Identificação de Bactérias por Coloração de Gram e Provas Bioquímicas

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Júlia Boff Fabbris
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2º Aula Prática: Microbiologia Clínica
Preparação lâmina - coloração de gram:
Para a identificação da bactéria, deve-se realizar a coloração de gram, assim,
identificamos a morfologia, o que facilita na determinação da espécie, após as provas
bioquímicas.
Sendo assim, pegamos a amostra de urina a ser analisada e com o auxílio de uma alça,
espalhou-se a amostra na lâmina. Para fixar a amostra na lâmina utilizou-se o bico de bunsen,
o fogo faz com que a urina se “prenda” na superfície, o que é importante para que, com os
passos da coloração de gram (figura 1), a amostra não saia com as lavagens. A importãncia e
diferenciação entre gram positivo e gram negativo foi explicada no relatório da primeira aula
prática .
Figura 1: Etapas coloração de gram
Figura 2 e 3: Fixando amostra na lâmina e Lâmina após os processos.
Semeadura em Ágar MacConkey:
A semeadura para a urocultura é feita com o auxília de uma alça calibrada, deve-se
pegar um pouco da amostra e utilizar a técnica quantitativa. A técnica quantitativa consiste
em distribuir o material coletado por toda placa, estriando continuamente até o final da placa
a fim de realizar a contagem das colônias (LIMA, 2013).
O Ágar MacConkey é considerado um dos primeiros meios de cultivo para bactérias
gram negativas indicando a fermentação por lactose. Recomenda-se a utilização do Ágar
MacConkey em amostras clínicas que contenham microbiota mista, como urina, fezes, feridas
e secreções. As bactérias gram negativas se desenvolvem melhor com essa técnica e se
diferenciam por apresentarem a habilidade de fermentar a lactose (LABORCLIN, 2019)
Diferente dos outros meios de cultura, o Ágar MacConkey é seletivo, pois apresenta
combinação de sais biliares e o cristal violeta, que inibem os microrganismos gram positivos,
assim reduzindo relativamente doenças causadas por bactérias ou protozoários presentes nas
fezes. Além disso, um dos diferenciais do Ágar MacConkey é que as bactérias gram
negativas produzem colônias na cor rosa. As incapazes de fermentar permanecem incolores
(LABORCLIN, 2019).
Figura 4 e 5: Técnica utilizada e Placa do ágar Macconkey.
Provas Bioquímicas:
Com o auxílio de uma agulha, retirou-se uma coolônia isolada do ágar. No meio
citrato semeou-se a amostra em estria sobre a superfície do meio. No meio EPM semeou-se
por profundidade e em estria sobre a superfície do meio. No meio MILi, semeou-se por
profundidade através de picada central.
O tubo com o meio EPM é uma modificação do meio de Rugai e Araújo e contém os
seguintes testes: produção de gás por fermentação da glicose, produção de H2S, hidrólise da
uréia e desaminação do triptofano. O tubo com o meio MILi é utilizado para avaliar a
motilidade, produção de indol e descarboxilação da lisina. Os sete testes, quando
considerados com os resultados da reação de fermentação da lactose observada nas placas de
isolamento (lactose positiva ou negativa), permitem identificar presuntivamente as seguintes
enterobactérias: Shigella, Salmonella, E. coli e Y.enterocolítica (PROBAC).
A utilização do citrato revela-se pelo aparecimento de cor azul na superfície do meio.
O teste deve ser considerado negativo quando a cor do meio não sofrer alteração
A utilização do meio EPM é para as seguintes análises:
● Fermentação da glicose: cor amarela
● Produção de gás: formação de bolhas ou deslocamento do meio do fundo do tubo
● Produção de H2S: Enegrecimento do meio em qualquer intensidade
● Hidrólise da uréia: Aparecimento da cor azul ou verde-azulada (reação fraca) que se
estende para a base do meio, envolvendo-a totalmente ou não
● Desaminação do Triptofano: aparecimento de cor verde-garrafa no superfície do meio.
Quando a reação é negativa, a superfície do meio adquire cor azul ou, raramente,
amarelo.
Já a utilização do meio MILI é para identificar:
● Motilidade: a bactéria móvel cresce além da picada turvando parcial ou totalmente o
meio. A bactéria imóvel cresce somente na picada.
● Descarboxilação da Lisina: quando a lisina é descarboxilada, o meio adquire cor
púrpura acentuada ou discreta. Quando o aminoácido não é utilizado, o meio adquire
cor amarela nítida nos seus 2/3 inferiores. Considerar o teste positivo sempre que o
meio não estiver amarelo
● Produção de indol: após a leitura dos testes de motilidade e lisina, adicionar 3 a 4
gotas de reativo de Kovacs a superfície do meio e agitar levemente. Quando a bactéria
produz indol, o reativo adquire cor rosa ou vermelha. Quando não o produz, o reativo
mantém a sua cor inalterada (PROBAC).
Figura 6: Meios para provas bioquímicas
Antibiograma:
Para a realização do antibiograma utilizamos a amostra (já preparada em tubidez
padrão de acordo com a escala de mcfarland) empregnada em um swab, com esse swab
semeamos a placa fazendo a técnica de tapete, fazendo as estrias por 4 vezes em toda a placa,
em 4 direções diferentes. Após isso, selecionamos os antibióticos para colocarmos na placa,
foram eles: Meropenem, Cloranfenicol, Ceftriaxona, Ciprofloxacino, Norfloxacino,
Ampicilina. Os resultados serão analisados na próxia aula.
Conhecido como um dos melhores meios de cultura para a realização de Testes de
Sensibilidade aos Antimicrobianos (TSA), o Ágar Mueller Hinton, também chamado de
Antibiograma, atesta se uma bactéria é sensível ou não a certos antibióticos. Umas das
vantagens do Ágar Mueller Hinton é que ele possui nutritiva fonte de proteínas e carboidratos
que proporcionam o rápido desenvolvimento das bactérias analisadas. Além disso, o Ágar
Mueller Hinton é a técnica padrão recomendada pela Organização Mundial da Saúde (OMS)
para essa finalidade. (LABORCLIN, 2019).
A bactéria positiva é ligeiramente menos nociva ao organismo, uma vez que ela pode
ser combatida com mais sucesso pelos antibióticos. Isso é possível porque a sua parede, ou
seja, a sua proteção, tem menos resistência e os compostos antibióticos podem destruir a
bactéria com mais facilidade. Já as negativas são as bactérias mais perigosas, mais
contagiosas e mais difíceis de ser tratadas por causa da alta resistência que apresentam a
diversos antibióticos. Diferente das bactérias positivas e as negativas têm uma parede bem
mais resistente e, claro, ela impede que os medicamentos as atinjam. (FAIKO)
Figura 7 : Antibiograma pronto para inoculação.
Análise microscópica lâmina gram:
Com o auxílio do microscópio, conseguimos observar a morfologia da bactéria que
foi semeada. Trata-se de bacilos Gram-negativos.
As bactérias Gram-negativas são classificadas pela cor que adquirem depois de
submetidas a um processo químico denominado coloração de Gram. As bactérias
Gram-negativas adquirem coloração vermelha quando se usa esse processo. As outras
bactérias adquirem coloração azul. Elas são chamadas bactérias Gram-positivas. As bactérias
Gram-negativas e Gram-positivas têm a coloração diferente porque suas paredes celulares são
diferentes. Elas também causam tipos diferentes de infecções e tipos diferentes de
antibióticos são eficazes contra elas.(BUSH, 2020)
Alguns são microrganismos comensais encontrados na flora intestinal normal. Esses
microrganismos comensais e outros, provenientes de reservatórios animais ou ambientais,
podem causar doenças tais como infecções do trato urinário, diarreia, peritonite e infecções
da circulação sanguínea. (BUSH, 2020)
Figura 8 e 9: Bacilos Gram negativos
Análise resultados do ágar nutriente:
Essa etapa foi muito importante para identificarmos os erros e acertos da técnica. O
erro principal que podemos identificar é a ultíma parte da semeadura encostando na primeira.
Isso faz com que a colônia não seja devidamente isolada, a primeira parte, com maior número
de bactérias se espalha para a última, onde deveria possuir menor número. Outra sugestão
seria pegar uma menor quantidade de amostra, assim, a colônia poderia ser melhor
visualizada.
Segundo Lima, a técnica de esgotamento em placa consiste em depositar o material
coletado sobre uma parte da placa e depois espalhá-lo com a alça de platina em camposdiferentes de modo a obter quantidades progressivamente menores do material (LIMA,2013).
Figura 10 e 11: Técnica de Esgotamento em Semeadura no Ágar Nutriente
Referências:
BUSH. L.M. Introdução a bacilos gram negativos, 2020. Disponível em:
https://www.msdmanuals.com/pt-br/profissional/doen%C3%A7as-infecciosas/bacilos-gram-n
egativos/introdu%C3%A7%C3%A3o-a-bacilos-gram-negativos
FAIKO, Relembre aqui: qual a diferença entre gram positivo e gram negativo?
Disponível em:
https://faikojalecos.com.br/relembre-aqui-qual-a-diferenca-entre-gram-positivo-e-gram-negat
ivo/
LABORCLIN. Ágar MacConkey, 2019. Disponível em;
https://www.laborclin.com.br/agar-macconkey-o-mais-antigo-e-eficiente-meio-de-cultura-par
a-bacterias/
LABORCLIN. Ágar Mueller Hinton, 2019. Disponível em:
https://www.laborclin.com.br/agar-mueller-hinton-tsa-com-agilidade-e-seguranca/
LIMA. C.C.T, Portal da Educação: Cultivo de microrganismos com técnica quantitativa e de
esgotamento, 2013. Disponível em:
https://siteantigo.portaleducacao.com.br/conteudo/artigos/farmacia/cultivo-de-microrganismo
s-com-tecnica-quantitativa-e-de-esgotamento/47599
PROBAC. Provas Bioquímicas. Disponível em:
http://www.probac.com.br/Anexos/Bulas/Identifica%C3%A7%C3%A3o/EPM-MILi%20Rev.
02.pdf