Resumo Técnicas - curso (PDF)

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Curso histologia 
 
@eduarda_defaveri 
 
 
Visão geral dos métodos usados na histologia 
Histologia = anatomia microscópica 
É o estudo científico de estruturas microscópicas de tecidos e órgãos do corpo. 
Nos laboratórios de histologia atualmente usamos mais o microscópio de luz, ou a microscopia virtual, que 
no curso será a de escolha. 
 
 
Para interpretações mais detalhadas utiliza-se o microscópio eletrônico: 
- de transmissão; 
- de varredura; 
 
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O microscópio de força atômica tem resolução superior ao eletrônico. 
 
Preparação do tecido 
Fixação: substância química ou uma mistura de substâncias que preservam de maneira permanente a 
estrutura do tecido para tratamentos posteriores. 
O fixador mais usado é a formalina, uma sulução aquosa de formaldeido a 37% em várias diluições e 
combinadas com outras substâncias químicas e tampões. 
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Para se observar as estruturas no microscópico é necessário cortaram em finas capas, para isso se faz 
embebição da amostra em um meio de inclusão, para posibilitar a obtenção desses cortes finos. 
 
Após a fixação a amostra é lavada e em seguida desidratada em uma série de soluções alcoólicas de 
concentração crescente até 100%, capaz de remover a água. 
Na clarificação solventes orgânicos miscíveis em álcool e parafina como xilol ou toluol são usados para 
remover o álcool antes da infiltração do espécime com parafina derretida. 
Quando a parafina derretiva resfria-se e endurece, forma-se um bloco sólido, o qual é encaixado no 
micrótomo e cortado com um lâmina de aço. 
As secções resultantes são montadas em lâminas de vidro usando um meio de montagem. 
Os cortes de tecido agora podem ser corados com hematoxilina dissolvida em água. 
Em seguida os cortes são lavos em água e corados por eosina, um corante de natureza ácida que irá corar os 
componentes básicos predominantes no citoplasma das células. 
 
Hematoxilina  colorante básico  cora ácido 
 
Eosina  colorante ácido  cora básico 
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O uso de tetróxido de ósmio como fixador para a microscopia eletrônica é essencial para a preservação das 
membranas celulares. 
Histoquímica e citoquímica 
Podem fundamentar-se na ligação específica de um corante, na ligação de anticorpo marcado com moléculas 
fluorescentes ou na atividade enzimática inerente de um componente celular. 
Radioautografia 
Os precursores ligados a moléculas radioativas são incorporados in vivo pelas células e tecidos. 
 
Em um corte de tecido após todo o procedimento para se obter uma lâmina histológica, apenas 
macromoléculas são preservadas como por exemplo: 
 Nucleoproteínas; 
 Proteínas citoesqueléticas intracelulares; 
 Proteínas extracelulares; 
 Complexos de fosfolipídeos de membrana; 
Cortes por congelação 
1) Congelar a amostra; 
2) Cortar a amostra; 
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3) Corar a amostra. 
 
Moléculas de grande peso molecular perdidas no processo de fixação: 
 Glicogênio; 
 Proteoglicanos; 
 Glicosaminoglicanos; 
Corante ácido carrega uma carga global negativa em sua porção colorida: 
- Eosina. 
Corante básico carrega uma carga global positiva em sua porção colorida: 
- Hematoxilina: não é totalmente um corante básico mas possui propriedades semelhantes. 
 
Componentes aniônicos: 
 Fosfato de ácidos nucleicos; 
 Sulfato dos glicosaminoglicanos; 
 Carboxila das proteínas; 
A capacidade desses componentes de reagir com um corante básico é chamado de basofilía. 
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A hematoxilina não é um corante básica, ela serve de ligação intermediária entre os componentes do tecido 
e a coloração, e isso lembra um corante básico. 
A ligação no complexo tecido – mordente – hematoxilina não é uma simples ligação eletrostática, a 
hematoxilina não se dissocia do tecido quando as secções são colocadas na água. 
A reação dos grupos catônicos com um corante ácido é chamado de acidofilia. 
Técnica de coloração de Mallory: azul de anilina, fuscina ácida e orange G; 
- 3 corantes ácidos; 
 
Substânicas que apresentam basofilia: 
1) Heterocromatina e nucléolo; 
2) Componentes citoplasmáticos com o retículo endoplasmático rugoso; 
3) Compostos extracelulares como os carboidratos complexos da matrtiz cartilaginosa. 
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Substâncias que apresentam acidofilia: 
1) A maioria dos filamentos citoplasmáticos em especial as células musculares; 
2) A maioria dos componentes membranosos intracelulares; 
3) A maioria das fibras extracelular; 
 
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Metacromasia 
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Corantes básicos que quando entram em contato com os componentes do tecido mudam sua cor de azul 
para vermelho ou púrpura. 
Ocorre pela existência de poliânions dentro do tecido. 
Quando o tecido é corado por uma solução concentrada de corante básico como o azul de toluidina, as 
moléculas de corante ficam próximas o suficiente para formar agregados diméricos e poliméricos. 
Reação do ácido periódico de Schiff 
Cora os carboidratos e as macromoléculas ricas em carboidratos. 
O reagente de Schiff (fucsina) também é usado na composição do corante de Feulgen que cora o DNA. 
O corante de Feulgen faz uma hidrólise ácida para conseguir abrir a dupla hélice de DNA. 
A reação do reagente de Schiff é estequiométrica, ou seja, o produto é mensurável e proporcional a 
quantidade de moléculas de DNA. 
 
A microespectrofotometria de Feulgen é uma técnica desenvolvida para estudar aumentos do DNA nas 
células em desenvolvimento e analisar a ploidia, ou seja, o número de vezes que o conteúdo normal de DNA 
de uma célula é multiplicado. 
 Citometria estática: para cortes de tecido; 
 Citometria de fluxo: para células isoladas; 
Histoquímica enzimática 
Reagente de captura: corante ou metal pesado para prender ou ligar o produto da reação da enzima, 
precipitando-o no local da reação. 
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@eduarda_defaveriImunocitoquímica 
Anticorpos são glicoproteínas produzidas por células do sistema imunológico em resposta a um antígeno. 
Corantes fluorescentes (fluorocromos) 
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• São substâncias químicas que absorvem luz de diferentes comprimentos de onda, e então, emitem 
luz visível de um comprimento de onda específico. 
• A fluoresceína, corante mais usado para localizar um antígeno nas células e tecidos, absorve luz 
ultravioleta e emite luz verde. 
 
 
O reconhecimento de um antígeno dispara uma cascata de reações imunológicas que envolvem multiplos 
grupos de células imunológicas, denominadas linfócitos B. 
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Os anticorpos policlonais representam misturas de diferentes anticorpos produzidos por muitos clones de 
linfócitos B e cada um identifica diferentes regiões da molécula de actina, por exemplo. 
Anticorpos monoclonais 
Produzidos por uma linhagem celular produtora de anticorpos compostas por um único grupo de linfócitos 
B idênticos. 
Muito usado nas técnicas imunocitoquímicas. 
Mieloma múltiplo: produz uma grande população de anticorpos idênticos, homogêneos, com uma 
especificidade idêntica contra um antígeno. 
 
Hibridoma 
Linhagem celular imortalizada secretora de antígenos. 
A imunofluorescências direta é a técnica imunocitoquímica mais antiga, usada para identificar a 
distribuição de um antígeno dentro das células e tecido. 
O anticorpo primário marcado com fluorocromo reage com o antígeno dentro da amostra. 
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Imunofluorescência indireta 
 Fornece sensibilidade maior do que os métodos diretos; 
 Sanduíche ou técnica de camada dupla; 
 O fluorocromo é conjugado com um anticorpo secundário direcionado contra o anticorpo primário. 
 
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Método da imunoperoxidase 
Sua coloração resultante pode ser obtida com os métodos imunocitoquímicos direto ou indireto e observada 
em microscopia de luz. 
Hibridação 
Em geral esse termo descreve a capacidade de moléculas de RNA ou DNA de fita simples em interagir com 
sequências complementares. 
Requer o isolamento do RNA ou DNA que então é misturado com uma sequência complementar de 
nucleotídeos, chamada de sonda de nucleotídeos. 
Na hibridação in situ a ligação da sonda à sequência é feita dentro das células ou tecidos. 
As sondas de oligonucleotídios podem ser pequenas com 20 - 40 pares de bases, as de DNA de fita simples 
ou dupla são muito maiores e podem ter mais de 1.000 pares de base. 
Se um espécime de tecido tiver uma quantidade adequada de RNA mensageiro ou transcrito viral podem ser 
usadas a reação em cadeia da polimerase (PCR) para DNA ou a PCR- transcriptase reversa (RT – PCR) para 
RNA. 
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Procedimento de hibridação in situ por fluorescência (FISH) 
Muito usado na clínica para exames genéticos. É usado para examinar cromossomos, expressão gênica e a 
distribuição dos produtos de genes como proteínas anormais. 
Muitas sondas fluorescentes específicas são usadas e comercializadas na clínica para procedimentos de 
triagem como câncer de colo uterino ou para detecção de células infectadas pelo HIV. 
Radioautografia 
 
Microscopia 
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A resolução depende não apenas do sistema óptico, mas também do comprimento de onda da fonte de luz 
e de outros fatores, como espessura do espécime, qualidade da fixação e intensidade da coloração. 
Iluminação de Kohler 
É a chave para uma boa microscopia e está integrada no projeto de praticamente todos os microscópios 
modernos de laboratório e pesquisa. 
Existem etapas de alinhamento para uma boa iluminação. 
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 Uma fonte de luz para iluminar a lâmina; 
 Uma lente condensadora para focalizar o feixe de luz na posição da lâmina; 
 Uma platina onde a lâmina é colocada; 
 Uma lente objetiva que recebe a luz que passou pela lâmina; 
 Um lente ocular, através da qual a imagem formada pela lente objetiva podeser examinada 
diretamente. 
Na preparação do tecido, toda amostra de tecido preparada para a microscopia de luz deve ser cortada em 
fatias finas. 
 
 
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Artefatos: pode ser introduzidos durante qualquer etapa de preparação da lâmina e indica um erro no 
processo de preparo. 
Microscópio de contraste de fase 
Aproveita as pequenas diferenças no indíce de refração em diferentes partes de uma amostra de célula ou 
tecido. 
Duas modificações nesse microscópio criou os microscópio de interferência que também possibilita 
quantificar a massa de tecido e o microscópio diferencial de interferência que é útil para avaliar as 
propriedades de superfícies da célula e de outros materiais biológicos. 
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No microscópio de campo escuro apenas a luz que foi dispersa ou refratada pelas estruturas na lâmina 
alcança a lente objetiva. 
Serve para examinar a existência de cristais na urina, como os de ácido úrico e oxalato e identificar bactérias 
espiroquetas (Treponema pallidum) microorganismo responsável pela sífilis. 
Microscópio de fluorescência 
Usado para visualizar moléculas fluorescêntes naturais como a vitamina A e alguns neurotransmissores. 
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Microscópio UV 
A imagem obtida depende da absorção da luz UV pelas moléculas presentes no espécime. 
 
Microscópio confocal de varredura 
Possibilitaa observação de um espécime em 3 dimensões. A principal diferença de um miscroscópio 
convencional é a presença de um detector de abertura conjugada com o ponto focal da lente. 
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Microscópio de polarização 
É uma modificação do microscópio óptico de campo claro na qual um filtro de polarização, chamado 
polarizador, se colocar entre a fonte de luz e a amostra, e um segundo filtro, chamado analizador se instala 
entre a lente objetivo e o observador. 
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Birrefringência 
É a capacidade de uma matriz de cristal ou substâncias paracristalinas de rotar o plano de luz polarizada. 
Microscopia eletrônica e seus princípios 
 Uma fonte de elétrons (cátodo, canhão de elétrons) como um filamento de tungsteno esquentado, 
emite elétrons; 
 Os elétrons são atraídos para o ânodo; 
 Uma diferença elétrica entre o cátodo e o ânodo imparte aos elétrons uma voltagem de aceleração 
de entre 20.000 e 200.000 volts, gernado o feixe de elétrons; 
 O feixe passa através de uma série de lentes eletromagnéticas que cumprem a mesma função que 
as lentes de cristal de um microscópio óptico. 
 
A lente condensador molda e muda o diâmetro do feixe de elétrons que alcança o plano da amostra. 
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 O feixe que tem passado através da amostra é focado e aumentado pelas lentes objetivas para 
depois voltar a ser aumentado por mais uma lente projetor; 
 A imagem final se ve em uma tela fluorescente coberta de fósforo ou se captura em uma tela 
fotográfica. 
Muitas vezes um detector de elétrons com um sensor sensível a luz como um dispositivo acoplado a cargas 
se coloca acima ou por debaixo da tela de visualização para observar a imagem em tempo real em um 
monitor. 
Preparação para lâminas de Microscópio eletrônico 
O glutaraldeído, um dialdeído, preserva constituentes de proteínas mediante enlaces cruzados entre elas. 
 O tetraóxido de osmio reaciona com lipídios em partícular fosfolipídios. 
O processo de desidratação é idêntico ao utilizado na microscopia óptica e o tecido se infiltra com uma 
resina monomérica, em geral uma resina epoxi, que depois se polimeriza. 
Para a realização dos cortes são usados navalhas de diamante com fio cortante quase perfeito. 
Os íons de metais pesados podem unir-seaos tecidos durante a fixação ou a desidratação ou pela imersão 
dos cortes uma vez realizados em soluções desses íons. 
O tetraóxido de ósmio, que se usa de maneira rotinária no fixador, se une aos fosfolipídios das membranas 
aumentando sua eletrodensidade. 
As soluções de álcool utilizadas na desidratação com frequência é adicionado nitrato de uracilo para 
aumentar a densidade dos componentes das uniões intercelulares e de outros locais. 
A substituição de um composto que contém um metal pesado por um corante fluorescente conjugado com 
um anticorpo permite a adaptação das técnicas imunocitoquímicas a microscopía eletrônica de transmissão. 
As técnicas de autorradiografia de rotina se tem refinado para seu uso com microscópía eletrônica de 
transmissão. 
A superfície da membrana que atrás tem o espaço extracelular se chama cara E, a cara que tem atrás o 
protoplasma se denomina cara P. 
Elétrons 
Elétrons radiodispersos: elétrons refletidos desde a superfície. 
Elétrons secundários: elétrons expulsos da superfície. 
Esses dois tipos são recolhidos por um ou mais detectores e reprocessados para formar uma imagem de alta 
resolução tridimensional da superfície da amostra. 
A última configuração de microscópio eletrônico de varredura ou um microscópio eletrônico de transmissão 
– varredura facilita o uso do instrumento para microanálise de raios X com sonda eletrônica. 
Microscopía de força atômica 
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É um microscópio mais novo e de grande utilidade para os estudos biológicos. Se trata de um microscópio 
não óptico que funciona da mesma forma que as pontas dos dedos que tocam e sentem a pele de nosso 
rosto embora não o estejamos vendo. A ponta afilada é instalada na extremidade do cantiléver. 
 
Modo de contato: a ponta do suporte tocando a amostra. 
 
Modo de percussão: a ponta pode dar golpes através da superfície. 
Microscopía virtual 
Integra a microscopía óptica convencional com a tecnología digital. 
A amostra virtual é uma representação digital de um preparado, que se pode ver de forma remota sem um 
microscópio óptico. 
Estão disponíveis muitos pacotes de programas chamados microscópios virtuais fornecendo acesso a rede 
para que os observadores explorem lâminas digitais em qualquer dispositivo em rede, de modo muito 
semelhante à observação direta no microscópio de luz. 
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A microscopía virtual também se utiliza para o ensino e prática de patologías, oque chamamos de 
telepatología. 
 
 
Fontes de algumas imagens 
https://kasvi.com.br/microscopio-tecnicas-microscopia/ 
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https://www.news-medical.net/life-sciences/What-is-Ultraviolet-Microscopy-(Portuguese).aspx 
http://www.belequipamentos.com.br/capa.asp?pi=produto&proid=894 
https://www.olympus-lifescience.com/pt/discovery/safely_use_microscopes_in_any_educational_setting/ 
https://medicinasa.com.br/telepatologia-cfm/ 
Literatura 
 Ross Histologia Texto e Atlas 7ª Ed; 
 Histologia básica 13ª Ed – Junqueira e Carneiro.