração). As CTCU já são estocadas para tratamento de leucemia. Espera-se, para um futuro bem próximo, o uso de CTCU para tratamento de Parkinson e de Alzheimer. A lei brasileira permitiu o uso de CTE estocadas há mais de três anos. Segundo pesquisadores, essas células já passaram da fase de serem colocadas no útero. Se colocadas não vão originar a placenta (Lei de Biossegurança – março/2005). Culturas de células e de tecidos são realizadas em um determinado meio nutritivo (meio de cultura) apropriado, e assim as células se multiplicam (se reproduzem) e se mantêm vivas, indefinidamente. Pergunta-se: que tipo de vida existe nas células presentes nessas culturas de tecido? Resposta: são células sadias de um indivíduo vivo e dotado/portador de um espírito ou alma. Essas células em meio de cultura se mantêm vivas e ostentam um fenômeno biológico que dispensa a presença de um espírito/ alma? O indivíduo que doou às células para cultura de tecido pode até já estar morto, mas suas células continuam vivas. Clonar, produzir um clone, é fazer reprodução assexuada. É a cópia geneticamente idêntica de um ser vivo. Quando se remove o núcleo de um óvulo e se introduz, em seu lugar, o núcleo de uma célula somática, por exemplo, da pele, este núcleo é portador de 46 cromossomos. Primeiramente, para o sucesso da clonagem, o núcleo precisa regredir e voltar a ser indiferenciado, assim, a célula começa a se dividir, iniciando o processo de formação de um embrião. Após a implantação no útero, o processo pode dar certo ou errado, originando um clone ou não. Clones já foram obtidos de animais. Quando da não implantação no útero, os embriões serão congelados em nitrogênio líquido. O tipo de vida que está se manifestando no embrião congelado é o mesmo tipo de vida que existe nas culturas de células e de tecidos. Muitas perguntas serão formuladas sobre o assunto, por exemplo: que tipo de vida há ou está se desenvolvendo nesse embrião congelado? Há espírito ou alma no embrião congelado? O embrião clonado e congelado é comparável a uma cultura de tecido? Os embriões congelados podem ou não ser usados para o desenvolvimento de recursos capazes de curar doenças por meio da terapia celular (que é a medicina regenerativa). É muito importante o avanço tecnológico, a evolução científica neste campo científico. 19 CITOLOGIA A medicina regenerativa não defende a clonagem reprodutiva para formar seres humanos. Os EUA proíbem a clonagem reprodutiva. O Reino Unido já aprovou o uso de CTE para terapia. O Brasil possui resultados satisfatórios com o uso de CTMO e do cordão umbilical. Futuramente, serão divulgados os primeiros ensaios com uso de CTE por países como Inglaterra, Israel e Austrália. A posição dos religiosos é geral: proibição do uso de CTE e do processo de clonagem reprodutiva. Praticamente, todos sustentam que a vida se manifesta pelas células e as células estão sob a regência de uma “alma”; portanto, o uso de CTE é considerado um aborto por esses grupos. Dentro de um contexto religioso, a origem da alma é explicada pelos estudiosos do livro Gênesis, o primeiro da Bíblia, da seguinte maneira: a palavra é usada no original hebraico e relacionada à tarefa de “criar do nada” (bara), referindo-se à criação do universo, da vida e da alma a partir no “nada”. Segundo muitos religiosos, a alma é criada por Deus. Surgem divergências, como: quando e como se dá a criação da alma? A tentativa de resposta é dada por 3 teorias conhecidas por: Teoria I – Teoria da Preexistência; Teoria II – Teoria do Criacionismo; e Teoria III – Teoria da dualidade. A Teoria da Preexistência postula que as almas preexistem no plano espiritual e sua união com o corpo físico e posterior nascimento caracteriza a “reencarnação”. A Teoria do Criacionismo sustenta que Deus cria a “alma” no momento da concepção ou do nascimento, ou em um ponto entre estes dois eventos. Uma vez criada, é mantida no corpo físico. Essa teoria contesta a comprovada Teoria da Evolução (consulte textos sobre o tema filosofia da ciência). A Teoria da Dualidade propõe que toda a raça humana foi criada em “Adão”. Assim, Deus criou o Homem com a faculdade de transmitir aos seus descendentes não só o corpo físico, mas também a “alma”. Após todas essas considerações, permanecem perguntas, tais como: o que é embrião? É possível a vida nas células embrionárias sem a presença de uma “alma”? Nos embriões congelados, o que acontece com a “alma”, se ela, realmente, estiver unida ao embrião? Qual a relação entre a vida celular embrionária, se o embrião não for implantado em um útero, e a vida presente em uma cultura de células (de tecidos)? Historicamente, será um erro ou um acerto permitir o uso terapêutico das células-tronco embrionárias? O processo de evolução por seleção natural foi proposta por Darwin e por Wallace (1823 – 1913), em 1858, tem como elemento essencial o tempo. Assim, uma parcela de uma população, ao sair de um ambiente inicial, se mantém isolada da população de origem. Com o tempo, no novo ambiente, alguns caracteres presentes nesse grupo, que permitem uma melhor adaptação ao novo ambiente, serão selecionados e haverá vantagens para sobreviver e deixar descendentes; logo, vão dominar na população. A seleção natural age no sentido de eliminar aquilo que não se adapta ao meio. Com o tempo e o isolamento, uma nova espécie irá surgir no novo ambiente (é um processo dinâmico e pode levar milhões de anos). Isto explica a biodiversidade. Hoje, o papel da Genética é, em particular da Genética Molecular, explicar o grau de parentesco entre as espécies. Evoluçãoé um processo que precisa de muito tempo para agir. A Teoria da Evolução é, sem dúvida, uma teoria elaborada e a sua compreensão exige grande conhecimento de suas bases. As espécies apresentam caracteres, variedades ou estados, genes que atuam no processo de seleção natural. A molécula do DNA/ADN existe em todas as células. Nesta molécula do DNA, localizam-se todas as informações. Durante a meiose, no processo da permutação (crossing-over), há recombinação das informações que serão enviadas pelas células gaméticas (espermatozoide e oócito). 20 Unidade I Durante a fecundação, ocorre uma soma dessas informações, restabelecendo-se um novo DNA de uma nova geração. A molécula de DNA humana, se estendida, daria mais de um metro de informação. Sua constituição é representada por ácido fosfórico e bases nitrogenadas: adenina, guanina, timina e citosina, açúcar (pentose) constituído por cinco carbonos, a desoxirribose e por pontes de hidrogênio. É bom registrar que há outras teorias para a origem da nossa espécie e dos outros seres vivos. O esquema/desenho a seguir é hipotético de célula eucariótica animal com seus componentes estruturais. O desenho é hipotético, pois foram introduzidos neste esquema componentes celulares totais; assim, não existe nenhuma célula que é portadora ao mesmo tempo de microvilosidades e de cílios. Glicocálix Gotículas de proteína Gotículas de lipídeo Nucléolo Mitocôndria Desmossomo Membrana basal Centríolo Matriz citoplasmática Polirribossomos livres Lisossomo Complexo de Golgi Poro nuclear Núcleo Cristal R. E. L. R. E. R. Cílio Figura 5 – Esquema hipotético de uma célula eucariótica 21 CITOLOGIA Observe na figura anterior todos os componentes celulares e organelas citoplasmáticas, além de algumas especializações da membrana plasmática, como desmossomos, microvilosidades (microvilos) e cílios. Saiba mais Consulte o site sobre células-tronco: <www.criogenesis.com.br/>. Para o conhecimento das células eucarióticas, se faz necessário o uso de diferentes métodos de estudo. Sabe-se que os primeiros foram feitos com tecidos vivos, sem nenhum preparo. Nessas condições, a observação dos componentes celulares era muito precária. Surgiu, então, o emprego de corantes que pudessem tingir as várias partes celulares, de modo diverso e seletivo, oferecendo, assim, um bom contraste entre elas. De início, empregaram-se corantes naturais, depois, as anilinas artificiais. Durante este período, os microscópios também sofreram aprimoramentos. Um problema que os citologistas enfrentavam era o da conservação e preparação do material que seria levado ao microscópio. Os tecidos vivos, quando destacados/retirados de seus organismos de origem, degeneram rapidamente (sofrem autólise). Devem, portanto, receber tratamento químico ou físico que garanta a sua conservação, tratamento este denominado de fixação do material. Sabe-se que os fixadores alteram a estrutura das células, portanto, o que observamos no microscópio não é a célula tal como ela existe nos tecidos, mas os citologistas têm conseguido extraordinários progressos, de modo que os agentes que hoje são empregados alteram pouco a estrutura original da célula. São tipos de exames microscópicos: Exame in vivo (exame imediato) a fresco: trata-se de estudo de células vivas. Pode ser feito com o emprego de corantes, utilizando-se o microscópio de fase, ou ainda com emprego de corantes que não causam a morte das células (coloração vital ou supravital), como o azul de metileno, o vermelho neutro, o verde Janus e o azul de Trypan. O exame das células vivas é favorecido pelo cultivo de tecidos, que consiste em manter tecidos vivos em líquidos nutritivos. Para esses estudos, há contribuição dos micromanipuladores, que são aparelhos que permitem o delicado manuseio de estruturas microscópicas. Exame post mortem (fixação): trata-se do estudo de células mortas, fixadas e conservadas pelos vários processos. A preparação de uma lâmina para estudo microscópico pela técnica de rotina (método de coloração pela hematoxilina e eosina – H&E) compreende várias etapas que serão descritas a seguir: Sobre a coleta (colheita) do material: — Biópsia – muito utilizada pela ciência Patologia. Normalmente retira-se um fragmento de tecido ou órgão do organismo vivo por meio de anestesia local. — Necropsia ou autópsia – é mais utilizada pela Patologia. Aqui, o organismo já se encontra morto. 22 Unidade I — Vivissecção – mais utilizada pela Histologia e Citologia. Consiste em retirar tecidos ou órgãos de uma cobaia, rato e/ou outro animal a partir de um ato cirúrgico, seguindo um protocolo aprovado pela Comissão de Ética da Instituição de Ensino. A Citologia e a Histologia nem sempre se utilizam de material humano para estudo, aliás, em raras ocasiões o material é humano. As razões para tais procedimentos são várias: difícil obtenção, nem sempre é didático para estudos e, às vezes, o órgão é grande demais. Assim, os animais mais utilizados são: ratos, coelho, gato, cão, porco, cabra, boi, macaco, dependendo do estudo, certas espécies de aves, sapos, peixes e organismos invertebrados. Exemplo de aplicação As pesquisas de iniciação científica nas Instituições de Ensino Superior, que envolvem experimentos com animais, são dependentes de aprovação do Comitê de Ética. Em substituição ao uso dos ratos, cobaias, sapos, entre outros animais, experimentos estão sendo realizados com o peixe Zebra fihs – Danio ratio. Pesquise sobre o assunto. • Fixação do material O material, uma vez coletado, é imediatamente lavado em água e introduzido no fixador. A fixação visa à preparação da morfologia e da constituição química das células e tecidos. Uma vez mergulhado o órgão no fixador, as células morrem imediatamente, evitando processos autolíticos. Agentes fixadores: físicos (calor, frio) e químicos (formol, Bouin, Zenker). O calor é muito utilizado para a fixação de preparações usadas principalmente pela Microbiologia e Hematologia. No processo do congelamento, o metabolismo fica nulo, mas não fixa o material, pois uma vez passado o processo de congelamento o órgão pode sofrer os processos autolíticos normais. Esse método é muito utilizado pela Histoquímica. Os métodos químicos são os mais utilizados pela Citologia, Histologia e Embriologia. Existem muitos tipos de soluções fixadoras. Os mais utilizados são: formol a 10%, líquido de Bouin, de Helly e de Zenker. É muito comum o uso do líquido de Bouin. Preparação do fixador Bouin (para 1 litro de solução): — solução aquosa saturada de ácido pícrico – 750 ml; — formaldeído 40% – 200 ml; — ácido acético glacial P. A. – 50 ml. Misturam-se os três componentes em uma proveta de 1 litro. Todo fixador endurece o material, assim, deixa-se por volta de uma hora no fixador e em seguida faz-se o recorte do órgão, obtendo-se uma “peça” ideal, da qual, posteriormente, serão tirados os cortes. 23 CITOLOGIA Esses fragmentos devem continuar no fixador para uma perfeita fixação. O tempo mínimo ideal é de mais ou menos 48 horas, variando de acordo com o tamanho da “peça”. Não se deve deixar o material por muito tempo no fixador, mais ou menos por um mês, depois disso, pode ficar muito endurecido e quebradiço, além de ter estruturas delicadas alteradas. O ideal é armazenar o material em solução de álcool a 70%. Propriedades dos fixadores em geral: — A – fixar o material; — B – evitar autólise; — C – conservar o material; — D – penetrar nos tecidos; — E – endurecer levemente o órgão e não em demasia; — F – não interferir nos corantes; — G – insolubilizar os componentes tissulares e celulares; — H – não provocar alterações nas estruturas de células e tecidos. Uma vez fixado o material, dele já podem ser obtidos os cortes, mas talvez apresente o inconveniente de não ser bastante endurecido para que dele possam ser retirados os cortes. Um dos artifícios utilizados neste caso é impregná-lo com parafina, mas não podemos fazê-lo diretamente,pois ele se encontra hidratado. • Desidratação do material O material é desidratado com álcool, pois é solúvel na água e no xilol. Utiliza-se uma bateria alcoólica de concentrações crescentes. Procedimento: — álcool 75% – de 12 a 24 horas; — álcool absoluto I – 1 hora; — álcool absoluto II – 1 hora; — álcool absoluto III – 1 hora. 24 Unidade I Preparo do álcool 75%: — 750 ml de álcool absoluto; — 250 ml de água destilada. • Diafanização do material Nesta etapa utiliza-se xilol, que é ao mesmo tempo solvente do álcool absoluto e da parafina. Além disso, o xilol clareia a peça, tornando-a translúcida, pois dissolve os lipídeos. — xilol I – 1 hora; — xilol II – 1 hora; — xilol III – 1 hora. • Impregnação do material Nesta etapa o xilol será substituído pela parafina fundida a mais ou menos 60º C. Utiliza-se parafina histológica com preparação especial. Componentes para a preparação de 1,2 kg de parafina histológica: — parafina em barras – 1 kg; — cera de abelha – 150 g; — ácido esteárico – 50 g; — vaselina líquida – 10 ml. Hoje, a parafina histológica presente no mercado pode ser utilizada de forma direta. Procedimento: derrete-se a parafina com a cera e, quando estiver quase fervendo, acrescentam-se ácido esteárico e, em seguida, a vaselina. Deixa-se ferver cerca de uma hora. Filtra-se na estufa. Funções dos componentes: — cera – dar maior elasticidade à parafina; — ácido esteárico – dar maior “liga” entre a cera e a parafina; — vaselina – retardar a solidificação facilitando a inclusão. 25 CITOLOGIA Procedimento para a impregnação: — parafina I – 1 hora; — parafina II – 1 hora; — parafina III – 1 hora. Procura-se evitar que a estufa fique muito tempo aberta, isso dificultará a perfeita impregnação. Para inclusão ou emblocamento, utiliza-se uma forminha de papel e/ou peças de alumínio Procedimento: isto ocorre fora da estufa. Enche-se uma forminha com a parafina líquida. Com uma pinça aquecida, pega-se a peça e se a introduz no fundo da forminha. Quando a parafina começa a se solidificar, acrescenta-se água na cuba que contém a forminha. A inclusão é importante para dar suporte ao material. Aparamento do bloco de parafina: depois de sua solidificação, este é aparado com o auxílio de um bisturi ou espátula aquecida. Costuma-se grudar um suporte de madeira ao bloco para sua melhor fixação no micrótomo. Microtomia Para a realização dessa etapa, utiliza-se um aparelho chamado micrótomo, que tira finas fatias de 5 a 10 micrômetros do bloco de parafina. Antes de se iniciar esta etapa, devem-se limpar com álcool absoluto com o auxílio de uma gaze as lâminas que irão receber os cortes. As lâminas são colocadas em um suporte de madeira. Em seguida, são albuminizadas para ajudar a aderência dos cortes. Outro procedimento utilizado é o banho-maria. • Preparação da albumina: — albumina natural – 1 parte; — glicerina – 1 parte; — cristais de timol – 1 cristal para evitar proliferação de fungos. Durante a microtomia, obtém-se uma fita de cortes. Estes cortes serão isolados com o auxílio de um bisturi e de um pequeno pincel, cada corte é colocado na superfície liquida do banho-maria histológico que se encontra a uma temperatura de cerca de 45°C. No banho-maria, o corte se distende e é possível ser “pescado” pela lâmina. Estas lâminas, já com o corte, irão para a estufa ou para a platina aquecedora a 60°C por alguns minutos, para derreter a parafina e haver a maior distensão do corte. Estas lâminas serão guardadas em temperatura ambiente, longe da poeira, aguardando a coloração. 26 Unidade I • Preparação do banho-maria (componentes necessários para a preparação de 2 L de solução): — água destilada – 2 litros; — gelatina em pó – 5 g; — solução saturada de bicromato e potássio – 5 gotas. Juntar os ingredientes a uma temperatura em torno de 40-45°C. A função da gelatina é permitir maior aderência do corte na lâmina. Coloração das lâminas Estas serão coradas pela hematoxilina e pela eosina. Trata-se de uma coloração bicrômica. Atuação dos corantes: a hematoxilina é um corante básico e cora estruturas ácidas em azul ou roxo. A hematoxilina é um corante vermelho escuro, e, quando uma estrutura uma vez corada apresenta cor diferente do corante, diz-se que essa estrutura exibe o fenômeno chamado metacromasia em relação a esse corante. As estruturas ácidas que apresentam afinidade por corante básicos diz-se que são basófilas. A eosina é um corante ácido de cor vermelha e cora estruturas básicas, como o citoplasma e fibras colágenas, em róseo. Essas estruturas são ditas acidófilas ou eosinófilas. • Preparação da hematoxilina de Harris (componentes necessários para um litro de corante): — hematoxilina – 5g; — alúmen de potássio ou de amônio – 100g; — água destilada – 1 litro; — óxido de mercúrio vermelho – 2,5g; — álcool absoluto – 50 ml. Para preparar corantes ou outras soluções, deve-se sempre usar um recipiente com o dobro do maior volume encontrado (para 1 litro, usa-se um recipiente com capacidade para 2 litros). Isto é necessário devido às eventuais reações bruscas. Na preparação do corante, o recipiente será um balão de vidro de fundo chato de 2 litros. Dissolvem-se, em primeiro lugar, no balão, as 100g de alumem de potássio ou de amônio em 1 litro de água destilada. Para maior rapidez, leva-se tudo à chama de um bico de Bunsen. Logo a seguir, dissolve-se, em béquer de 100 ml, 5g de hematoxilina em 50 ml de álcool absoluto. Para a operação ser mais rápida, aproveita-se a temperatura da tela de amianto usada na etapa anterior. Depois de dissolvido o alúmen na água e a hematoxilina no álcool, despeja-se a hematoxilina dissolvida no balão com o alúmen, resultando em alúmen + água + álcool absoluto e hematoxilina. Leva-se tudo à chama por alguns minutos até começar a 27 CITOLOGIA ferver. A seguir, despejam-se as 2,5 gramas de óxido de mercúrio no balão, aos poucos e com muito cuidado, pois a reação pode ser muito violenta. Deixa-se na chama por mais alguns minutos, até ferver. Rapidamente, resfriamos o balão com o corante num balde com gelo, para que a mudança de temperatura seja bem rápida. Depois que o corante esfriou, filtramos e, então, a hematoxilina de Harris está pronta para uso imediato. • Preparação da eosina amarela (componentes necessários para 1 litro de corante): — eosina – 10g; — álcool absoluto – 100 ml; — bicromáto de potássio – 5g; — água destilada – 900 ml; Inicialmente, dissolvem-se as 10g de eosina em 100 ml de álcool absoluto. A seguir, as 5g de bicromáto de potássio em 900 ml de água destilada. Juntam-se as duas soluções e acrescentam-se 200 ml de solução aquosa saturada de ácido pícrico. Filtra-se, e o corante já se encontra pronto para uso imediato. Esses corantes são hidrossolúveis. Deve-se lembrar de que as lâminas estão impregnadas de parafina. Portanto, antes de se introduzirem as lâminas nos corantes, deve-se desparafiná-las e hidratá-las. Podem-se realizar a desparafinação física na estufa e/ou a química, com o uso de bateria de xilol. • Procedimentos para a desparafinação química das lâminas: — xilol I – 5 minutos; — xilol II – 5 minutos; — xilol III – 5 minutos. • Procedimentos para a hidratação: — álcool absoluto I – 5 minutos; — álcool absoluto II – 5 minutos; — álcool a 75 % – 5 minutos; — água corrente com várias trocas – 5 minutos; — carbonato de lítio – 5 min. (para remoço do ácido pícrico do fixador Bouin); — água corrente – 5 minutos. 28 Unidade I • Procedimento para coloração: — hematoxilina por cerca de 8 minutos; — água corrente com várias trocas; — limpeza das lâminas com auxílio de uma gaze; — diferenciador de hematoxilina – 10 segundos (5 ml de ácido clorídrico em 100 ml de álcool 75%); — água corrente – 2 minutos com uma troca; — eosina – de 30 segundos a 3 minutos; — água corrente – 1 minuto; — diferenciador de eosina – álcool 75 % – 1 minuto. A lâmina já se encontra corada e pode até ser observada ao microscópio. A próxima etapaé a montagem da lâmina. Montagem da lâmina Consiste em colar uma lamínula sobre o material para protegê-lo. A resina utilizada, o bálsamo do Canadá, não é hidrossolúvel, por essa razão, temos que desidratar as lâminas antes de se efetuar a montagem. • Procedimento: — álcool absoluto I – 1 minuto; — álcool absoluto II – 1 minuto; — álcool absoluto III- 1 minuto; — xilol I – 1 minuto; — xilol II – 1 minut;o — xilol montagem – a lâmina permanece aqui até a montagem. Depois de montada, deixa-se ao ambiente para secagem por 48 horas. 29 CITOLOGIA Lembrete O núcleo é ácido, logo, possui afinidade por corante básico (alcalino), como a hematoxilina. Assim, o núcleo apresenta basofilia celular; já o citoplasma é alcalino (básico), possui afinidade pelo corante ácido eosina. • Análise das lâminas – ao se observarem as lâminas, podem-se constatar alguns artefatos de técnica, a saber: — A – dobras; — B – pregas ou rugas; — C – rupturas; — D – deslocamentos com deslocamentos; — E – sobrecoloração; — F – bolhas de ar; — G – emulsões; — H – dentes de navalha; — I – precipitados de corantes; — J – outros. A lâmina boa para estudos citológicos e histológicos é aquela que apresenta um menor número de artefatos, o ideal é que não apresente nenhum artefato. Existem outras técnicas histológicas, principalmente as técnicas tricrômicas, isto é, técnicas que se utilizam de três corantes diferentes. Eis alguns tipos mais comuns: Tricrômico de Mallory, que evidencia as fibras colágenas em azul, os núcleos em laranja e o tecido em tom arroxeado; Tricrômico de Van Gieson, que evidencia fibras colágenas em vermelho, epitélios em amarelo e núcleos em preto; Tricrômico de Masson, em que fibras colágenas aparecem em tom esverdeado, tecido muscular em púrpura e núcleos em preto; Tricrômico de Nilceo Marques de Castro, com fibras colágenas em azul intenso, núcleos em vermelho e tecido muscular arroxeado; Fucsina-resorcina de Weigert, que evidencia em púrpura as fibras elásticas; e impregnação argêntica, que evidencia fibras reticulares em preto e as colágenas em marrom. Conforme o tipo de impregnação (métodos de Golgi, Cajal), são evidenciadas células do tecido nervoso (neurônios e células gliais). Há também as impregnações 30 Unidade I metálicas, que consistem em produzir sobre determinadas estruturas um delgado precipitado de metal reduzido. O metal entra em contato com o tecido sob a forma de soluções salinas, como o nitrato de prata. A redução ocorre, em parte, da própria ação redutora dos tecidos e, em parte, da ação de substâncias redutoras utilizadas ou da própria luz. Os metais mais empregados são: a prata, o ouro e o ósmio. Utilizam-se as impregnações metálicas para se evidenciarem fibras nervosas, fibras reticulares e organelas celulares. Já as técnicas histoquímicas são empregadas quando se deseja evidenciar a presença de compostos químicos em células e tecidos. Existem técnicas para se detectarem lipídios, proteínas, glucídios, ácidos nucleicos, enzimas etc. Os desenvolvimentos dessas técnicas já requerem um laboratório bem equipado. Observação Nas técnicas citoquímicas, a contraprova é muito importante; assim, quando há o uso da saliva (contém amilase) sobre a lâmina de fígado com glicogênio, submetida ao PAS, este será negativo. Os procedimentos deste aprendizado, na prática, podem ser realizados em laboratórios de anatomia patológica e/ou em laboratórios de Citologia, Histologia e Patologia de diversas IES. Algumas imagens das etapas de preparação de lâminas: Figura 6 – Fígado na etapa da fixação Figura 7 – Fígado já fixado em Bouin + / – 2h + / – 2h + / – 2h + / – 2h Desidratação Objetivo Retirada da água do material Bateria crescente de álcool Figura 8 – Esquema da etapa desidratação (uso de bateria crescente de álcool) 31 CITOLOGIA Diafanização Objetivo Retirada de impurezas do material Preparar o material para a impregnação Baterial de xilol + / – 2h + / – 2h + / – 2h Figura 9 – Esquema da etapa da diafanização/clareamento (uso de bateria de xilol) Impregnação Objetivo Preencher o material com parafina Preparar o material para microtomia Baterial de parafina (em estufa – 63ºC) + / – 2h + / – 2h + / – 2h Figura 10 – Esquema da etapa de impregnação do material (em parafina líquida) Figura 11 – Estufa Figura 12 – Material na estufa (impregnação) Figura 13 – Peças de alumínio para inclusão do material Figura 14 – Bloco de parafina com cinco órgãos 32 Unidade I Figura 15 – Micrótomo Figura 16 – Etapa da microtomia Figura 17 – Banho-maria Figura 18 – Pesca do material no banho-maria 5’ 5’ 5’ 2’ 10’ 2’ 1’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 10’ Desparafinização Xilol I Xilol IEosinaHematoxilina Xilol II Xilol II Álcool absoluto Álcool absoluto Álcool absoluto II Álcool 96% Álcool 96% Álcool 70% Água corrente Água corrente Água corrente Reidratação Coloração Desidratação Figura 19 – Esquema da etapa da coloração: desparafinação química, reidratação (uso de bateria crescente de álcool), coloração propriamente dita e desidratação 33 CITOLOGIA Figura 20 – Células hepáticas (hepatócitos) corados pela técnica do H&E – hematoxilina e eosina (em roxo, núcleo, nucléolo, grânulos de cromatina; em róseo, citoplasma) O estudante deve guardar as seguintes informações: como o corante hematoxilina (H) é uma base, os componentes ácidos da célula terão afinidades por ele, logo, o núcleo, como possui ácidos nucleicos, terá tal afinidade. Nesta reação do núcleo com a hematoxilina, forma-se um sal roxo mais água. Como o núcleo é ácido e gosta de corante alcalino (base), afirma-se que o núcleo apresenta basofilia celular. Já o citoplasma (citossol) possui natureza química alcalina (é uma base), logo, possui afinidade pelo corante eosina, o qual é um ácido, portanto, nesta reação de citoplasma com a eosina, forma-se um sal róseo mais água. Assim, o citoplasma apresenta acidofilia e/ou eosinofilia. A água formada pela reação de um ácido com uma base e de uma base com um ácido será retirada na etapa da coloração (d) – desidratação. Saiba mais BEÇAK, W. Técnicas de citologia e histologia. 1 ed. Rio de Janeiro: Livros Técnicos e Científicos S. A., 1976. BEÇAK, W. Técnicas de citologia e histologia. São Paulo: Nobel, 1970. BEHMER, A. O.; TOLOSA, E. M. C.; NETO, A. G. F. Manual de técnicas para histologia normal e patológica. 1 ed. São Paulo: Edart, 1976. MAIA, V. Técnica histológica. 2 ed. São Paulo: Atheneu, 1979. MICHALANY, J. Técnica histológica em anatomia patológica. 1 ed. São Paulo: E. P. U., 1980. O microscópio óptico composto (MOC), ou microscópio de luz, é um aparelho que serve para auxiliar a observação de objetos que não podem ser percebidos com a vista desarmada, dois pontos separados 34 Unidade I por uma distância menor que 0,2mm parecem-nos constituir um só ponto. Com o auxílio da lente, torna-se possível individualizar pontos muitos próximos (a isto chamamos poder de resolução da lente/do microscópio). O sistema lâmina-objeto-lamínula é colocado sobre a perfuração da platina, placa metálica, fixa ou móvel, circular ou quadrangular, de acordo com o tipo e marca do aparelho. Geralmente, as lâminas citológicas/histológicas medem 76x26x1mm, e as lamínulas 10x17x0,1mm. Ambas devem ser guardadas em álcool e lavadas em água, bicromato de potássio e ácido sulfúrico, na proporção de 10:1:1 (é a solução sulfocrômica). O canhão é um tubo metálico, em cujas extremidades estão montados dois sistemas de lentes: o sistema ocular, na extremidade superior, próximo ao olho do observador; e o sistema objetivo, na outra extremidade; portanto, próximo ao objeto a ser examinado/ observado. O canhão, em geral, mede 16 a 17 cm. O aumento do objeto observado é obtido pelo produto dos aumentos da ocular e das objetivas, assim, se a ocular for igual a 10x, e a objetiva, 4x, o aumento total é de 40x (geralmente é o menor aumento dos microscópios de luz, pois os outros aumentossão: 100x, 400x e 1000x). Há microscópios com apenas uma ocular e outros com duas oculares, respectivamente, monocular e binocular. O sistema objetivo (a) consta de duas ou mais lentes superpostas. Para um dos sistemas objetivos do microscópio (objetiva de imersão), em geral identificável por uma circunferência preta, interpõe-se entre a lamínula e a objetiva uma gota de óleo de cedro (óleo de imersão com índice de refração 1,575). Tal procedimento visa captar os feixes luminosos desviados quando se usam objetivas secas, pelas superfícies da lâmina. Lembre-se sempre de que a nitidez da imagem depende da objetiva, então, a nitidez será máxima com grandes aumentos, objetivas de 100x de aumento e pequenas oculares. O revólver localiza-se na parte inferior do canhão, sua função é de cambiar (revolver) as objetivas (é bom lembrar que se deve iniciar a observação utilizando-se a objetiva de menor aumento). Há os parafusos de focalização, o macrométrico (para a primeira focalização) e o micrométrico, este acha-se no centro do macrométrico (para a focalização com nitidez). Estes parafusos, para maior comodidade, são monoaxiais. A platina é dotada de um sistema Charriot, que, além de prender a lâmina, move-a nos sentidos horizontais e verticais, como também de nônios para micrometria. O sistema condensador é constituído por: condensador, diafragma e filtro. Há um parafuso para mover tal sistema, como peças independentes de manuseio do diafragma. O condensador é um sistema de lentes, concentra os raios luminosos para a objetiva. O diafragma tem a função de eliminar raios luminosos e deve ser utilizado tanto aberto como fechado. Quanto maior for o aumento, maior a necessidade de raios luminosos. O filtro filtra os raios luminosos. A lâmpada (fonte luminosa) localiza-se no pé do microscópio. São marcas de excelentes microscópios de luz (MOC): Zeiss, Nikon, Olympus, Carton, Wildieitz, entre outras. Portanto, esse aparelho é constituído por peças ópticas (oculares, objetivas e condensador) e por peças mecânicas (tubo ou canhão, revólver, platina, parafusos do sistema Charriot, do sistema condensador, parafuso macro e micrométrico, base ou pé, platina ou mesa). Sobre a focalização, são suas etapas: certificar-se da voltagem, 110 volts ou 220 volts, antes de ligar a luz, iluminar o aparelho, abaixar a platina, certificando-se de que a objetiva inicial de trabalho é de menor aumento (4x), colocar a lâmina sobre a platina, posicionando o material da lâmina no orifício da platina para que o feixe de luz o atravesse. Em seguida, usar o parafuso macrométrico, erguendo a platina vagarosamente, até encontrar a imagem desejada. Após tal encontro, manusear o parafuso micrométrico para ajuste perfeito (nitidez total). Para mudar de aumento, isto é, para focalizar com aumento de 100x (ocular de 10x e objetiva de 10x), apenas revolva a objetiva de 4x, usando a de 10x, e mova apenas o parafuso micrométrico. Se for necessário, realize ajuste no Charriot. Faça o mesmo procedimento para o aumento de 400x. Não mova 35 CITOLOGIA mais o parafuso macrométrico. O microscópio deve ser transportado com as duas mãos, uma no estativo ou braço e a outra na base ou pé. Há outros microscópios utilizados em Citologia e Histologia, são exemplos: microscópio eletrônico de transmissão (MET) e de varredura (MEV), microscópio de contraste de fase e de contraste diferencial de interferência, microscópio confocal, microscópico de campo escuro, microscópio ultravioleta, microscópio de fluorescência, microscópio de polarização e microscópico de força atômica. Há também outras técnicas, são exemplos: a) cultura de células e de tecidos; b) radioautografia; c) fracionamento celular (centrifugação celular); d) citoquímica e histoquímica; e) imunocitoquímica; f) hibridização. Essas técnicas serão estudas na ciência Histologia. Nesta ciência, realizaremos comentários sobre: Citoquímica e Hibridização ou hibridação celular. A citoquímica é utilizada para identificar e localizar substâncias nas células e/ou entre as células (no material extracelular), em cortes histológicos e/ou em culturas celulares. Para que uma reação citoquímica e ou histoquímica seja válida, os compostos a serem analisados não podem ser difusíveis, daí a importância da utilização do fixador correto. São utilizados fixadores para insolubilização quase total do composto/substância a ser estudada/pesquisada. Utilizam-se fixadores com álcool para estudo do glicogênio (que é hidrossolúvel). Evita-se o uso de fixadores ácidos nas técnicas para visualização de fosfato de cálcio, que se dissolve em meio ácido. Em algumas destas técnicas/reações cito e histoquímicas, a intensidade da cor produzida é proporcional à concentração da substância analisada. Nestes casos, se aplica a Lei de Lambert-Beer, que permite, com auxílio do histofotômetro, dosar as substâncias nas células e nos tecidos. As técnicas citoquímicas e histoquímicas são reações específicas e se fazem com o uso da contraprova para não deixar margens de dúvidas. Esse método produz como resultante substâncias químicas que são insolúveis, apresentam certa coloração no MOC e são elétron-densas (constituídas por elementos químicos de grande número atômico) para a MET. O elemento químico ferro da quebra da proteína hemoglobina pode ser observado “em azul-celeste” no baço pela histoquímica do H&E + Pearls, já o elemento químico cálcio pode ser visto em áreas de calcificação do disco epifisário dos ossos longos em preto. O DNA ou ADN é revelado no núcleo das células pela técnica do Feulgen em púrpura (coloração avermelhada). Em cortes do órgão testículo, o DNA, além de ser visto no núcleo, também pode ser observado no interior das mitocôndrias existentes na cauda (no flagelo do espermatozoide). As enzimas, como as fosfatases, podem ser vistas em células renais pelas técnicas de Gomori e Hölt, respectivamente, fosfatase alcalina na coloração bem escura – preto – e fosfatase ácida, na coloração mais clara – marrom avermelhado. O glicogênio (tipo de polissacarídeo) pode ser demonstrado pela técnica do ácido periódico com o reativo de Schiff (PAS) na coloração vermelho-magenta (tipo de roxo avermelhado), nas células hepáticas e musculares. A técnica do Alcian Blue revela glicoproteínas (secreções mucosas – contêm proteínas, água e açúcar) na coloração azulada. Lipídios podem ser observados pela imagem positiva através da técnica de Sudam IV e Sudam Black, na coloração escura, e na forma de imagem negativa (ausência no material, devido à técnica empregada) pela técnica do H&E. Técnicas citadas anteriormente são utilizadas em diagnósticos laboratoriais de várias doenças, as quais acumulam no organismo o elemento químico ferro, glicogênio e tipos diferentes de lipídios. Nas técnicas de imunocitoquímica, ocorre reação de uma proteína denominada de anticorpo e produzida pelo organismo nas células plasmócitos (imunoglobulina – IG), com uma determinada molécula que foi introduzida no organismo e reconhecida pelo anticorpo. Há dois procedimentos técnicos desta técnica: 1. Técnica direta de imunocitoquímica; e 2. Técnica indireta de imunocitoquímica. A técnica de hibridização ou hibridação visa analisar moléculas que estão envolvidas em diversos processos celulares, tais como: replicação e transcrição do 36 Unidade I DNA. Consiste na ligação entre duas moléculas, por exemplo, DNA com DNA e/ou RNA com RNA e até RNA com DNA (o DNA possui cadeia dupla, porém é utilizada apenas uma única cadeia). O mRNA – RNA mensageiro possui apenas uma única cadeia. Nesta ligação entre cadeias, uma deve reconhecer a outra (através das bases nitrogenadas), constituindo novas cadeias duplas. Sobre a interpretação de cortes em células e nos tecidos Sobre a interpretação de cortes em células e nos tecidos, durante a observação no MOC, deve-se “reconstruir mentalmente” a forma pela qual foi feito o corte, em três dimensões. Assim, imagine um “pão de forma”. Há neste pão um maior eixoe um menor eixo, os cortes, secções neste pão, foram realizado no menor eixo, logo, são ditos transversais. Já no pão utilizado para hot dog, a secção foi realizada no maior eixo, logo, é dito longitudinal. Uma secção longitudinal num ovo cozido, que não secciona a gema, apenas a clara, é dito longitudinal excêntrico e, se foi realizado bem perifericamente, também não seccionando a gema, o corte é dito tangencial. As imagens observadas no MOC não são em três dimensões, apenas em duas, portanto, cabe ao estudante realizar a construção da imagem em três dimensões. Para não deixar dúvidas ao estudante, cabe realizar esses tipos de cortes em diversos materiais, tais como: laranja ou limão, ovos cozidos, pecíolo da planta mamona – Ricinus comunis e no fruto abacate, e reproduzi-los com lápis preto num caderno de desenho. O exercício descrito a seguir deverá enriquecer seus conhecimentos sobre processos de interpretação de cortes: imagine uma célula com três mitocôndrias dispostas no citoplasma de formas diferentes. Uma delas encontra-se inclinada, a segunda, numa posição vertical e a terceira, na horizontal. Realizando um corte, uma secção transversal na célula e consequentemente nestas três mitocôndrias, pergunta-se: como serão interpretados os cortes nas mitocôndrias? Resposta: na mitocôndria inclinada, a imagem será de corte do tipo oblíquo (sempre revela estruturas elípticas – com pontas afiladas), na segunda mitocôndria (“em pé”), a imagem será de corte transversal e, na terceira (deitada), a imagem será de corte longitudinal. Portanto, uma secção transversal nunca vai seccionar todos os componentes celulares transversalmente, pois estes apresentam localização diversa, forma irregular e posicionamento complexo no citoplasma. 2 CONSTITUIÇÃO QUÍMICA DA CÉLULA EUCARIÓTICA (CÉLULA TÍPICA) Protoplasma é a denominação dada para a matéria viva, enquanto paraplasma, para a matéria morta. Na constituição química do protoplasma há componentes inorgânicos (água e sais minerais) e orgânicos (os principais são: proteínas, hidratos de carbono, lipídios e ácidos nucleicos). Portanto, a matéria que é formada por elementos químicos na forma pura e, combinada, constitui vários tipos de compostos classificados em inorgânicos e orgânicos. Compostos inorgânicos: água é o componente mais comum, constituindo cerca de 70% do protoplasma. É solvente de soluções verdadeiras e fase dispersante de coloides. A desidratação do organismo e, consequentemente, das células, é grave. Elevadas quantidades de água ficam retidas entre as células do tecido conjuntivo, na substância intersticial amorfa. Os sais minerais são os solúveis, constituem o soluto das soluções verdadeiras; muitas vezes, são mencionados como seus precursores (ácidos, como o ácido úrico, e bases, como o hidróxido de cálcio). 37 CITOLOGIA Compostos orgânicos proteínas: são compostos formados por aminoácidos, ora constituindo células, ora armazenadas na célula como produto do metabolismo e/ou como produto de secreção celular (saída de material da célula). Quando os constituintes das proteínas, os aminoácidos, formam cadeias de médio peso molecular, temos os peptídeos e/ou quando de grande peso molecular, as proteínas. São ditas proteínas simples quando na constituição só há aminoácidos. Quando as proteínas apresentarem grupos prostéticos, como carboidratos (glicose) aderidos na proteína, são ditas proteínas conjugadas. Pela união de dois aminoácidos (cada aminoácido é formado por três bases nitrogenadas; por exemplo, CUG é o aminoácido valina, em que C é a base nitrogenada citosina, U é a uracil/uracila e G é a guanina), forma-se um dipeptídeo; pela união de três, um tripeptídeo; e pela união de vários, um polipeptídeo. A união entre os aminoácidos é feita através de uma ligação química denominada peptídica, entre o OH do grupo COOH de um aminoácido com o H+ do grupo NH2 do outro aminoácido; portanto, nesta ligação, ocorre a formação de uma molécula de água. Proteoglicanas são proteínas conjugadas, exemplo: glicosaminoglicanas (não formam cadeia ramificada); glicoproteínas (formam cadeia ramificada) Algumas glicosaminoglicanas apresentam sulfato, isto é, são sulfatadas, como o ácido condroitinosulfúrico. O ácido hialurônico não é sulfatado. São exemplos de glicoproteínas: tireoglobulina da glândula endócrina tiroide, os hormônios gonadotrofinas: LH (hormônio luteinizante – responsável pela ovulação); ICSH (hormônio estimulante das células intersticiais dos testículos – produzem testosterona); FSH (hormônio folículo estimulante, que age no processo de crescimento e maturação do folículo ovariano); LTH (hormônio luteotrófico ou prolactina – age nas glândulas mamárias/mamas). As glicosaminoglicanas são muito hidrófilas (gostam da água), realizam a retenção da água, como já dito, na substância intersticial amorfa do tecido conjuntivo. Sobre os aminoácidos: são elementos considerados nutrientes que formam/constituem as proteínas. Na natureza, há vinte aminoácidos, nove são obtidos através do processo da alimentação, pois não são produzidos, isto é, não são sintetizados pelo organismo; daí, a denominação para estes de aminoácidos essenciais. Estudos revelam que há mais de quinhentos aminoácidos descobertos, porém apenas vinte formam o universo das proteínas (há um número superior a 80.000 proteínas). Aminoácidos são assim definidos quimicamente: são nutrientes provenientes da introdução de um radical amina (NH2) em substituição a um hidrogênio na molécula de um ácido carboxílico. Quando o organismo, através de reações de transaminações, não consegue sintetizar um tipo de aminoácido, este é denominado de essencial. No processo da ingestão de alimentos de origem vegetal e animal, obtêm-se as proteínas, as quais serão degradas pela via enzimática no tubo digestivo, produzindo os aminoácidos. Estes serão absorvidos pelas células e utilizados para a produção de “novas proteínas” pelos ribossomos. Os aminoácidos essenciais são: valina, leucina, isoleucina, triptofano, fenilalanina, histidina, metionina e treonina. Os demais aminoácidos são: serina, glicina, asparagina, tirosina, cisteína, prolina, ácido glutâmico, ácido aspártico, glutamina, arginina e alanina. No ser humano, há mais de cem diferentes tipos de proteínas, como a proteína colágeno, a qual é a mais abundante, e o seu principal aminoácido é a prolina. É importante ao estudante de Ciências Biológicas obter conhecimentos sobre o “papel” de cada aminoácido. Os aminoácidos valina, leucina e isoleucina são denominados de aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA’s), são suas funções: aumentam a produção das proteínas que atuam como fonte de energia durante diversas atividades, como exercícios, portanto, aumentam a resistência e reduzem a fadiga. Quando ocorrer deficiência de aminoácidos no organismo, surgirão distúrbios, deficiências (problemas no crescimento, na renovação do colágeno, entre muitos outros), pois proteínas não serão produzidas. Conclui-se que alimentação balanceada e diversificada é a base sólida para a saúde física e mental. 38 Unidade I Hidratos de carbono ou carboidratos ou glicídio: sua formulação mínima é assim representada: CH2O. São exemplos: as pentoses (tipos de açúcares) C5H10O5 e as hexoses (outros tipos de açúcares) C6H12O6. As pentoses importantes são as encontradas nos ácidos nucleicos, ribose no DNA e desoxirribose no DNA. Glicose, frutose, galactose são monossacarídeos; maltose e sacarose são dissacarídeos; celulose, amido, glicogênio são polissacarídeos. Doces (açúcares) são apenas os mono e dissacarídeos, polissacarídeos não são doces, são insolúveis (celulose) ou formam coloides (amido). É importante ressaltar que os carboidratos são utilizados tanto como combustíveis como também para estruturações/ construções de estruturas celulares. Lipídios/gorduras: estas substâncias resultam da reação entre um álcool (glicerol, álcool etílico, entre outros,) e um ácido carboxílico (palmítico, esteárico, oleico).
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