Prova de Microbiologia Veterinária (Bacteriologia)- Gabaritada

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Microbiologia Veterinária
P2 bacteriologia – Nota (5,5)
2021-1
Discentes: Jaqueline Tavares Tito e Gabriel Natal Ibrahim
CASO CLÍNICO 1
1. Proprietário solicitou atendimento veterinário para avaliar a possibilidade de
mastite na produção leiteira. Para isso foi realizado o exame CMT
(CaliforniaMastitTest) para detecção de mastite subclínica. Foram coletadas
amostras de leite de dois animais positivos na prova. No cultivo
microbiológico, observou-se, de ambas as amostras, somente crescimento em
Agar Sangue, sem crescimento em Agar MacConkey. Verificou-se também que
ambos apresentavam beta hemólise no Agar Sangue. Seguiu-se então os
procedimentos diagnósticos, conforme abaixo:
Animal 1:
coloração de Gram
prova da catalase
CAMP test
Animal 2:
Coloração de Gram
prova da catalase
Tira A representa o resultado da prova da oxidase para esse
microrganismo
prova da coagulase
Agar Manitol Sal
Acerca das informações acima, responda:
1.1(1,0) No caso descrito, com qual finalidade utilizamos a prova da catalase
no diagnóstico laboratorial e qual o princípio dessa análise microbiológica?
A finalidade da prova da catalase é diferenciar as famílias das bactérias Gram
positivas, Streptococcaceae e Enterococcaceae quando catalase negativa e
Micrococcaceae e Staphylococcaceae quando catalase positiva. O princípio dessa
análise é que a catalase é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio
(H2O2) em água e oxigênio. Então, quando o resultado é positivo, ocorre a
formação de bolhas por conta da liberação do gás oxigênio indicando que a bactéria
possui a enzima catalase e, quando a ausência de bolhas o resultado é negativo,
indicando que a bactéria não possui a enzima catalase.
1.2 (1,0) Em relação ao fator CAMP, responda: Qual o fundamento da prova de
CAMP no diagnóstico laboratorial e qual a atuação desse fator de virulência na
patogenia da mastite?
A prova de CAMP é um teste realizado no Ágar Sangue, normalmente com o
objetivo de identificar Streptococcus -hemólise. O princípio do teste se baseia na
formação de uma substância capaz de aumentar a hemólise produzida pela bactéria
a partir da -hemolisina a partir do Staphylococcus aureus. O Staphylococcus
aureus é estriado no centro da placa de Ágar Sangue, em uma linha vertical,
enquanto as amostras vão ser estriadas de modo horizontal, de modo em que elas
ficam próximas (mas a pelo menos 1mm de distância) e paralelas a linha vertical
formada pelo Staphylococcus aureus. Após o período de incubação de 37°C durante
24h, é possível realizar a leitura do teste. A positividade na prova se dá a partir do
alargamento da zona de lise, que adquire um formato semelhante a ponta de uma
flecha, entre a amostra suspeita (estreptococos) a ser analisada, e a
Staphylococcus aureus que foi estreada no centro da placa. A atuação desse fator
de virulência CAMP na mastite é que ele é uma proteína da família das bactérias
Streptococcaceae que consegue formar poros na membrana das células do
indivíduo infectado. Além disso, ele também consegue se ligar na porção Fc das
imunoglobulinas IgM e IgG, impedindo as de realizarem sua ligação com agente
etiológico, causador da mastite.
1.3 (1,0) Qual a suspeita clínica no causador na mastite no animal 1.
EXPLIQUE DETALHADAMENTE SUA RESPOSTA COM BASE EM TODO O
PROCESSO DE ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO (necessário explicar, na
ausência de explicação, a questão será considerada incorreta)
A suspeita é de Streptococcus.
● Leitura das placas:
Como não houve crescimento em Ágar MacConkey, indica a presença de bactérias
Gram Positivas, pois o Ágar MacConkey é um meio de plaqueamento seletivo que
possui inibidores, sais biliares e cristal violeta, que inibem o crescimento de
microorganismos Gram positivas. Já no Ágar Sangue, houve o crescimento de uma
colônia que apresentou -hemólise (que tem a capacidade de fazer hemólise).
● Isolamento das colônias:
Com isso, coletamos a colônia do Ágar Sangue e passamos novamente no caldo
BHI de forma isolada, e incubamos por 24h a 37°C.
● Preparação de lâminas:
Após o isolamento das colônias, tem-se a preparação das lâminas, que é feita
dentro da estufa bacteriológica, onde o caldo BHI com as bactérias é coletado com
o auxílio de uma alça, e é estriado nas lâminas. Após esse processo, é
recomendado que segure a ponta da lâmina com um pregador ou uma pinça, e
passe a lâmina sob a chama do bico de Bunsen, que ajuda no processo de fixação
das bactérias na lâmina para que posteriormente não sejam removidas no processo
de coloração.
● Coloração de Gram:
É um tipo de coloração de bactérias que permite observar e identificar suas
estruturas. Primeiramente, é usado o Cristal Violeta durante 1 minuto, depois o
corante é lavado da lâmina com água destilada. A seguir, é adicionado um outro
corante, o Lugol, que é deixado por 1 minuto também, e é retirado da mesma forma
que o Cristal Violeta. Depois disso, se tem o passo de descoloração, onde o álcool
pode ser usado, no período de 20 segundos. E após a lavagem, se tem a Fucsina,
que é deixada por 30 segundos, e depois da lavagem, a lâmina deve secar antes de
ser visualizada no microscópio.
● Visualização no Microscópio:
No microscópio é possível observar a presença de cocos Gram Positivos,
agrupados entre si em forma de cadeia. Devido a conformação e morfologia
apresentada pela bactéria, pode-se iniciar a suspeita de Streptococcus.
● Massa bacteriana:
Com a amostra no caldo BHI, é possível fazer a massa bacteriana das
amostras,com a utilização do Ágar BHI. Essa massa será utilizada para os testes
bioquímicos, que tem como objetivo mostrar o metabolismo e comportamento
microbiano através dos fenótipos observados nos tubos das provas bioquímicas,
identificando assim, o genótipo do microrganismo estudado
● Análise das Provas Bioquímicas:
Nessa amostra foram feitas dois testes:
Catalase (Negativo): Com a alça bacteriológica ou com um palito coleta-se o centro
de uma colônia suspeita e esfrega-se em uma lâmina de vidro. Colocar sobre este
esfregaço uma gota de água oxigenada a 3% e observar se houve, ou não, a
formação de bolhas. Na amostra coletada do Animal 1, não houve a formação de
bolhas, indicando que o teste de catalase deu negativo, fazendo que seja possível a
exclusão das famílias Staphylococcaceae e Micrococcaceae. Deixando apenas
como possibilidade as famílias Streptococcaceae e Enterococcaceae.
Teste CAMP (Positivo): A prova de CAMP é um teste realizado no Ágar Sangue,
normalmente com o objetivo de identificar Streptococcus -hemólise. O princípio do
teste se baseia na formação de uma substância capaz de aumentar a hemólise
produzida pela bactéria a partir da -hemolisina a partir do Staphylococcus aureus.
Na imagem apresentada no enunciado da para se observar uma formação
semelhante a ponta de uma flecha, entre a amostra suspeita e o estriamento de
Staphylococcus aureus no centro da placa. Essa formação indica que o resultado do
teste é positivo, confirmando a suspeita clínica de Streptococcus.
1.4 (1,0) Qual a suspeita clínica no causador na mastite no animal 2.
EXPLIQUE DETALHADAMENTE SUA RESPOSTA COM BASE EM TODO O
PROCESSO DE ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO (necessário explicar, na
ausência de explicação, a questão será considerada incorreta).
A suspeita é de Staphylococcus aureus.
● Leitura das placas:
Como não houve crescimento em Ágar MacConkey, indica a presença de bactérias
Gram Positivas, pois o Ágar MacConkey é um meio de plaqueamento seletivo que
possui inibidores, sais biliares e cristal violeta, que inibem o crescimento de
microorganismos Gram positivas. Já no Ágar Sangue, houve o crescimento de uma
colônia que apresentou -hemólise (que tem a capacidade de fazer hemólise).
● Isolamento das colônias:
Com isso, coletamos a colônia do Ágar Sangue e passamos novamente no caldo
BHI de forma isolada, e incubamos por 24h a 37°C.
● Preparação de lâminas:
Após o isolamento das colônias, tem-se a preparação das lâminas, que é feita
dentro da estufa bacteriológica, onde o caldo BHI com as bactérias é coletado com
o auxíliode uma alça, e é estriado nas lâminas. Após esse processo, é
recomendado que segure a ponta da lâmina com um pregador ou uma pinça, e
passe a lâmina sob a chama do bico de Bunsen, que ajuda no processo de fixação
das bactérias na lâmina para que posteriormente não sejam removidas no processo
de coloração.
● Coloração de Gram:
É um tipo de coloração de bactérias que permite observar e identificar suas
estruturas. Primeiramente, é usado o Cristal Violeta durante 1 minuto, depois o
corante é lavado da lâmina com água destilada. A seguir, é adicionado um outro
corante, o Lugol, que é deixado por 1 minuto também, e é retirado da mesma forma
que o Cristal Violeta. Depois disso, se tem o passo de descoloração, onde o álcool
pode ser usado, no período de 20 segundos. E após a lavagem, se tem a Fucsina,
que é deixada por 30 segundos, e depois da lavagem, a lâmina deve secar antes de
ser visualizada no microscópio.
● Visualização no Microscópio:
No microscópio é possível observar a presença de cocos Gram Positivos,
agrupados entre si em forma de cachos (semelhante a cacho de uvas). Devido a
conformação e morfologia apresentada pela bactéria, pode-se iniciar a suspeita de
uma bactéria da família Staphylococcaceae.
● Massa bacteriana:
Com a amostra no caldo BHI, é possível fazer a massa bacteriana das
amostras,com a utilização do Ágar BHI. Essa massa será utilizada para os testes
bioquímicos, que tem como objetivo mostrar o metabolismo e comportamento
microbiano através dos fenótipos observados nos tubos das provas bioquímicas,
identificando assim, o genótipo do microrganismo estudado
● Análise das Provas Bioquímicas:
Nessa amostra foram feitas quatro testes:
Catalase (Positivo): Com a alça bacteriológica ou com um palito coleta-se o centro
de uma colônia suspeita e esfrega-se em uma lâmina de vidro. Colocar sobre este
esfregaço uma gota de água oxigenada a 3% e observar se houve, ou não, a
formação de bolhas. A catalase é essencial na diferenciação de famílias Gram
Positivas. Na amostra coletada do Animal 2, houve a formação de bolhas, indicando
que o teste de catalase deu positivo, fazendo que seja possível a exclusão das
famílias Streptococcaceae e Enterococcaceae. Deixando apenas como
possibilidade as famílias Staphylococcaceae e Micrococcaceae.
Oxidase (Negativo): Os microorganismos que não possuem citocromo C em sua
cadeia respiratória não oxidam o reagente, deixando-o incolor e por isso, são
negativos para a oxidase. A oxidase é fundamental para a diferenciação entre as
famílias Staphylococcaceae e Micrococcaceae. Como o resultado foi negativo, a
bactéria é do gênero Staphylococcus.
Coagulase (Positivo): A coagulase serve para verificar se o microrganismo possui
a coagulase ou fator aglutinina, que reagindo com um fator plasmático forma um
complexo que atua no fibrinogênio do plasma formando a fibrina. A coagulase é um
teste essencial na diferenciação de espécies do gênero Staphylococcus. O
resultado do teste do animal 2 foi positivo, e com isso, indica a suspeita de 3
espécies de Staphylococcus: S. intermedius, S. hyraus e S.aureus.
Ágar Manitol Sal (Meio com um tom amarelado): Esse ágar é um meio seletivo
para o isolamento de Staphylococcus patogênicos. A degradação do manitol com a
produção de ácido altera a cor do meio de rosa para um tom amarelado, que indica
o crescimento de S.aureus. Como observamos na última imagem do animal 2, o
meio ficou amarelo, fechando o diagnóstico, e indicando a presença de
Staphylococcus aureus como causador da mastite no animal 2.
CASO CLÍNICO 2
Amostra de urina foi obtida de uma cadela no atendimento no um hospital
veterinário, sendo observadas, após cultivo crescimento em Agar Sangue e
em Agar MacConkey, conforme figura abaixo:
Agar MacConkey
Agar Sangue
Após coloração de Gram, observou-se:
Coloração de Gram
Após, foram realizadas as seguintes provas bioquímicas:
Agar TSI: A= Meio Sem
cultivo; E: meio após 24 de cultivo da amostra proveniente da colônia do Agar
Sangue.
Agar SIM
Agar Citrato de Simmons
Agar Fenilalanina após adição do cloreto férrico.
Diante das informações acima e elencando os microrganismos estudados:
➢ Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Micrococcus, Escherichia
coli, Salmonella, Proteus, Pseudomonas, Pasteurella multocida e
Mannheimia haemolytica
Qual o seu diagnóstico (EXPLIQUE DETALHADAMENTE SUA RESPOSTA COM
BASE EM TODO O PROCESSO DE ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO) (1,5):
O diagnóstico para esse caso clínico é Proteus.
● Preparo da amostra:
Com a chegada da amostra, ela vai ser coletada dentro da capela, perto da chama
do Bico de Bunsen. O material vai ser colocado em caldo BHI e condicionado por
24h na temperatura de 37°C. Após esse período, pode-se observar uma turgidez
presente no caldo, que indica o crescimento bacteriano.
● Preparando as placas:
Utilizando uma alça, o material vai ser coletado e estriado em placas de Ágar
MacConkey e Ágar Sangue com o objetivo de conseguir colônias isoladas. Essas
placas também vão ser guardadas por 24h a 37°C.
● Leitura das placas:
Cresceram colônias no Ágar MacConkey, indicando a presença de bactérias gram
negativas. Como o meio ficou com a coloração amarelada/acastanhada e as
bactérias tinham uma coloração transparente, indica que a bactéria não é capaz de
fermentar lactose (Lactose negativa). E no Ágar Sangue cresceram colônias
não-hemolíticas.
● Isolamento das colônias:
Com isso, coletamos uma colônia de cada ágar e passamos novamente no caldo
BHI de forma isolada (cada colônia em um tubo), e incubamos por 24h a 37°C.
● Preparação de lâminas:
Após o isolamento das colônias, tem-se a preparação das lâminas, que é feita
dentro da estufa bacteriológica, onde o caldo BHI com as bactérias é coletado com
o auxílio de uma alça, e é estriado nas lâminas. Após esse processo, é
recomendado que segure a ponta da lâmina com um pregador ou uma pinça, e
passe a lâmina sob a chama do bico de Bunsen, que ajuda no processo de fixação
das bactérias na lâmina para que posteriormente não sejam removidos no processo
de coloração.
● Coloração de Gram:
É um tipo de coloração de bactérias que permite observar e identificar suas
estruturas. Primeiramente, é usado o Cristal Violeta durante 1 minuto, depois o
corante é lavado da lâmina com água destilada. A seguir, é adicionado um outro
corante, o Lugol, que é deixado por 1 minuto também, e é retirado da mesma forma
que o Cristal Violeta. Depois disso, se tem o passo de descoloração, onde o álcool
pode ser usado, no período de 20 segundos. E após a lavagem, se tem a Fucsina,
que é deixada por 30 segundos, e depois da lavagem, a lâmina deve secar antes de
ser visualizada no microscópio.
● Visualização no Microscópio:
Nas lâminas foi possível observar bastonetes gram negativos, em ambas amostras
coletadas nas placas.
● Massa bacteriana:
Com a amostra no caldo BHI, é possível fazer a massa bacteriana das
amostras,com a utilização do Ágar BHI. Essa massa será utilizada para os testes
bioquímicos, que tem como objetivo mostrar o metabolismo e comportamento
microbiano através dos fenótipos observados nos tubos das provas bioquímicas,
identificando assim, o genótipo do microrganismo estudado
● Provas bioquímicas:
Sabendo que se trata de um microrganismo Gram Negativo (que cresceu em Ágar
McConkey), que não é capaz de fermentar lactose (Lactose negativa), e que não
apresentou hemólise no Ágar Sangue, é possível excluir a suspeitas dos seguintes
microrganismos: Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus e Micrococcus (Pois
são Gram Positivas), Escherichia coli (pois é lactose positiva), Pasteurella multocida
(Essa espécie não cresce em Ágar MacConkey) e Mannheimia haemolytica (Essa
espécie apresenta hemólise em Ágar Sangue).
Com a exclusão desses microrganismos, se tem a suspeita de Salmonella, Proteus
e Pseudomonas, apenas. E assim, pode-se seguir para os testes bioquímicos.
TSI: O resultado foi K/A/H₂S, o bisel apresentou uma coloração rosada (indicando
que o microrganismo não é capaz de fermentar lactose, informação esta que játinha
sido constatada por conta da coloração do meio no Ágar MacConkey), enquanto a
base apresentou uma coloração amarelada (Ácida, fermentadora de glicose) com a
formação de sulfeto de hidrogênio, que deu a coloração escura no meio. Com as
informações acima, é possível excluir as Pseudomonas, pois estas são K/K e não
são capazes de formar sulfeto de hidrogênio.
SIM: No teste sim, é possível tirar as provas bioquímicas INDOL, H₂S e Motilidade.
Na imagem fornecida no enunciado, não é possível analisar com precisão se foi
feito o teste do INDOL (Que é feita com a adição de triptofano no meio). Porém, na
imagem é possível observar a formação de H₂S, e que a bactéria foi capaz de
crescer e se espalhar ao redor do meio (tornando-o quase todo enegrecido), e por
conta disso, temos que o H₂S é positivo (confirmando mais uma vez o que já
sabíamos pelo TSI), e que a motilidade também é positiva. Porém, com essas
informações, não é possível excluir nenhuma das suspeitas que sobrou, pois,
utilizando como fonte o livro de Diagnóstico Microbiológico do autor Koneman,
utilizando a tabela 6.6 de “Características principais para identificação de
Enterobacteriaceae mais comuns” é possível ver que tanto a Salmonella quanto o
Proteus possuem características semelhantes em relação a motilidade e produção
de H₂S.
Citrato (Positivo): O teste do citrato é utilizado para identificar um microorganismo
que seja capaz de usar citrato como fonte única de carbono. Quando o meio
esverdeado se torna azulado, o teste é considerado positivo. Porém, com essas
informações, não é possível excluir nenhuma das suspeitas, pois a Salmonella é
citrato positivo, e o Proteus pode variar em relação ao citrato.
Fenilalanina (Positivo): O teste da Fenilalanina é feito para identificar bactérias
que realizam a desaminação oxidativa da Fenilalanina a partir da enzima
fenilalanina desaminase. O produto disso, irá oxidar o meio, uma vez que formará
ácido fenilpirúvico. Para finalizar o teste, é necessário usar cloreto férrico a 10%.
Caso a reação seja positiva, irá aparecer uma uma cor verde na amostra, caso
contrário a amostra não irá mudar de cor. Nesse caso, o teste teve resultado
positivo, sendo um teste final para o fechamento do diagnóstico, pois a Salmonella é
fenilalanina negativa, enquanto o Proteus é positivo, indicando que o caso clínico foi
causado por uma bactéria do gênero Proteus.