Histologia e seus métodos de estudo

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Histologia
Aula 1
Lara Luisa de Oliveira 
Histologia e seus métodos de estudo: 
Histologia: 
-Estudo dos tecidos do corpo e de como estes tecidos se organizam para constituir órgãos
-Histos= tecido 
-Logia=estudo ( ou ciência de)
-Termo cunhado em 1897 
-Os tecidos são constituídos por células e matriz extracelular (MEC). 
-MEC: composta de muitas moléculas e possui funções como fornecer apoio mecânico para as células e ser um meio de transporte de nutrientes às células. 
Preparação de Tecidos para Exame Microscópio 
Lâminas ou Preparados Histológicos Permanentes
· Etapas: 
-Coleta do tecido a ser examinado
-Fixação
-Desidratação
-Diafanização ou Clarificação 
-Inclusão em parafina ou Impregnação 
-Coloração
-Montagem e secagem 
-Conservação e uso 
· Coleta do material: 
-Anestesia
-Bisturi novo = cortes precisos 
-Facilitar a penetração do fixador ( próx etapa) no fragmento – garantia de melhor preservação da estrutura
-Remover excesso de sangue com água
-Colocar em solução fixadora 
· Fixação: 
 -Objetivos: 
Evitar autólise (quebra de moléculas do tecido) por enzimas da própria célula (degeneração pós-morte) ou por bactérias (putrefação)
- Preservar a estrutura e composição molecular dos tecidos
-Tornar o tecido mais duro para facilitar o corte 
-Formaldeído(4%) e Glutaraldeído são os fixadores mais utilizados e conhecidos por reagir com o grupo amina (NH2) das proteínas 
*Essas substâncias fixadoras vão desnaturar ou estabilizar as moléculas 
*O fixador pode ser injetado nos vasos sanguíneos (Infisão) 
 -Temos dois tipos de fixação: 
1. Fixação química: 
Desnaturação e estabilização de moléculas – formaldeído- bouain (ac. Pícrico 75% + formol 25% + ac. Acético glacial 5 %) 
-formaldeído, glutaraldeído, álcool... 
2. Fixação física : 
Por congelamento – criostato – uso em cirurgias, estudo de enzimas, proteínas e lipídios 
Pelo uso do calor- utilizado em bacteriologia 
· Desidratação: 
- Para remover água dos tecidos para inclusão dos mesmos em parafina 
-Uso de álcool crescente (70 a 100%) 
Álcool etílico (mais usado), acetona, álcool butílico normal, álcool metílico 
· Diafanização ou Clarificação: é chamada assim pois ao ser colocada no xilol o tecido fica transparente (bem claro) 
- Para remover o álcool e introduzir Xilol 
-Xilol é miscível à parafina (MO), e à resina (ME) 
-Mais utilizados: xilol, benzol, toluol, cicloexanona 
· Inclusão em parafina: 
-Estufa a 60 º C - fundir parafina 
-Evaporação do xilol do tecido e penetração da parafina no mesmo 
-Remover da estufa para solidificar a parafina com o tecido 
-Recorte da parafina e colagem em bloco de madeira para prender no micrótomo 
Com o micrótomo é feito a microtomia:
#Cortes para MO: De 1 a 6 um de espessura – uso de navalhas de aço 
#Cortes para ME: De 0,01 a 0,2 um de espessura- uso de navalhas de vidro ou diamante 
 A fita de parafina com o tecido é levado a cuba para banho maria (ligada a 36°C) -espalhando a parafina “enrugada” 
-É realizado o corte – para cada corte a lâmina é colocada dentro da água e ao ser puxada o corte agarra na lâmina 
· Coloração: 
Observar melhor os limites e componentes 
-Temos corantes básicos: 
Azul toluidina 
Azul de metileno 
Hematoxilina 
*Coram RNA-DNA e outros componentes ácidos 
*Estas são, portanto, denominadas de substâncias basófilas 
- Temos corantes ácidos: 
Eosina
Orange G
Fucsina ácida 
*Coram colágeno e outros componentes básicos das proteínas citoplasmáticas 
*Estas estruturas são chamadas de acidófilas 
· Sequência da coloração (os corantes são substâncias aquosas) 
1- Xilol para remover parafina do tecido
2- Álcool decrescente para remover o xilol e inserir água 
3- Lavagem com água 
4- Coloração com hematoxilina – lavar 
5- Coloração com eosina – lavar 
6- Álcool crescente para remover água (desidratar) 
7- Xilol para remover álcool 
8- Colocar gota de Balsamo do Canadá ou outras substâncias que são miscíveis com xilol 
9- Secagem em estufa para evaporar o xilol 
10- Conservação e uso do preparo histológico permanente ou lâmina
· Alguns corantes mais utilizados: 
· Microscópio ótico (ou de luz): 
Parte mecânica – controle para ajustes, mesa, filtros 
Parte ótica- condensador, objetiva, ocular (3 sistemas de lentes) 
Limite de resolução: 
-É a menor distância entre duas partículas que permite vê-las separadamente 
-No MO o limite de resolução é de 0,2um e isto pode dar um aumento de 1000 a 1500 vezes
-A resolução depende da objetiva pois a lente ocular apenas aumenta a imagem nela projetada pela objetiva 
Microscópio de contraste de fase: 
- É baseada no fato de que a luz muda a sua velocidade ao atravessar estruturas celulares e extracelulares que tenham índices de refração diferentes 
- O sistema de contraste mostra imagens mais claras ou mais escuras, permitindo identifica-las em cortes não corados ou em tecidos vivos
-Outro instrumento para observar tecidos não corados é a microscopia de contraste diferencial (microscopia de Nomarski) que produz imagem tridimensional 
Microscopia de polarização: 
- Raios de luz passam por um filtro polarizador (Nicol ou Polaroide), saem vibrando em uma só direção 
-Um segundo filtro perpendicular ao primeiro bloqueia a passagem de luz. Se, porém, um tecido com alto grau de orientação (colágeno) for colocado entre os 2 filtros, ele modificará (girará) o plano de vibração da luz polarizada e projetará a imagem em um fundo escuro após passarem pelo segundo filtro
*Os tecidos com essa capacidade são chamados birrefringentes 
Microscopia confocal: 
-Focaliza apenas um plano do corte 
-Gera feixe de laser muito estreito e a imagem passa por um orifício muito pequeno e só o plano focalizado aparecerá, já que planos anteriores e posteriores ao focalizados são bloqueados 
-Vantagens: melhor resolução, maior sensibilidade, produção de imagens tridimensionais, eliminação do fora de foco, fácil preparação de amostras e especificidade do sinal (onda definida)... 
Microscópio de fluorescência:
-Substância dos tecidos irradiadas por luz de certo comprimento de onda emitem luz com comprimento de onda maior, originando fluorescência. 
-Raios ultravioleta são irradiados nos tecidos e as substâncias fluorescentes aparecem brilhantes 
- Alaranjado de acridina + RNA = vermelho alaranjado 
- Alaranjado de acridina + DNA = verde amarelado 
Microscopia eletrônica de transmissão: 
-O funcionamento se baseia no seguinte princípio: elétrons podem ser desviados por campos eletromagnéticos de uma maneira semelhante ao desvio (refração) produzido na luz por lentes de vidro
-Limite de resolução = 3 nm 
-Permite ampliação da Imagem em até 400 mil vezes 
-Usa elétrons e não luz 
-Gera imagens elétron densas (áreas escuras) e elétron lúcidas (áreas claras) em um monitor 
-Fornece uma imagem da composição estrutural interna-sempre em preto e branco 
*Os cortes são muito delgados de tecidos incluídos em resina epóxi 
*Cortes com navalhas de vidro ou diamante
Microscópio eletrônico de varredura-MEV
-Elétrons varrem uma camada de metal (normalmente pó de ouro) aplicada na superfície do espécime e são refletidos pelo metal 
-Fornece uma imagem da superfície de células, tecidos e órgãos (estr. externa) 
-Ao contrário do ME de transmissão, no ME de varredura os elétrons não atravessam o espécime
-Dá uma imagem pseudo-tridimensional 
Radioautografia: 
-Permite estudo funcional de processos biológicos em cortes de tecidos pelo uso de radioatividade (por ex: saber a quantidade de tecido ósseo formado por dia) 
-Fornecemos átomos ou moléculas radioativas as células 
-Após serem cobertos por emulsão fotográfica que indicam radiação, as laminas são reveladas e examinadas ao microscópio aparecendo como pontos pretos de prata metálica 
Cultura de células e tecidos: 
-Estudo de células vivas fora do corpo, para verificar o efeito isolado de moléculas sobre elas 
-Analisar o comportamento das células vivas e vários experimentos que não podem ser realizados in vivo e podem in vitro 
-Culturas primárias – células são cultivadas em meios de cultura onde ficam em suspensãoou em placas de petri e sobre lamínulas de vidro 
-Linhagem permanente de células podem ser obtidas submetendo-as a um processo chamado transformação (Transformação irreversível) 
Aplicação médica: 
-No estudo do metabolismo de células normais e cancerosas 
-No desenvolvimento de novos fármacos 
-No estudo de vírus, micoplasmas e protozoários 
-Na citogenética é usada para determinar o cariótipo, com o cultivo de linfócitos e fibroblastos da pele
-Na aplicação de técnicas modernas na biologia molecular
Fracionamento celular (centrifugação fracionada): 
- Estudo da composição química e função de organelas e moléculas 
-Centrífuga separa os componentes celulares com base no coeficiente de sedimentação 
-Coeficiente depende do tamanho, forma, densidade e viscosidade do meio 
1000 giros – separa o núcleo 
10 mil giros- mitocôndria e lisossomos 
105 mil giros- ribossomos e membranas do RER 
Histoquímica e Citoquímica: 
São métodos que identificam e localizam substâncias em células cultivadas ou cortes histológicos. Existem diversas metodologias para colher essas informações, sendo que, a maioria são baseadas em reações químicas ou em interações de alta afinidade entre as moléculas, de modo que evidenciam substâncias como: 
· Íons: podendo citar o cálcio, ferro e fosfato por meio de reações químicas 
· Ácidos nucleicos: somente o DNA por meio da reação de Feulgen. DNA e RNA pela coloração de células ou cortes de tecidos com corantes básicos 
· Proteínas: os métodos histoquímicos não detectam proteínas específicas, ficando a cargo da imunocitoquímica. Entretanto, as enzimas podem ser identificadas, sendo que a maior parte dos mecanismos histoenzimáticos atua seguindo uma sequência: 
1-Cortes de tecidos são imergidos em uma solução com o substrato da enzima cuja presença se quer verificar, permitindo a reação entre enzima e substrato
2-O corte entra em contato com uma substância marcadora reagindo com uma molécula decorrente da degradação do substrato 
3-O produto final da reação, na qual deve ser insolúvel, colorido ou elétron-denso (para ser visto por meio do microscópio óptico ou eletrônico), precipita sobre a área composta de enzima, sinalizando-a. Algumas enzimas podem ser detectadas, como por exemplo:
-Fosfatases: Generosamente encontrada no organismo. Constantemente a reação de detecção de fosfatases ácidas são realizadas para demonstrarem lisossomos, que contêm muitas dessas enzimas. 
-Deidrogenases: Removem hidrogênio de um substrato e o transferem a outro. Sua demonstração histoquímica consiste em incubar cortes de tecidos não fixados em uma solução que contém uma molécula que, ao receber hidrogênio, precipita como uma substância colorida insolúvel. 
-Peroxidase: Para a sua detecção ela promove a oxidação de certos substratos e a transferência de íons de hidrogênio para peroxido de hidrogênio produzindo ao mesmo tempo moléculas de água. É utilizado uma solução de peroxido de hidrogênio e 3,3-diaminoazobenzidina. A atividade de peroxidase em células do sangue (importante para diagnosticar a leucemia) pode ser evidenciada por esse mecanismo. 
· Polissacarídeos e Oligossacarídeos: Podem ser constatados pela reação de Ácido Periódico-Schiff (PAS), na qual se fundamenta na transformação de radicais 1,2-glicol disponível nos açúcares em resíduos de aldeído. Esses resíduos são então revelados pelo reagente de Schiff, produzindo uma coloração púrpura ou magenta nos locais do corte em que há muitos polissacarídeos. O glicogênio, por exemplo, é demonstrado por essa reação em tecidos onde se acumula. 
-Glicoproteínas: proteínas associadas a oligossacarídeos. Algumas não contem grupo ácido (sendo neutras) e são PAS-positivas, sendo assim, a especificidade da reação de PAS pode ser melhorada comparando a coloração de cortes submetidos a esta técnica com outros que foram pré tratados com uma enzima que digere glicogênio. Já outras possuem radicais carboxila ou sulfato.
-Glicosaminoglicanos: polissacaraídeos fortemente aniônicos que contem aminoaçúcares. Quando ácidos, juntamente com as glicoproteínas, possuem alta quantidade de grupos carboxila e de sulfato (ou seja, são fortemente aniônicas), por isso, eles reagem profundamente com o corante Alcian blue. 
· Lipídios: O melhor modo de evidenciar é por meio de corantes solúveis em lipídios, sendo o Sudan IV e o Sudan Black os mais utilizados, que se dissolvem nas gotículas de lipídios, adquirindo a cor do corante. Alguns mecanismos adicionais são viáveis para diagnóstico de enfermidades metabólicas com acúmulo intracelular de variados tipos de lipídios. 
Detecção de moléculas em cortes histológicos por meio de interações moleculares de alta afinidade:
Para se detectar moléculas presentes em células ou cortes de tecidos utiliza-se compostos capazes de se interagir especificamente com a molécula, na qual devem ser previamente acoplados a um marcador para que esse conjunto seja visto por meio de um microscópio. Sendo assim, os marcadores mais utilizados são: substâncias fluorescentes, átomos radioativos, moléculas de enzimas (como a peroxidase), metais (partículas de ouro), faloidina (interagindo fortemente com actina), proteína A (se liga em anticorpos) e lectinas (especificidade a carboidratos). 
Imunocitoquímica:
É utilizada principalmente para detecção de proteínas em cortes de células ou em células em cultivo por meio do uso de anticorpos específicos contra a proteína na qual se quer determinar, dispondo de grande aplicação em pesquisa e diagnóstico. Dessa maneira, uma solução contendo um anticorpo fabricado contra determinada molécula é colocada sobre cortes ou células espalhadas em lâminas, as moléculas de anticorpo irão se acoplar a molécula que se quer identificar na amostra. 
Os anticorpos que se acoplaram ao antígeno não são visíveis ao microscópio e, portanto, necessitam estar unidos a um marcador para serem reconhecidos – por exemplo, moléculas de peroxidase para observação por microscopia óptica comum ou moléculas fluorescentes para microscópios de fluorescência ou confocal. Ao se observarem um corte ou células espalhadas sobre uma lâmina e que foram submetidos a esse procedimento, é possível reconhecer as moléculas investigadas, pois os locais onde se encontram aparecerão corados ou fluorescentes.
Os anticorpos chamados policlonais se originam de diferentes linfócitos B, o que significa que reagem com várias partes de uma proteína, já os anticorpos chamados monoclonais podem ser produzidos in vitro por células especializadas mantidas em cultivo, e não necessitam de animais para serem injetados com antígenos, sendo assim, costumam ser mais específicos e, portanto, mais precisos no reconhecimento da proteína em questão. 
· Existem duas técnicas utilizadas em imunocitoquímica:
-Técnica direta de Imunocitoquímica: o anticorpo contra a proteína X (monoclonal ou policlonal) é ligado a um marcador apropriado. Um corte de tecido é incubado com o anticorpo por um tempo de modo que o anticorpo interage e se ligue a X e, logo após, o corte é lavado para remover o anticorpo não ligado. O corte pode ser observado por microscópico ótico ou eletrônico (dependendo do marcador utilizado) 
-Técnica indireta de Imunocitoquímica: Requer duas etapas. É empregado um anticorpo secundário com uma enzima ou composto fluorescente ligado em sua estrutura. O anticorpo secundário se liga de forma específica ao anticorpo primário e produz a cor (quando em reação com substrato) ou a fluorescência (quando estimulado). O método indireto é mais sensível devido a múltiplas regiões em que o anticorpo secundário pode se ligar no anticorpo primário.
-A imunocitoquímica contribuiu consideravelmente para a pesquisa em biologia celular e para o avanço de procedimentos diagnósticos. 
Técnicas de Hibridização:
-Técnica de identificação de sequências específicas de DNA ou RNA, o que permite analisar as moléculas envolvidas no processo de fluxo de informação do DNA para proteínas.
· Hibridização in situ: recebe esse termo quando a técnica é aplicada diretamente a células e corteshistológicos, esfregaços ou cromossomos de células mitóticas, utilizando o que chamamos de “sondas”. 
-As sondas são pequenas sequencias de nucleotídeos em fita simples, complementares a região na qual se quer identificar, elas são marcadas de alguma forma (normalmente por um isótopo radioativo que pode ser localizado por radioautografia) para que depois seja de fácil identificação por imunocitoquímica. 
-Assim, as lâminas são inicialmente aquecidas para separar as cadeias duplas de DNA. Logo após, uma solução contendo a sonda é colocada sobre o espécime por um período de tempo para hibridização. Depois de lavar a lâmina, a localização da sonda ligada a sua sequencia complementar é denunciada pelo marcador utilizado. 
As técnicas de hibridização são altamente especificas e usualmente utilizadas em pesquisa, diagnostico clínico e medicina forense. 
Problemas na interpretação de cortes:
· Distorções e Artefatos causados pelo processamento dos tecidos: 
Uma das causas das distorções é a retração produzida pelo fixador, pelo etanol e pelo calor da parafina usada para inclusão. Tal retração é minimizada quando os tecidos são colocados em contato com resina. Uma consequência da retração é o aparecimento de espaços artificiais nas células e entre as células e outros componentes de tecidos. 
-Artefatos de técnicas: são os espaços artificiais e outras distorções causadas no procedimento de preparação dos cortes. Outros artefatos podem incluir pregas do corte e precipitados de corantes ou de sujeira. 
A totalidade do tecido: 
Uma grande dificuldade apresentada por cortes de microscópio óptico é a impossibilidade de se corar, de modo diferente, todos os componentes das células e tecidos em um só preparado. Por outro lado, o microscópio eletrônico de transmissão permite a observação de células com todas as suas organelas e inclusões envolvidas pela membrana e pelos componentes da matriz extracelular. 
Duas dimensões e Três dimensões: 
Para compreender a arquitetura de um órgão é válido estudar secções feitas em planos distintos. Desse modo, quando um corte é observado no microscópio deve-se sempre imaginar que algo pode estar faltando à frente ou atrás daquele corte, além disso, deve lembrar-se também de que os componentes de um tecido ou órgão geralmente são seccionados ao acaso.