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BIOLOGIA MOLECULAR
CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA
Regulação da expressão gênica dentro do organismo, existem diferentes tipos celulares. Cada uma dela produzem diferentes RNAs, que levam a transcrição de diferentes proteínas e, assim, exercem diferentes funções
Processos comuns as células produtos genéticos comuns proteínas estruturais dos cromossomos, RNA e DNA-polimerases, enzimas de reparo do DNA, proteínas ribossômicas e RNAS (expressas em todos os tipos celulares) – formados por GENES CONSTITUTIVOS, expressos em todas as células
Algumas proteínas e RNAs são abundantes nas células especializadas nas quais elas atuam e não podem ser detectadas em nenhum outro local. Ex: genes que codificam fibras musculares – GENES expressos apenas em determinado tipo de célula
Uma célula humana típica expressa 30-60% dos seus genes além genes constitutivos ou específicos, as células variam no nível de transcrição. Além disso, diferenças marcantes nos níveis de RNAs codificadores (mRNAs) em tipos celulares especializados REGULAÇÃO PÓS TRANSCRICIONAL. 
Diferentes tipos celulares frequentemente respondem de maneiras diferentes para o mesmo sinal extracelular (hormônio, atividade física, alimentação etc.). Outras características do padrão de expressão genica não mudam e dão a cada tipo celular suas propriedades particulares. 
A expressão de uma proteína pode ser:
· Constitutiva constantemente expressa
· Induzida expressa quando necessária
Expressão gênica
· Dogma central da genética molecular
· A informação genética flui do DNA RNA proteínas
· Fluxo unidirecional
· Transcrição 
· Tradução
· Base molecular para conexão entre genótipo e fenótipo
· Muitos genes nunca serão transcritos e nem traduzidos
Regulação da expressão: garante que sejam expressos no momento apropriado e em qtds adequadas
A unidade de transcrição é o gene, que é uma sequência de DNA que origina uma molécula de RNA. Porém nem todo RNA será codificante.
Cada gene possui em sua estrutura três regiões fundamentas:
· 1 promotor – início da transcrição
· 1 região codificantes – contém a informação para produção de proteína
· 1 finalizador – fim da transcrição
Organização dos genes
· Eucariotos – uma região promotora para cada gene individual
· Procariotos vários genes regulados por um único promotor
Reconhecimento da região promotora do gene
A RNA polimerase precisa de proteínas acessórias para reconhecer o promotor:
· Bactérias: fator sigma nas células procariotos
· Eucariotos: fatores gerais de transcrição
*essas proteínas após reconhecerem o promotor, atraem a RNA polimerase
=> O gene está expresso quando ele é transcrito em um RNA mensageiro
A expressão de um gene pode ser:
· Constitutivo: gene expresso constantemente, em todas as células do indivíduo. São essenciais para processos básicos, por exemplo, geração de energia, replicação, manutenção do material genético, reguladores
· Indutivo/repressivo: quando o gene só se expressa quando necessário, em células específicas. Ex: cadeias de globulina, produzidas apenas em eritrócitos
Sequências gênicas
1. Sequencias que são transcritas em RNAm
Genes estruturais codificam enzimas que serão utilizadas no metabolismo ou que tem um papel estrutural nas células. Procariontes: diversos genes estruturais e um único promotor (óperon)
2. Sequência que regulam a expressão gênica
Genes reguladores -> codificam um RNA ou uma proteína que interagem com outras sequencias do RNA e afetar a transcrição ou a tradução. Procariontes – fica fora do óperon e tem seu próprio promotor. Eucariontes – promotores individuais para genes reguladores e estruturais 
Regulação da expressão genica
Bactérias: flexibilidade unicelular, “liga e desliga” genes em respostar a mudanças ambientais
Eucariotos: diferenciação multicelular, especializa conjuntos de células para uma determinada tarefa, embora todas as células carreguem a mesma informação gênica
REGULAÇÃO GÊNICA – PROCARIOTOS
Estudos com E. coli, bactéria flexível, reside no intestino grosso. 
Processo regulatório de acordo com as condições ambientais.
REGULAÇÃO GÊNICA – EUCARIOTOS
Todas as células contém a mesma informação armazenada no genoma. Então como uma única células pode dar origem a tipos celulares tão distintos?
Hipótese 1: durante a diferenciação, apenas os genes que codificam as proteínas que serão expressas naquele tipo celular são mantidos
Hipótese 2: todos os genes são mantidos, mas somentes as proteínas específicas ao redor tipo celular são expressas
*grande papel dos tipos celulares
NÍVEIS DE CONTROLE DE GENES
1. Alteração da estrutura gênica – regiões de eucromatina (transcrita) e heterocromatina (condensada – não transcrita)
2. Nível de transcrição – bloqueio da RNA polimerase
3. Processamento do MRNA – splicing (remoção dos íntrons e manutenção dos éxons). Processamento para que o RNA sai do núcleo em direção ao citosol
4. Estabilidade do MRNA
5. Nível de tradução
6. Alteração pós-traducional – remodelação da cromatina
As informações para o controle da regulação gênica estão no DNA
Regulação negativa
Dependente de repressores. Inibem a expressão gênica por bloquear o acesso ao RNApol ao promotor. Dependem da presença do efetor (sinal molecular). Tipo característicos em procarióticos (+ comum). Elementos operador próximo ao promotor
Regulação positiva
Dependem de ativadores. Induzem a expressão gênica. Dependem da presença do efetor (sinal molecular). Tipo característico em eucariotos. 
A expressão do gene é regulada por uma combinação de:
· Elementos trans – proteínas codificadas por outras moléculas de DNA ou por genes distantes que precisam se locomover para chegar ao promotor que será regulado. Podem atuar na região distal ou proximal, inibindo ou estimulando a expressão
· Elementos cis – sequencias presentes no promotor ou no enhancer do gene regulado
Regulação – associação da proteína e do DNA
· Proteínas específicas reconhecem sequencias específicas de DNA
· Possuem domínios de interação com DNA e da interação com outras proteínas
· Normalmente dímeros > reconhecer sequencias palindrômicas (simétricas)
· O papel dos sulcos maiores (mais específicos) e menor (menos específico) no DNA 
· Sulco maior => maior interação
Domínios de ligação ao DNA
· Formam estruturas autônomas separadas do restante do DNA
· Estruturas capazes de interagir esteira e especificamente com o DNA-alvo
· O domínio hélice-volta-hélice esta presente em muitas proteínas lidiadores de DNA
· Apesentam-se como “dímeros” de forma a reconhecer a sequência palindrômica no DNA
· Forma um eixo de simetria com DNA
REGULAÇÃO GÊNICA EM PROCARIOTOS
Os mecanismos de regulação da expressão gênica foram primeiramente estudados em bactérias – facilidade de manipulação laboratorial.
ÓPERONS: grupo de genes reunidos que controlam a regulação genica em bactérias. A maioria dos genes bacterianos estão agrupados e sob o controle de um mesmo promotor.
Estrutura do óperon:
· Genes estruturais – serão transcritos em um único mRNA
· Região promotora – regula a expressão dos genes estruturais
· Operador – local de ligação de proteínas reguladores repressora. O operador fica superposta a ponta 3’ do promotor e a ponta 5’ do primeiro gene da estrutura.
· Ativador – onde ligam as proteínas reguladoras ativadoras
Genes reguladores de bactérias:
· O gene regulador sintetiza proteínas que regulam a transcrição dos gene estruturais do óperon 
O gene regulador não é considerado parte do óperon, embora afete seu funcionamento. O gene regulador tem seu próprio promotor e seu próprio transcrito
O produto final do gene regulador é a proteína reguladora, que podem atuar como ativadores ou repressoras da transcrição. Sua ação é controlada pela presença de moléculas efetoras 
Forma de atuação das proteínas reguladoras em um óperon:
· Controle negativo – quando a ligação da proteína reguladora ao DNA bloqueia a transcrição. O produto do gene é necessário para desligar a expressão dos genes estruturais -> atua como repressora. Liga no operador
· Controle positivo – quando a ligação da proteínareguladora ao DNA ativa a transcrição. O produto do gene regulador é necessário para ligar a expressão dos genes estruturais -> atua como ativadora
· Indutor: normalmente o gene está desligado e na presença de substrato, torna-se ativo, ligado
· Indutor: normalmente o gene está ligado e, na presença do substrato torna-se ativo, ligado
· Co-repressor: normalmente o gene está ligado e, na presença do substrato, torna-se inativo, desligado
Um óperon de controle negativo ou positivo, indutível ou repressivo regulam a síntese das enzimas de modo econômico
Controle negativo ou positivo indutível: proteínas só são produzidas, ou seja, o gene só é ativo, quando seu substrato está disponível no meio
Controle negativo ou positivo repressível: as proteínas só são sintetizadas quando não há substrato no meio
Operon Lac
· Controle genético do metabolismo da lactose em E. coli. A presença de glicose (proveniente da lactose) influencia na expressão. Altas concentrações de glicose estimula a produção de enzimas que metabolizam a lactose (B-alatosidase, permeasse e b-glicosídeo transacetilase).
· Lac Z = enzima b-galactosidase quebra a lactose em glicose e galactose
· Lac Y = enzima permeasse transporte lactose para dentro das células
· A ausência de lactose no meio sintetiza uma proteína reguladora repressora, que se liga no operador e impede a ligação do RNA polimerase ao promotor. Ocorre um processo regulador negativo, pois a proteína reguladora impede a expressão dos genes 
Funcionamento do operon Lac
Os genes são expressos basalmente, em quantidade muito pequena a todo tempo produção de pequenas quantidades de permeasse e B-galactosidade. 
· PRECISA DE PERMERASE PARA ENVIAR A LACTOSE PARA DENTRO DA CÉLULAS. 
· PRECISA DE B-GALACTOSIDADE PARA CONVERTER LACTOSE EM ALOLACTOSE
A alolactase é um isômero da lactose que atua como indutor. Presença de alolactose modificação alostérica da proteína repressora:
1. Liberação da proteína repressora do operador
2. Ligação da RNA polimerase no promotor
3. Aumento da expressão dos genes do óperon Lac
Presença de lactose no meio:
· Alolactose modifica a conformação da proteína reguladora repressora e essa dissocia-se do operador, permitindo que a RNA polimerase se ligue ao promotor e transcreva os genes estruturais. 
Presença de glicose no meio:
· Repressão catabólica: Quando a glicose está disponível, os genes que participam do metabolismo dos outros açúcares são reprimidos. AS bactérias utilizam a glicose como fonte preferencial de energia. 
O produto de fragmentação da glicose altera os níveis de CAMP:
· Adenosina monofosfato cíclico = Molécula sinalizadora.
· Mostra se há ou não glicose no meio.
É necessário uma alta concentração de CAMP para ativar o operador LAC muito CAMP está relacionado com baixa taxa de glicose
CAP: proteína reguladora ativadora depende do cAMP. Proteína CAP = detecta indiretamente a presença da glicose
Presença de Glicose no Meio Baixa concentração de cAMP.
Proteína CAP sem cAMP não consegue se ligar ao ativador:
· Não auxilia na ligação da polimerase ao ativador e os genes ficam inativos.
· CAP sem cAMP = repressão catabólica e silenciamento dos genes.
Ausência de Glicose no Meio Alta concentração de cAMP.
A proteína reguladora CAP + cAMP se ligam no sítio ativador:
· Auxilia na ligação da polimerase ao ativador e os genes ficam ativos.
· CAP com cAMP = afinidade da polimerase no promotor e ativação de genes.
Óperon trp
Controle genético da biossíntese do a.a. triptofano.
Presença de triptofano do meio = reprime a síntese de enzimas que fazem o metabolismo de triptofano
Na presença de triptofano, o bloqueador se liga na região do operador, impedindo que a RNA polimerase ligue-se a ele e, portanto, realize a transcrição gênica.
Presença de triptofano no meio triptofano é o substrato que inibe a expressão dos genes (co-repressor). A proteína reguladora + triptofano atuam como repressores (controle negativo repressível).
Controle da expressão em procariotos
 Controle por recombinação. Recombinação regula a expressão de diferentes proteínas do flagelo. Mecanismo de escape do sistema imune. Sistema operon. Recombinase Hin inverte a posição do promotor para FljB, não ocorrendo a expressão de FljA expressão da FliC.
Regulação gênica em eucariotos
Dependendo da expressão de determinados genes e da ação do meio, é caracterizado o fenótipo do indivíduo.
Epigenética: é uma forma que herança que se sobrepõe a herança genética. São modificações dos genes, sem envolver uma mudança na sequência de nucleotídeos do DNA (é algo diferente de mutação). 
Indivíduos possem seu genoma (conjunto de genes do organismo) e seu epigenoma (conjunto de modificações químicas que ocorrem neste genoma, interferindo em sua expressão).
Controle epigenético
Dois mecanismos:
1. Os que modificam a molécula de DNA diretamente
2. Os que afetam a cromatina
Modificações química a nível transcricional e pós-tradicional
Cada célula possui uma expressão genica diferente e um controle transcricional diferente
Compactação do DNA
Evento necessário para que as moléculas de DNA caibam no interior do núcleo da célula. Para a compactação do DNA (carga negativa) se associa com uma classe especial de proteína, as histonas (carga positiva). DNA + HISTONAS = CROMATINA
O DNA dos eucariotos se apresenta ligado a proteínas formando os nucleossomos.
As regiões do DNA que estão sendo transcritas estão menos compactadas. 
· Heterocromatina: fortemente condensada, não disponível para transcrição
· Eucromatina: parcialmente disponível para a transcrição. A regulação negativa em eucariotos, disponível para transcrição
Modificação nas histonas
- um dos fatores que leve a alteração no processo de transcrição. A cromatina “frouxa” facilita o acesso dos fatores de transcrição. Quando condensada, dificulta o acesso da maquinaria de transcrição.
 acetilação: modificação química mais conhecida das histonas. Adição de grupamentos acetil na cauda n-terminal das histonas, nas lisinas. Essa reação reduz as cargas positivas das lisinas, reduzindo a força de interação entre DNA e histona (aumenta a transcrição) dificulta a ligação da proteína histona ao DNA, descompactação da cromatina e genes ativo. A enzima histona desacetilase reitra o radical acetil, promovendo a compactação da cromatina e inibindo a transcrição
metilação do DNA: adição do grupo metil em regiões específicas do DNA (“ilhas de Cpg” – regiões ricas em C e G, por ação da enzima DNA metiltransferase. A metilação do DNA impede que os fatores gerais de transcrição reconheçam o promotor: não atrai a RNA polimerase e inativa a expressão genica
Controle combinatório
Dependendo do conjunto de proteínas diferentes efeitos
Número reduzido de proteínas reguladoras maior especificidade (reconhecem sequencias assimétrica – proteínas que formam homodímeros e heterodímeros – 36 combinações de proteínas que regulam a expressão genica). 
Acentuadores ou potencializadores
Sequências especificas “acima” do promotor que funcionam como pontos de ligação específicos para proteínas ativadoras ou repressoras. Podem estar a milhares de pares de base a 5’ do promotor. Dependem da presença das proteínas ligaduras especificas. Podem ajudar a expor o DNA para RNApol I. Podem ajudar a montagem do complexo basal de transcricao
Regulação gênica em eucariotos
· Requer ação combinada de diversos agentes
· UAS: upstream activator sequences – sequencias ativadoras a montante (pode ser a jusante também)
· Reguladores da arquitetura: proteínas HMG
· Remodelamento da cromatina
· Coativadores: Ativadores ou repressores interação com o Mediador
· Fatores basais de transcrição
Epigenética e diferenciação celular
Um padrão epigenético específico determina a identidade de uma célula.
Diferenciação celular -> regulação em eucariotos
Coreografia da ativação da transcrição: eventos em cascata variável para diferentes genes. Processo dependente de moléculas efetoras e reversível.
Expressão gênica regulada por hormônios
Receptores nucleares: hormônios esteroidais induzem a transcrição.Proteínas modulares: domínio de ligação ao DNA e domínio de ligação ao hormônio. Ex: estrogênio e testosterona
Ação hormonal de esteroides, tireoideanos e retinóide – livre trânsito pela MP. Presença sequenciais HRE: elementos de resposta hormonal específicos
Regulação por repressão da tradução
Transcrição e tradução são processos desacoplados edição do mRNA e transporte para o citoplasma
Envolve o armazenamento de mRNAs inativos no citoplasma:
1. Fatores de iniciação da tradução são sujeitos a fosforilação inibe
2. Proteínas repressoras ligam-se a região 3’ não traduzida (3’UTR - untranslated region). Bloqueia a iniciação da tradução
3. Sitio de ação da regulação genica regulada por RNA
Vulnerabilidade epigenética
Início da vida: fertilização in vitro, nutrição materna, fumo/álcool, medicamentos
Ao longo da vida
Nutrição, exame físico, estilo de vida, outros (ex: estresse)
Imprinting genômico
Em genes imprintados apenas o alelo herdado de um dos genitores é expresso. O outro alelo é silenciado devido marcações epigenéticas.
O imprinting pode ser o responsável pelo fato de algumas doenças genéticas se manifestar apenas quando o alelo responsável é herdado por um dos pais.
Marcações epigenéticas são apagadas durante a formação dos gametas Reprogramação.
Porém algumas marcações não são removidas.
Quando a marcação é transmitida imprinting genômico
Regulação por RNA’s
RNA de interferência (RNAi) e microRNA (miRNA)
pequenos RNAs não-codificantes que possuem características regulatórias. 
Hibridizaram com mRNAs, controlando sua estabilidade e tradução. 
Silenciamento gênico