Apostila aula prática microbiologia ufla

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UFLA – Universidade Federal de Lavras 
DBI – Departamento de Biologia 
 
 
 
 
 
 
 
MICROBIOLOGIA GERAL (GBI 111 e 132) 
PRÁTICAS DE LABORATÓRIO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nome:.........................................................................Matrícula..................Turma.......... 
 
Autores em ordem alfabética: 
 
Drª. Cristina F. Silva e Batista 
Dr. Dirceu de Sousa Melo 
Dr. Eustáquio Souza Dias 
Drª. Patrícia Gomes Cardoso 
Drª. Rosane Freitas Schwan 
Dr. Victor Satler Pylro 
Dr. Whasley Ferreira Duarte 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MICROBIOLOGIA GERAL (GBI 111 e 132) 
PRÁTICAS DE LABORATÓRIO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Universidade Federal de Lavras 
Departamento de Biologia 
Lavras – Minas Gerais
 
 
REGRAS DO LABORATÓRIO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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INSTRUÇÕES DE COMPORTAMENTO NO LABORATÓRIO 
 
1 No caso de acidentes, comunicar imediatamente ao professor. 
2 Limpar e desinfetar as bancadas e capelas no início e no final das aulas. 
3 
Ser cuidadoso com materiais que possam causar ferimentos na pele, como 
seringas, pipetas Pasteur, lâminas de aço e vidros em geral. 
4 Descartar o material utilizado nos locais apropriados. 
5 Todo material utilizado deve ser devidamente identificado. 
6 
A alça de platina e agulha utilizadas na manipulação dos microrganismos 
devem ser esterilizadas no bico de Bunsen antes e depois de utilizadas. 
Colocá-las sempre na posição vertical no suporte e não sobre a bancada. 
7 Nunca pipetar com a boca. 
8 Não sair com nenhum material das aulas. 
9 
Não devolva o reagente ao frasco original, principalmente em se tratando de 
substância P.A. Nunca retire do frasco mais do que necessário. Nunca use 
uma mesma espátula para reagentes diferentes! 
10 Cuidado com as espátulas usadas, descarte em local apropriado. 
11 
Cuidado com qualquer material quente, especialmente substâncias químicas. 
Espere que resfriem para o manuseio seguro, usando luvas adequadas ou 
garras especiais. 
12 
Leia o roteiro de aula prática antes de iniciar qualquer procedimento. Anote 
os resultados experimentais, discussões e conclusões. Faça todos os 
exercícios da apostila, pois, esta será conferida no final de cada aula. 
13 
Antes de deixar o laboratório em cada aula, ordenar todo o material usado, 
fechar a água, o gás e desligar o interruptor e a tomada do microscópio. 
Mantenha o laboratório organizado e limpo. Atenção especial com as 
bancadas, sua segurança pode estar em jogo. 
 
Estas normas têm como metas: 
 
✓ A segurança de cada um e de todos; 
✓ O bom funcionamento do laboratório; 
✓ A eficiência e eficácia na condução das práticas. 
 
 
ÍNDICE 
Nº prática Tema aula prática Página 
1 
Introdução ao Laboratório de Microbiologia e observação de 
microrganismos no ambiente 
1 
2 Meios de cultura: utilização, preparo e esterilização 8 
3 Observação microscópica de protistas e algas 16 
4 
Isolamento de fungos filamentosos e morfologia de micélios e 
leveduras 
27 
5 Esporos fúngicos assexuados e sexuados 35 
6 Isolamento e enumeração de microrganismos 55 
7 Obtenção de culturas puras: estrias simples e compostas 60 
8 
Preparações microscópicas fixadas: coloração de Gram e 
Antibiograma 
63 
9 Metabolismo microbiano: fermentação alcoólica 73 
10 Alterações genotípicas e fenotípicas em microrganismos 76 
Práticas Extras 
11 
Métodos de esterilização e controle de crescimentos de 
microrganismos 
79 
12 Seleção de microrganismo para aplicação biotecnológica 87 
13 Análise microbiológica de água 90 
Anexo I. Protocolos para preparo de corantes, reagentes e meios 
 
96 
 
 
1 
 
Prática 1 – Introdução ao Laboratório de Microbiologia e observação de 
microrganismos no ambiente 
 
Estima-se que nosso planeta hospede uma ordem de 1030 células microbianas – 
número esse, maior do que o de estrelas no universo observável – distribuídas em 
aproximadamente 1 trilhão de espécies (1012). Apesar da sua importância clínica, sabe-se 
que menos de 1 % dessa diversidade microbiana tem reconhecido potencial patogênico 
em humanos, e hoje, passa-se a entender que essa enorme diversidade tem papel 
fundamental para a manutenção do nosso estado saudável e na estabilidade de todos os 
ecossistemas. 
Durante as aulas práticas do curso de Microbiologia Geral utilizaremos técnicas 
microbiológicas clássicas de isolamento, conservação e caracterização de 
microrganismos que são aplicadas em diversas pesquisas, na indústria bioquímica, de 
alimentos, na agricultura, na biotecnologia, entre outras áreas. Esses microrganismos 
apresentam distribuição ampla, podendo ser encontrados em quaisquer ambientes, 
superfícies ou mesmo em suspensão. 
Um laboratório de microbiologia apresenta alguns equipamentos e vidrarias 
comuns a outros laboratórios, como os de química ou de análises clínicas. No entanto, 
algumas vidrarias são exclusivas para uso na área de microbiologia. Basicamente, um 
laboratório deve possuir autoclave, microscópio, câmara de segurança biológica (câmara 
de fluxo laminar), estufas de secagem e bacteriológica, BOD, refrigeradores e balanças 
analíticas. 
Nesta primeira aula, conheceremos as normas básicas, materiais e equipamentos 
rotineiramente utilizados em um Laboratório de Microbiologia. Também, teremos a 
oportunidade de verificar a presença de microrganismos no ambiente, justificando as 
normas propostas. 
 
Objetivos 
1- Reconhecer materiais, equipamentos e normas do Laboratório de Microbiologia. 
2- Averiguar a presença de microrganismos no ambiente. 
 
 
 
 
2 
 
Abaixo, a descrição dos principais EQUIPAMENTOS: 
Autoclave - câmara de vapor com parede dupla, equipada com dispositivos que permitem 
o enchimento da câmara com vapor saturado e sua manutenção em determinadas 
temperatura e pressão por quaisquer períodos de tempo. A autoclave é um equipamento 
indispensável ao laboratório de microbiologia na esterilização de meios de cultura, água, 
suspensões e descarte de material contaminado. 
Estufas de Esterilização (Fornos de Pasteur) - esteriliza a seco toda vidraria 
convenientemente acondicionada, a temperatura de 170 a 200o C por 1-2 horas. 
Refrigerador - utilizado na conservação de culturas de microrganismos sob baixa 
temperatura, diminuindo o metabolismo. 
Estufa bacteriológica - favorece o crescimento de microrganismos pela incubação na 
temperatura adequada. 
Câmara de Segurança Biológica (câmara de fluxo laminar) - câmara asséptica, dotada 
de exaustor, lâmpada fluorescente e luz ultra violeta (germicida), sendo utilizada para 
diversos tipos de operações que requerem assepsia, tais como verter meio em placas de 
Petri, isolar e repicar microrganismos. 
Microscópio óptico - utilizado em observação de imagem ampliada até mil vezes por 
meio de dois conjuntos de lentes: as objetivas, que ficam próximas do objeto e ampliam 
a imagem real; e as oculares, próximas do olho do observador, que ampliam a imagem 
novamente. É constituído por duas partes – uma parte mecânica e uma parte óptica. Cada 
parte engloba uma série de componentes constituintes do microscópio. A parte mecânica 
serve para dar estabilidade e suportar a parte óptica. É constituída por base ou pé, 
parafusos macro e micrométricos, haste ou braço, mesa ou platina, charriot, presilha, 
tambor ou revólver das objetivas e canhão. A parte óptica é constituída por fonte de 
iluminação, lente condensadora ou condensador, botão do condensador, diafragma e pelas 
lentes oculares e objetivas – o conjunto de lentes que permitem a ampliação do objeto. A 
ampliação dada ao microscópio é igual ao produto da ampliação da objetiva pela 
ampliação da ocular. Visto que esses componentes são de alta precisão e alto custo,o 
microscópio requer cuidados especiais de transporte, utilização e manutenção. 
 
 
3 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Balança analítica: usada para se obter massas de sólidos e líquidos com alta exatidão. 
 
Bico de Bunsen: é um bico de gás, alimentado por um tubo de borracha, fixado em uma 
base metálica com entrada de ar, cuja chama é utilizada para técnicas de flambagem e 
esterilização de materiais contaminados. 
 
 
4 
 
Os principais MATERIAIS e VIDRARIAS são: 
 
Erlenmeyer (1), proveta (2), béquer (3), placas de Petri (4), tubos de ensaio (cultura) (5), 
lâminas e lamínulas (6), alça de Drigaslky (7), pipeta de transferência (8), câmara de 
Neubauer (9) alça de inoculação (ou de platina) (10), pipetas automáticas (11), pisseta 
(12). 
 
1) 
 
2) 
 
3) 
 
4) 
 
5) 
 
6) 
 
7) 
 
8) 
 
9) 
 
10) 
 
11) 
 
12) 
 
 
 
 
 
 
 
5 
 
Procedimentos 
- Averiguação da presença de microrganismos no ambiente: 
 
1- Exponha a placa de Petri, contendo o meio de cultura estéril, a uma condição de 
inoculação de sua preferência, por exemplo, exposição à pele, ao ar, cabelo, etc. Incubar 
à 25 ℃, por uma semana (até a próxima aula). Mantenha uma placa estéril como Controle. 
 
- Verificação da utilidade do Bico de Bunsen 
 
1- Abrir uma placa de Petri, contendo o meio de cultura estéril, próximo à chama do Bico 
de Bunsen, por 60 segundos e posteriormente, incubar à 25 ℃, por uma semana (até a 
próxima aula). Mantenha uma placa estéril como Controle. 
 
 
 
LEMBRE-SE DE IDENTIFICAR O MATERIAL: as placas devem ser identificadas 
na borda da placa, com número da turma, bancada, data e condição de incubação. 
 
 
6 
 
Resultados 
Após o período de incubação, anotar a presença ou ausência de microrganismos nas 
diversas condições, identificando os diferentes morfotipos encontrados. 
 
- Averiguação da presença de microrganismos no ambiente: 
Número de morfotipos: __________________ 
Observação:____________________________________________________________ 
 
 
- Verificação da eficácia do Bico de Bunsen: 
Número de morfotipos: __________________ 
Observação:____________________________________________________________ 
 
 
 
7 
 
Exercícios 
1- Qual é a utilidade do Bico de Bunsen no Laboratório de Microbiologia? 
 
 
 
 
 
 
2- Explique a finalidade e o princípio do funcionamento da autoclave. 
 
 
 
 
 
 
3- Diferencie colônias de bactérias e fungos filamentosos. Dê as principais características 
da morfologia das colônias. 
 
 
 
 
 
 
 
4- Com base nos resultados, o que aconteceu com os Controles? Explique os resultados 
dos Ensaios. 
 
8 
 
Prática 2 – Meios de cultura: utilização, preparo e esterilização 
 
Todos os organismos vivos necessitam de uma variedade de elementos químicos 
que são essenciais para a síntese e funcionamento normal dos componentes celulares. 
Estes elementos estão presentes na natureza na forma de compostos orgânicos ou 
inorgânicos. O meio de cultura, também denominado meio de cultivo, consiste em um 
material nutritivo, preparado em laboratório, que se destina ao cultivo artificial dos 
microrganismos, devendo, portanto, fornecer os nutrientes indispensáveis ao seu 
crescimento. As exigências nutricionais dos microrganismos, em relação aos elementos 
requeridos, são bastante semelhantes àquelas exigidas pelas plantas ou animais, ou seja, 
necessitam de carbono, nitrogênio, hidrogênio, oxigênio, enxofre, fósforo, cálcio, 
potássio, magnésio, além dos micronutrientes e vitaminas. A diferença básica entre os 
microrganismos e as plantas e animais é quanto à fonte de cada elemento. As plantas os 
utilizam predominantemente na forma inorgânica e os animais, na forma orgânica. Os 
microrganismos podem utilizá-los tanto na forma orgânica, inorgânica ou até mesmo 
gasosa. Entre os microrganismos, os que são capazes de se desenvolver em meios 
inteiramente inorgânicos (minerais) são chamados de autotróficos, enquanto que outros 
microrganismos que exigem compostos orgânicos como fonte de carbono e de energia 
são chamados de heterotróficos. 
Dependendo da finalidade a que se destinam, os meios de cultura podem ser 
líquidos, sólidos ou semi-sólidos. Os meios líquidos podem ser usados em estudos de 
crescimento, de fermentação e na produção de biomassa, enquanto que os meios sólidos 
são úteis para contagem e isolamento de microrganismos. Por fim, os meios semissólidos 
são utilizados para fins muito específicos, como, por exemplo, para a detecção de placas 
de lise em culturas bacterianas infectadas por vírus. Os meios sólidos e semi-sólidos são 
acrescidos de agente solidificante, o ágar, normalmente na concentração de 1,5% para os 
meios sólidos e 0,75% para os meios semi-sólidos. O ágar consiste de uma mistura de 
dois polissacarídeos: agarose e agaropectina. A agarose é formada por unidades 
repetitivas de agarobiose (dissacarídeo formado por D-galactose, 3,6-anidro-L-
galactopiranose e ácido D-glucurônico, extraído de algas vermelhas (Gelidium corneum- 
alga marinha japonesa) a 80 oC, com H2SO4 diluído. O ágar tem a propriedade de fundir 
em temperatura de 80 a 100 oC e solidificar-se em temperaturas abaixo de 45 oC. 
Além disso, com respeito à sua composição, existem os meios de cultivo naturais, 
como infusão de batata, sangue e leite, nos quais a composição química exata não é 
 
9 
 
conhecida. Existem, também, os meios sintéticos, contendo componentes químicos puros, 
orgânicos e/ou inorgânicos, bem como aqueles que podem ser obtidos pela combinação 
de reagentes puros com extratos naturais. A seguir, serão descritos os diferentes tipos de 
meios de cultura, os quais são classificados em função da composição química e/ou 
função. 
 
1. Meios de cultura complexos ou indefinidos: são meios de cultura nos quais os 
componentes possuem todos os nutrientes requeridos pelos microrganismos, mas a 
quantidade exata não é especificada. Esses meios de cultura são preparados com base em 
produtos naturais, como: Extrato de carne - solução aquosa de carne bovina concentrada 
em pasta. Peptona - proteínas que foram parcialmente degradadas por enzimas, como 
hidrolisado de caseína do leite, hidrolisado de proteínas da soja, carne, gelatina e outras 
fontes de proteínas. Extrato de levedura, sangue, soro, leite, extrato de solo e fluido 
de rúmen - todos esses materiais são complexos e contêm açúcares, aminoácidos, 
vitaminas e sais. 
 
2. Meios quimicamente definidos: são os meios nos quais a composição exata de cada 
nutriente ou elemento químico é conhecido (Ex: Tabela 1). Adicionar ou retirar um 
determinado elemento do meio permite conhecer se aquele constituinte em particular é 
essencial para o crescimento de determinado microrganismo (fator de crescimento). 
 
Tabela 1- Meio de cultura quimicamente definido para o crescimento de bactérias 
heterotróficas. 
 
Ingrediente Função Quantidade 
Glicose Fonte de carbono e energia 10 g 
NH4H2PO4 Fonte de nitrogênio, tampão e íons essenciais 5 g 
K2HPO4 Tampão e íons essenciais 1 g 
NaCl Íons essenciais 5 g 
Água destilada Solvente 1000 mL 
 
 
 
10 
 
3. Meios Especiais: são meios formulados com objetivos específicos, utilizados 
principalmente nos trabalhos de isolamento e identificação de microrganismos. Podem 
ser: 
3.1. Meios seletivos: são designados para o aumento do crescimento de um determinado 
microrganismo ou grupo de microrganismos em detrimento de outros. Alguns meios 
seletivos possuem corantes na sua composição (ex. verde brilhante), feniletanol e 
antibióticos, que inibem determinados grupos de microrganismos. Para o isolamento de 
bactérias, pode-se utilizar meio apropriado para o crescimento de bactérias e contendo 
também antibiótico contra fungos e vice-versa. Para o isolamento de fungos, pode-se 
utilizar também meio cuja composição seja desfavorável para bactérias, em funçãode pH 
e concentração de açúcares, como é o caso do meio Sabouraud para o crescimento de 
fungos (Tabela 2). 
 
Tabela2- Composição química do meio Sabouraud. 
Ingrediente Função Quant. 
Peptona Fonte de carbono, nitrogênio e elementos 10 g 
Glicose Fonte de carbono e energia - Alta concentração inibe 
crescimento de bactérias 
40 g 
Ágar Agente gelatinizante - ‘solidificante’ 15 g 
Água destilada Solvente 1000 mL 
pH Baixo pH inibe bactérias, mas permite crescimento de 
fungos 
4,5 
 
3.2. Meios Diferenciais: são utilizados para diferenciar microrganismos entre vários tipos 
em uma mesma placa. Muito utilizados para determinar qualidade de água e de alimentos 
em geral. 
Existem meios que são diferenciais/seletivos, porque, além de permitir a 
diferenciação entre diferentes grupos ou espécies, permitem a contagem de um grupo em 
detrimento de outro. Estes podem distinguir entre grupos de organismos 
morfologicamente e bioquimicamente relacionados, pois incorporam componentes 
químicos que, seguindo inoculação e incubação, produzem mudança característica na 
aparência do crescimento da colônia bacteriana e/ou no meio de cultura ao redor das 
 
11 
 
colônias, o que permite a diferenciação. Os meios de cultura a seguir são representativos 
desses dois tipos 
I. Ágar Sal Manitol: Este meio de cultura contém alta concentração de sal, 7,5 % NaCl, 
que é inibitório ao crescimento da maioria das bactérias, mas não para estafilococos. O 
meio de cultura também realiza função diferencial: contém o carboidrato manitol, que 
alguns estafilococos são capazes de fermentar e vermelho de fenol (phenolred), que é um 
indicador de pH para detectar ácido produzido pela fermentação do manitol. Colônias de 
estafilococos exibem um halo amarelo ao redor da colônia; estafilococos que não 
fermentam manitol não produzirão mudança na coloração. 
 
II. Ágar Sangue: O sangue que é incorporado neste meio de cultura é um ingrediente de 
enriquecimento para o cultivo de organismos exigentes como o Streptococcus spp. O 
sangue também permite a demonstração de propriedades hemolíticas de alguns 
microrganismos, particularmente estafilococos. 
 
III. Ágar MacConkey: A ação inibitória do cristal violeta no crescimento de organismos 
Gram-positivos permite o isolamento de bactérias Gram-negativas. A incorporação de 
lactose, sais biliares, e o indicador de pH vermelho neutro, permite a diferenciação de 
bactérias entéricas devido à habilidade de fermentar lactose. Neste meio de cultivo, 
enterobactérias são separadas em dois grupos: 
 
a- Coliformes: produzem ácido como resultado da fermentação da lactose. A bactéria 
exibe coloração vermelha na superfície da colônia. Escherichia coli produz maiores 
quantidades de ácido, em função da fermentação da lactose, do que outras espécies 
de coliformes. Quando isso ocorre, o meio de cultura que cerca o crescimento 
também se torna vermelho, por causa da ação do ácido que precipita sais biliares, 
seguindo-se então, a absorção do vermelho neutro. 
b- Bacilos da disenteria, tifoide e paratifoide: não são fermentadores de lactose, e, 
portando, não produzem ácido. As colônias aparecem sem cor e frequentemente 
transparentes. 
 
IV. Ágar EMB (Eosyn Methylene Blue Agar, Levine): a presença de lactose e os corantes 
eosina e azul de metileno permitem diferenciação entre fermentadores e não 
fermentadores de lactose. As colônias de E. coli apresentam coloração azul-preta com 
brilho metálico esverdeado causado pela grande quantidade de ácido. Outra bactéria 
coliforme, como a Enterobacter aerogenes, produz colônias espessas, mucoides e rosas 
neste meio de cultura. Bactérias entéricas que não fermentam lactose produzem colônias 
 
12 
 
sem cor, que, devido à sua transparência, parecem adquirir a coloração roxa do meio de 
cultura. Esse meio de cultura é também parcialmente inibitório ao crescimento de 
organismos Gram-positivos e, portanto, o crescimento de gram-negativos é mais 
abundante. 
 
V. Ágar PEA (Phenyl ethyl alcohol agar): Esse meio de cultura é usado para o isolamento 
da maioria de cocos Gram-positivos. O álcool fenil etílico inibe parcialmente bactérias 
Gram-negativas, as quais podem formar colônias visíveis, cujos tamanho e número são 
muito menores que em outros meios de cultura. 
 
3.3. Meios de Enriquecimento: Meios convencionais enriquecidos com um ou mais 
componentes químicos que favoreçam uma determinada população de microrganismo 
numa população mista. Por exemplo, a adição de lactose no meio favorece o crescimento 
de bactérias que produzem β-galactosidase, aumentando o seu crescimento 
exponencialmente. Além dos meios de enriquecimento, podem-se utilizar outras técnicas 
de enriquecimento em função de diferentes condições físicas ou físico-químicas, como 
pH, temperatura, atmosfera, etc. 
Além dos requerimentos nutricionais, fatores físicos interferem no crescimento 
microbiano, como temperatura, presença de oxigênio, de luz, salinidade e o pH. Cada 
espécie bacteriana cresce sob faixas de temperatura características: psicrófilos (15-20 oC), 
mesófilos (25-40 oC) e termófilos (45-60 oC). Quanto à presença de oxigênio livre, 
existem bactérias aeróbias, anaeróbias, anaeróbias facultativas e microaerófilas. Para a 
maioria das bactérias, o pH ótimo de crescimento varia entre 6,5 e 7,5. 
 
Esterilização de meios de cultura 
 
A utilização de meios de cultura estéreis é uma condição essencial para se trabalhar 
com microbiologia. Nesta aula prática teremos oportunidade de preparar meios de cultura 
líquido e sólido e esterilizá-los por calor úmido em autoclave, um dos métodos de 
esterilização de meios de cultura mais comuns no laboratório de microbiologia. 
✓ A utilização de calor úmido é um dos métodos mais eficazes de destruição 
de microrganismos. A morte das células microbianas por ação do calor 
úmido resulta da desnaturação das proteínas e da desestabilização da membrana 
citoplasmática. A autoclave torna-se uma câmara com vapor de água saturado à 
 
13 
 
pressão de 1 atm acima da pressão atmosférica, atingindo uma temperatura de 121 
ºC. No laboratório de microbiologia é usual sujeitar o material a ser esterilizado a 
121ºC durante 15 minutos, de modo a assegurar a morte de todas as formas de 
vida bacterianas, incluindo dos endósporos bacterianos, que são mais resistentes 
ao calor do que as células vegetativas. Contudo, o tempo necessário para se 
esterilizar convenientemente os materiais a esta temperatura depende da natureza 
do material a esterilizar e/ou do seu volume. O calor úmido sob pressão é utilizado 
na esterilização de meios de cultura que não contenham componentes termolábeis, 
bem como na esterilização de materiais de laboratório utilizados nos estudos de 
microbiologia. 
Objetivos 
1- Preparar os meios de cultura: caldo nutriente e ágar nutriente ou outro sugerido pelo 
professor; 
2- Executar esterilização em autoclave (calor úmido) dos meios de cultura; 
3- Observação de placas com diferentes meios e culturas crescidas. 
 
Materiais 
Reagentes: Na2HPO4, NaCl, extrato de carne, peptona, água destilada. 
Equipamentos e utensílios: espátulas, vidrarias (pipetas, provetas, béqueres, bastão de 
vidro, frascos Erlenmeyer), tampões de algodão, autoclave. 
 
Procedimento 
Preparo de meios de cultura: caldo/ágar nutriente. 
1- Pesar isoladamente nos béqueres os componentes do meio de cultura para o volume 
final de 100mL de caldo nutriente; 
2- Dissolva cada componente em béquer, adicionando um pequeno volume de água 
destilada e agitando com bastão de vidro; 
3- Transfira cada componente dissolvido para um frasco Erlenmeyer, misturando os 
componentes; 
4- Complete o volume com água destilada para 100mL, fazendo uso de uma proveta; 
5- Para preparar o ágar nutriente adicione a um frasco Erlenmeyer contendo 50 mL do 
Caldo Nutriente, 0.75 g de ágar (1,5 %). 
 
 
14 
 
Importante! 
1º) O ágar nãodissolve a temperatura ambiente e precisa ser fundido a 80-100 %; 
2º) Nunca ocupar mais que 1/3 do volume do frasco; 3º) os meios precisam ser 
esterilizados antes do uso. 
 
Tabela 3- Composição do meio de cultura Ágar Nutriente 
 
Composição Quantidade 
Na2HPO4 0,2 g 
NaCl 0,3 g 
Extrato de Carne 0,3 g 
Peptona 0,5 g 
Ágar 1,5 g 
Água destilada 100 mL 
 
 
 
 
Tabela 4- Composição do meio de cultivo BDA 
 
Composição Quantidade 
Caldo de Batata 50 mL 
Dextrose 2 g 
Ágar 1,5 g 
Água destilada 100 mL 
 
 
 
 
 
 
 
15 
 
Exercícios 
 
1- Cite as funções dos componentes dos meios de cultura Ágar Nutriente que você 
preparou. 
 
 
 
 
 
 
2- Defina a diferença entre microrganismos autotróficos e heterotróficos. Dos grupos de 
microrganismos estudados, classifique-os se são autotróficos ou heterotróficos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
3- Por que, algumas vezes, a esterilização de meios de cultura por calor sob pressão, em 
autoclave, não é adequada? Qual seria a alternativa sugerida nesses casos? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
16 
 
Prática 3 – Observação microscópica de protistas e algas 
 
Os protistas compreendem os microrganismos eucariotos fototróficos e não 
fototróficos, caracterizando-se pela possível capacidade de locomoção por cílios e 
flagelos. As algas, por sua vez, possuem uma parede celular rígida, composta 
principalmente por celulose, realizam fotossíntese e algumas também possuem flagelo. 
As algas e os protistas são facilmente visualizados em preparações a fresco e muitos deles 
podem ser visualizados utilizando-se as objetivas de menor aumento (4 e 10 X). O protista 
Paramecium, por exemplo, apresenta 200 μm de comprimento. 
 Os Oomicetos se assemelham morfologicamente aos fungos, porém são 
filogeneticamente distintos desse grupo, apresentando várias características bioquímicas 
e moleculares diferentes, sendo classificados como Protistas. Microrganismos aquáticos 
apresentam esporos flagelados, hifas não septadas e reprodução assexuada por zoósporos. 
Na reprodução sexuada, ocorre a formação de um esporo de parede espessa chamado 
oósporo. Ao contrário dos fungos, a parede celular dos Oomicetos apresenta pequena 
quantidade (< 1%) ou ausência de quitina. Em vez disso, observa-se a presença de 
celulose e uma alta proporção de outras β-glucanas, contendo também o aminoácido 
hidroxiprolina. Estes organismos atuam na natureza como decompositores de matéria 
orgânica e parasitas de plantas e animais. 
Nesta aula serão preparadas lâminas a fresco de amostras contendo algas e 
protistas. Será observada a dimensão dos microrganismos, a diversidade das células 
microbianas quanto ao tamanho e à forma, assim como a ocorrência ou não de motilidade. 
Também, serão visualizadas lâminas permanentes de Oomicetos (Estramenópilos). 
 
Objetivos 
1- Manusear adequadamente em microscópio óptico; 
2- Distinguir, morfologicamente protistas e algas (ATENÇÃO: células clorofiladas 
podem ser cianobactérias ou protistas clorofilados); 
3- Preparar lâminas a fresco; 
4- Observar lâminas permanentes de Oomicetos. 
 
 
 
 
17 
 
Materiais 
Microrganismos: Amostras de água estagnada, suspensão de solo ou amostras de líquido 
ruminal. Lâminas permanentes de Oomicetos. 
Meios e Soluções: Solução de azul de metileno. 
Equipamentos e utensílios: Microscópio ótico, lâminas, lamínulas e pipetas Pasteur, 
alça de platina. 
 
Procedimento 
1- Protistas e algas- Colocar uma gota da suspensão utilizando uma pipeta Pasteur em 
uma lâmina. 
2- Encostando uma das bordas da lamínula na gota, deixe-a descer suavemente para evitar 
a formação de bolhas de ar entre a lâmina e a lamínula. 
3- Manuseie corretamente o microscópio ótico. 
 
Atenção: Se você tem dúvida quanto à utilização do equipamento, pergunte ao professor 
como usá-lo. Não levante a platina do microscópio (movimentando o macrométrico) com 
a objetiva de maior aumento encaixada! 
 
4- Procure campos onde os organismos exibam motilidade, utilizando os parafusos do 
“charriot”. 
5- Terminada a observação, desligue a luz; gire o revólver para encaixar a objetiva de 
menor aumento, passando pela objetiva de 10X; abaixe a platina e retire a lâmina. 
6- Após a observação, descarte a lâmina e a lamínula nas bandejas com detergente e 
desinfetante. 
 
 
18 
 
Resultados 
Observe as diferenças entre os microrganismos focalizados e desenhe-os, 
considerando tamanho, forma, motilidade e coloração. Use as representações dos campos 
abaixo. NAS PÁGINAS SEGUINTES EXISTEM EXEMPLOS DA MORFOLOGIA DE 
PROTISTAS E ALGAS. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Oomicetos 
 
 
 
 
 
 
19 
 
Exercícios 
1- Cite características de protistas e algas que os distinguem. 
 
 
 
 
 
 
 
 
2- Quais são as vantagens e as desvantagens da observação de lâminas em preparações a 
fresco? 
 
 
 
 
 
 
 
3- Por que os Oomicetos eram classificados, anteriormente, como fungos? 
 
20 
 
MORFOLOGIA DE PROTISTAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
(24) Didinium(18) Carchesium(12) Loxodes(6) Amoeba
(23) Euplotes(17) Vorticella(11) Lionotus(5) Trichamoeba
(22) Hypotrichidium(16) Stentor(10) Lacymaria(4) Protospongia
(21) Onychodromos(15) Condylostoma(9) Paramecium(3) Codosiga
(20) Stylonychia(14) Coleps(8) Diffugia(2) Cercomonas
(19) Zoothamnium(13) Blepharisma(7) Mayorella(1) Heteronema
(24) Didinium(18) Carchesium(12) Loxodes(6) Amoeba
(23) Euplotes(17) Vorticella(11) Lionotus(5) Trichamoeba
(22) Hypotrichidium(16) Stentor(10) Lacymaria(4) Protospongia
(21) Onychodromos(15) Condylostoma(9) Paramecium(3) Codosiga
(20) Stylonychia(14) Coleps(8) Diffugia(2) Cercomonas
(19) Zoothamnium(13) Blepharisma(7) Mayorella(1) Heteronema
 
21 
 
MORFOLOGIA DE ALGAS FLAGELADAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
(20) Volvox (100X)(15) Eudorina (175X)(10) Chlorogonium (1000X)(5) Lepocinclis (350X)
(19) Gonium (350X)(14) Pandorina (350X)(9) Carteria (1500X)(4) Phacus (350X)
(18) Ceratium (175X)(13) Synura (350X)(8) Chlamydomonas (1000X)(3) Phacus (1000X)
(17) Peridinium (350X)(12) Chrysococcus (3000X)(7) Phacotus (1500X)(2) Euglena (700X)
(16) Dinobyron (1000X)(11) Pyrobotrys (1000X)(6) Trachelomonas (1000X)(1) Euglena (700X)
(20) Volvox (100X)(15) Eudorina (175X)(10) Chlorogonium (1000X)(5) Lepocinclis (350X)
(19) Gonium (350X)(14) Pandorina (350X)(9) Carteria (1500X)(4) Phacus (350X)
(18) Ceratium (175X)(13) Synura (350X)(8) Chlamydomonas (1000X)(3) Phacus (1000X)
(17) Peridinium (350X)(12) Chrysococcus (3000X)(7) Phacotus (1500X)(2) Euglena (700X)
(16) Dinobyron (1000X)(11) Pyrobotrys (1000X)(6) Trachelomonas (1000X)(1) Euglena (700X)
 
22 
 
MORFOLOGIA DE ALGAS FILAMENTOSAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
(12) Desmidium (175X)(6) Tribonema (300X)
(17) Draparnaldia (100X)(11) Ulothrix (175X)(5) Vaucheria (100X)
(16) Stigeoclonium (300X)(10) Ulothrix (175X)(4) Oedogonium (350X)
(15) Zygnema (175X)(9) Microspora(3) Bulbochaete (100X)
(14) Spirogyra (175X)(8) Batrachospermum (2X)(2) Cladophora (100X)
(13) Mougeotia (175X)(7) Chara (3X)(1) Rhizoclonium (175X)
(12) Desmidium (175X)(6) Tribonema (300X)
(17) Draparnaldia (100X)(11) Ulothrix (175X)(5) Vaucheria (100X)
(16) Stigeoclonium (300X)(10) Ulothrix (175X)(4) Oedogonium (350X)
(15) Zygnema (175X)(9) Microspora(3) Bulbochaete (100X)
(14) Spirogyra (175X)(8) Batrachospermum (2X)(2) Cladophora (100X)
(13) Mougeotia (175X)(7) Chara (3X)(1) Rhizoclonium (175X)
 
23 
 
MORFOLOGIA DE ALGAS NÃO FILAMENTOSAS E NÃO FLAGELADAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
24 
 
MORFOLOGIA DE DIATOMÁCEAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
(23) Meridion (750X)(17) Fragillaria (750X)(11) Tabellaria (1000X)(5) Gomphonema (2000X)
(18) Fragillaria (750X)(12) Synedra (350X)(6) Cocconeis(750X)
(22) Stephanodiscus (750X)(16) Stauroneis (350X)(10) Tabellaria (175X)(4) Cymbella (1000X)
(21) Navicula (750X)(15) Surirella (350X)(9) Cyclotella (1000X)(3) Cymbella (175X)
(20) Asterionella (750X)(14) Melosira (750X)(8) Pinnularia (175X)(2) Gomphonema (175X)
(19) Asterionella (175X)(13) Synedra (175X)(7) Nitschia (1500X)(1) Diatoma (1000X)
(23) Meridion (750X)(17) Fragillaria (750X)(11) Tabellaria (1000X)(5) Gomphonema (2000X)
(18) Fragillaria (750X)(12) Synedra (350X)(6) Cocconeis (750X)
(22) Stephanodiscus (750X)(16) Stauroneis (350X)(10) Tabellaria (175X)(4) Cymbella (1000X)
(21) Navicula (750X)(15) Surirella (350X)(9) Cyclotella (1000X)(3) Cymbella (175X)
(20) Asterionella (750X)(14) Melosira (750X)(8) Pinnularia (175X)(2) Gomphonema (175X)
(19) Asterionella (175X)(13) Synedra (175X)(7) Nitschia (1500X)(1) Diatoma (1000X)
 
25 
 
MORFOLOGIA DE CIANOBACTÉRIAS 
Obs: CIANOBACTÉRIAS SÃO PROCARIOTOS. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
(17) Agmenellum (175X)(11) Lyngbya (700X)(5) Cylindrospermum (175X)
(18) Calothrix (350X)(12) Tolypothrix (350X)(6) Arthrospira (700X)
(22) Anacystis (700X)(16) Agmenellum (700X)(10) Aphanizomenon (175X)(4) Nodularia (350X)
(21) Anacystis (175X)(15) Gomphosphaeria (350X)(9) Oscillatoria (175X)(3) Anabaena (175X)
(20) Anacystis (700X)(14) Gomphosphaeria (1000X)(8) Phormidium (350X)(2) Anabaena (350X)
(19) Rivularia (175X)(13) Entophysalis (1000X)(7) Microcoleus (350X)(1) Anabaena (350X)
(17) Agmenellum (175X)(11) Lyngbya (700X)(5) Cylindrospermum (175X)
(18) Calothrix (350X)(12) Tolypothrix (350X)(6) Arthrospira (700X)
(22) Anacystis (700X)(16) Agmenellum (700X)(10) Aphanizomenon (175X)(4) Nodularia (350X)
(21) Anacystis (175X)(15) Gomphosphaeria (350X)(9) Oscillatoria (175X)(3) Anabaena (175X)
(20) Anacystis (700X)(14) Gomphosphaeria (1000X)(8) Phormidium (350X)(2) Anabaena (350X)
(19) Rivularia (175X)(13) Entophysalis (1000X)(7) Microcoleus (350X)(1) Anabaena (350X)
 
26 
 
STRAMINIPILA – FILO OOMYCOTA 
 
Características gerais 
 → “Hifas” não septadas 
 → Reprodução assexuada: Zoósporos 
 → Reprodução sexuada: Oósporos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
27 
 
Prática 4 – Isolamento de fungos filamentosos e morfologia de micélios e leveduras 
 
 
Parte 1: Isolamento de fungos filamentosos: saprófitas e fitopatogênicos 
 
Os fungos filamentosos encontram-se amplamente distribuídos na natureza, 
proliferando como saprófitas, parasitas ou como simbiontes. São heterotróficos, 
multicelulares, geralmente aeróbios e apresentam reprodução assexuada e sexuada. Como 
saprófitas, degradam a matéria orgânica, transformando-a em formas químicas simples 
que retornam ao solo. Se por um lado, os fungos saprófitas são úteis na reciclagem da 
matéria orgânica, por outro, podem causar a deterioração de alimentos, tecidos vegetais 
e ambientes. Como parasitas, causam doenças em vegetais e animais, inclusive no 
homem. Os fungos podem atuar ainda em associações simbióticas de grande importância, 
como as associações com outros organismos, tais como as algas, formando os liquens, ou 
com raízes das plantas, formando as micorrizas. 
Antes de estudarmos o efeito do ataque de fungos em materiais diversos, é 
geralmente necessário isolá-los, tanto para sua identificação como para determinar seus 
requerimentos nutricionais e seus produtos metabólicos. Os métodos usados para o 
isolamento de fungos e seu cultivo dependem muito do seu habitat natural. Geralmente, 
empregam-se meios sólidos acidificados, com pH em torno de 4 a 5, com o objetivo de 
inibir o crescimento de bactérias. Para o isolamento de fungos saprófitas do solo ou de 
alimentos, pode-se utilizar os métodos de diluição ou estrias em superfície de meio sólido. 
Para isolamento de fungos parasitas de vegetais, os métodos variam de acordo com o 
fungo e com o tipo de lesão. Na maioria das vezes, a inoculação é feita transferindo-se 
fragmentos do tecido atacado para meio de cultura próprio, como, por exemplo, o BDA 
(batata-dextrose-ágar) ou então, utilizando o substrato natural (sementes, cascas de frutas, 
tecidos vegetais, etc). As placas são incubadas e o isolamento é feito com base em placas 
que apresentarem um número pequeno de colônias dispersas. 
 Nessa aula será realizado o isolamento de fungos filamentosos a partir de material 
vegetal e corpos de frutificação de fungos filamentosos (cogumelos) 
 
Objetivos 
1- Treinar em técnicas para o isolamento de fungos filamentosos; 
2- Reconhecer os diferentes modos de vida dos fungos na natureza 
 
 
28 
 
Materiais 
Amostras: Frutas e vegetais em decomposição, folhas com fungos fitopatogênicos. 
Meios e Soluções: Tubos com solução salina esterilizada, meio BDA (Batata Dextrose 
Ágar), álcool 70 %, Hipoclorito 0,5 %. 
Equipamentos e utensílios: incubadora, pinça, tubos de ensaio, Placas de Petri estéreis 
e placas com BDA, alça de platina, alça de Drigalsky, pipetas, pipetadores, papel de filtro 
e estilete 
 
Procedimento 
Isolamento de fungos filamentosos saprófitas 
Isolamento de fungo saprófita a partir de material vegetal em decomposição. 
1- Recolher com alça de platina esporos ou micélio de alimentos em decomposição. 
2- Diluir a amostra em solução salina esterilizada. 
3- Transferir 0,1 ml da suspensão para superfície do meio BDA. 
4- Espalhar o inóculo com alça de Drigalsky. 
5- Identificar as placas colocando o nome da amostra, turma e bancada. 
6- Incubar a 25 oC por 7 dias ou até a formação visível de colônias. 
 
Isolamento de fungos fitopatogênicos 
1- Escolher material em que as lesões sejam recentes, para evitar que microrganismos 
saprófitas dificultem o isolamento do patógeno; 
2- Lavar o material em água corrente e secar o mesmo em papel absorvente. Cortar o 
material vegetal em quadrados de aproximadamente 0,5 cm, tendo o cuidado de incluir 
também as partes saudáveis do tecido; 
3- Submergir os fragmentos em álcool 70 % por 30 segundos, para quebrar a tensão 
superficial e iniciar a descontaminação da superfície do material vegetal; 
4- Com uma pinça ou estilete flambado, transferir os quadrados para solução de 
hipoclorito de sódio 1 % por 30 segundos; 
5- Transferir os fragmentos para água destilada estéril para remover o excesso de 
hipoclorito; 
6- Em seguida, remover o excesso de água dos fragmentos em papel absorvente estéril 
(em placa de Petri); 
7- Transferir os fragmentos (4) com uma pinça flambada (com álcool) para a placa de 
Petri com BDA. Incubar a temperatura ambiente por 7 dias. 
 
29 
 
Resultados 
Avalie o crescimento dos fungos nos meios utilizados, e esquematize as colônias fúngicas 
encontradas de cada isolado obtido. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
30 
 
Exercícios 
1- Porque no isolamento de fungos fitopatogênicos utiliza-se uma amostra contendo parte 
da lesão e parte saudável? 
 
 
 
 
 
 
2- Como saber se realmente aquele fungo isolado é realmente o causador da doença na 
planta? 
 
 
 
 
 
 
3- Discuta as diferenças quanto ao modo de vida dos fungos. 
 
31 
 
Parte 2: Morfologia de fungos filamentosos e leveduras 
 
Os fungos são organismos heterotróficos, geralmente aeróbios, de ampla 
distribuição no ambiente e que podem se apresentar na forma de fungos filamentosos e/ou 
leveduras. 
Os fungos filamentosos são caracterizados por distinta estrutura filamentosa, 
multinucleada, conhecida como micélio (podendo apresentar-se cotonoso, ou seja, com 
aspecto de algodão). O micélio é formado por um conjunto de filamentos ramificados que 
se irradiam sobre ou dentro do substrato utilizado como alimento. Cada um desses 
filamentos recebe o nome de hifa. A hifa é constituída por uma parede tubular delgada e 
transparente, contendo no seu interior o protoplasma. As hifas podem ser cenocíticas, ou 
seja, o protoplasma é contínuo,ou septada, quando o protoplasma é interrompido por 
paredes transversais denominadas septos. 
As leveduras são fungos unicelulares classificadas como ascomicetos ou 
basidiomicetos, que se reproduzem vegetativamente por brotamento ou fissão, não 
produzindo corpo de frutificação. O termo levedura sempre foi associado à história do 
processo fermentativo. O significado da palavra levedura provém do latim “levere” e 
significa suspender, referindo-se à produção de gás carbônico durante a fermentação, 
levantando a superfície líquida como uma espuma. 
As leveduras podem ser classificadas em anamórficas ou mitóticas (reproduzem-
se assexuadamente por brotamento ou fissão) e teleomórficas ou meióticas (reproduzem-
se sexuadamente). Representam um grupo muito heterogêneo de fungos unicelulares, que 
diferem amplamente nas características morfológicas e fisiológicas. Em leveduras, a 
reprodução assexuada é a forma primária de aumento do número de indivíduos na 
população. Há dois modos básicos de reprodução assexuada em leveduras conforme a 
espécie: fissão ou brotamento. No primeiro caso (por exemplo, em Schizosaccharomyces 
pombe) ocorre mitose nuclear, seguida de simples divisão celular equitativa. No segundo 
(por exemplo, em Saccharomyces cerevisiae), paralelamente à mitose nuclear, forma-se 
na superfície da célula-mãe uma pequena projeção - o broto - que, à medida que cresce, 
engloba material citoplasmático e um dos núcleos resultantes da mitose. Posteriormente, 
o broto libera-se da célula-mãe da qual é geneticamente idêntico. Na reprodução sexuada, 
duas células haplóides de tipos sexuais diferentes podem se fundir formando uma célula 
com dois núcleos que, eventualmente, se fundem, formando um núcleo diplóide. Esse 
 
32 
 
sofre meiose originando quatro núcleos haplóides e, então, quatro novas células se 
formarão, cada uma com um dos quatro núcleos haplóides. 
 A biologia e a biodiversidade de fungos são importantes para a caracterização e 
preservação de espécies, principalmente aquelas com potencial para aplicação 
biotecnológica. As preparações microscópicas para a observação de fungos são de grande 
importância para sua identificação, uma vez que características morfológicas dos micélios 
e células (esta aula), juntamente com características dos esporos (próxima aula) são 
rotineiramente utilizadas para tal fim. 
 
Objetivos 
1- Observar morfologia de fungos filamentosos (micélios) e de colônias de leveduras 
2- Diferenciar leveduras de brotamento e fissão e conhecer as estruturas de formação de 
ascos e pseudomicélio. 
 
Materiais 
Microrganismos: Lâminas de fungos filamentosos, isolados de leveduras que 
apresentem reprodução assexuada e sexuada. 
Meios e soluções: azul de metileno, água destilada 
Equipamentos e utensílios: Microscópio ótico, lâminas, alça de repicagem, bico de 
Bunsen, bandejas e suportes para lâminas. 
 
Procedimento 
Lâminas de fungos filamentosos 
1- Manuseie corretamente o microscópio ótico (se você tem dúvida quanto à utilização 
do equipamento, pergunte ao professor como usá-lo). Focalize a lâmina de fungo 
filamentoso, sequencialmente, com as objetivas de 4X, 10X e 40X; 
2- Observe a organização das hifas e a presença ou ausência de septo; 
3- Terminada a observação, desligue a luz; gire o revólver para encaixar a objetiva de 
menor aumento, passando pela objetiva de 10X; abaixe a platina e retire a lâmina; 
 
Lâminas de leveduras 
1- Limpe bem uma lâmina com papel; 
2- Esterilize a alça de repicagem, aquecendo-a ao rubro no bico de Bunsen; 
 
33 
 
3- Quando a levedura estiver em meio líquido, transfira assepticamente com a alça de 
repicagem uma gota da cultura de leveduras para o centro da lâmina. Se a cultura estiver 
em meio sólido, prepare uma suspensão de células da seguinte maneira: Coloque uma 
gota de água destilada ou azul de metileno sobre a lâmina e colete o material 
assepticamente, raspando, levemente a superfície do ágar com a alça de repicagem (com 
cuidado para não retirar pedaços do meio de cultura, pois o crescimento do 
microrganismo ocorre somente na superfície); 
4- Manuseie corretamente o microscópio ótico (se você tem dúvida quanto à utilização 
do equipamento, pergunte ao professor como usá-lo). Focalize o material, 
sequencialmente, com as objetivas de 4X, 10X e 40X; 
5- Terminada a observação, desligue a luz; gire o revólver para encaixar a objetiva de 
menor aumento, passando pela objetiva de 10X; abaixe a platina e retire a lâmina; 
6- Após a observação, descarte a lâmina e a lamínula nas bandejas com detergente e 
desinfetante, colocadas na bancada lateral. 
 
 
 
34 
 
Resultados 
Desenhe as hifas fúngicas (fungos filamentosos), cenocíticas ou septadas, observadas no 
microscópio. 
 
 
 
 
Desenhe as estruturas vegetativas e reprodutivas das leveduras observadas no 
microscópio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Observações 
Morfologia da Colônia Morfologia das células Tipo de reprodução 
 
 
 
 
 
 
35 
 
Prática 5 – Esporos fúngicos assexuados e sexuados 
 
A reprodução sexuada em fungos pode ocorrer de várias maneiras. Os esporos 
sexuados são formados pela fusão de duas células (gametas), pelo processo denominado 
plasmogamia, que reúne dois núcleos em um único citoplasma. A etapa seguinte é a 
fusão desses dois núcleos, no processo denominado cariogamia, com a formação de um 
núcleo diplóide. A terceira etapa, meiose ou divisão redutora separa o núcleo diplóide em 
núcleos haplóides, que são posteriormente delimitados por uma membrana e parede 
celular, dando origem aos esporos haplóides. Como regra geral, os esporos sexuados são 
produzidos menos frequentemente e em menor número do que os esporos assexuados. Há 
quatro tipos de esporos sexuados de fungos: Zigósporos, Oósporos, Ascósporos e 
Basidiósporos. Quando estes são formados dentro de estruturas em forma de saco, 
conhecidas como ascos, os esporos recebem a denominação de ascósporos, e os fungos 
são incluídos na divisão Ascomycota. Tais esporos são frequentemente encerrados em 
um corpo de frutificação, denominado ascocarpo. Os tipos básicos de ascocarpo são: 
Cleistotécio, Peritécio, Apotécio, Ascostroma. Os esporos sexuados dos fungos 
pertencentes à divisão Basidiomycota se desenvolvem em estruturas em forma de clava, 
os basídios. Esses esporos são denominados basidiósporos e geralmente ocorrem em 
número de quatro por basídio. Quando maduros, os basidiósporos localizam-se na parte 
externa dos basídios, sobre os esterigmas. Em muitas espécies, os basídios e seus 
basidiósporos se organizam em corpos de frutificação altamente complexos, 
denominados basidiocarpos, conhecidos popularmente por cogumelos, orelhas-de-pau e 
bufos. 
As preparações microscópicas para observação de fungos são de extrema 
importância, uma vez que a sua identificação depende, em grande parte, da observação 
de características morfológicas, como o tipo de micélio e de esporos sexuados e 
assexuados. A classificação dos fungos filamentosos baseia-se, principalmente, no tipo 
de micélio vegetativo que o fungo apresenta, isto é, cenocítico ou apocítico, e na presença 
de estruturas de reprodução sexuada e assexuada. 
A seguir são dadas algumas características das divisões que serão abordadas nesta 
aula prática. 
 
 
36 
 
Reino Fungi - Filos 
 
Chytridiomycota - Essa divisão apresenta cerca de 1.000 espécies e são considerados os 
fungos mais basais. A parede celular é composta de quitina e glucanas (polímeros de 
glicose). Somente os quitrídios, apresentam zoósporos flagelados e móveis. Comuns em 
solos úmidos e no rúmen de animais. Esse filo, juntamente com a Zygomycota, tem sido 
um dos principais alvos de novas propostas de classificação. 
 
Zygomycota - Os fungos pertencentes a esse filo caracterizam-se por produzir esporos 
assexuados endógenos, formados em estruturas chamadas de esporângios. A hifa que 
sustentao esporângio é denominada esporangióforo. Ex: Mucor, Rhizopus 
 
Glomeromycota - São fungos de extrema importância econômica, uma vez que 
apresentam associação simbiótica obrigatória com plantas, por meio de estruturas 
conhecidas como arbúsculos, sendo, por isso, conhecidos como fungos micorrízicos 
arbusculares. Ex: Glomus. 
 
Ascomycota - Apresentam micélio com hifas septadas e a característica que os distingue 
dos outros fungos é a presença de estrutura chamada asco, que se apresenta na forma de 
saco, contendo número definido de ascósporos (normalmente oito), resultantes dos 
processos de plasmogamia, cariogamia e meiose. Em geral, os ascomicetos produzem 
seus ascos e ascósporos em corpos de frutificação, denominados ascocarpos. Alguns 
fungos classificados anteriormente como deuteromicetos foram re-classificados e 
atualmente pertencem ao filo Ascomycota. Além dos fungos filamentosos, encontram-se 
nesse grupo muitas espécies de fungos leveduriformes. Ex: A levedura Sacharomyces 
cerevisiae, Aspergillus, Penicillium. 
 
Basidiomycota - São popularmente conhecidos como cogumelos, bufos, orelhas-de-pau, 
ferrugens, carvões, etc. Os basidiomicetos diferem dos outros fungos por produzirem seus 
esporos sexuais (basidiósporos) em estruturas denominadas basídios. Os basidiósporos 
também são resultantes de plasmogamia, cariogamia e meiose. O seu corpo de 
frutificação é denominado basidiocarpo. Nesse grupo também estão algumas espécies de 
fungos classificados anteriormente como deuteromicetos que foram re-classificados na 
divisão Basidiomycota. Ex: Pleurotus, Agaricus e algumas leveduras. 
 
37 
 
Objetivos 
Observar as estruturas mais importantes para a identificação de alguns fungos, com ênfase 
nas estruturas que caracterizam cada divisão, como tipo de esporo e estrutura onde os 
esporos são formados. Atente para o tipo de hifa, cenocítica ou septada (como visto na 
aula passada), pois também é uma característica importante para a classificação. 
 
Materiais 
Amostras: Lâminas prontas (permanentes) de fungos filamentosos e/ou suas estruturas 
reprodutivas. 
Meios e Soluções: lactofenol ou azul de metileno. 
Equipamentos e utensílios: microscópios. 
 
Procedimento 
Visualizar lâminas permanentes de fungos filamentosos, da seguinte maneira: 
1- Manuseie corretamente o microscópio ótico (se você tem dúvida quanto à utilização 
do equipamento, pergunte ao professor como usá-lo). Focalize a lâmina de fungo 
filamentoso, sequencialmente, com as objetivas de 4X, 10X e 40X; 
2- Observe a organização das hifas e a presença ou ausência de septo (quando possível); 
3- Observe as estruturas reprodutivas; 
4- Terminada a observação, desligue a luz; gire o revólver para encaixar a objetiva de 
menor aumento, passando pela objetiva de 10X e abaixe a platina. 
 
 
38 
 
Resultados 
Desenhe as estruturas observadas nas lâminas de fungos filamentosos. 
 
 
Filo Zygomycota 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Filo Glomeromycota 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
39 
 
Filo Ascomycota - Reprodução sexuada 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Filo Ascomycota - Reprodução assexuada 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
40 
 
Filo Basidiomycota - Reprodução sexuada 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
41 
 
Exercícios 
1- Descreva as etapas da reprodução sexuada em fungos. 
 
 
 
 
2- O que são corpos de frutificação? 
 
 
 
 
3- Complete o quadro abaixo dando as principais características dos filos do reino Fungi. 
 
Filo Micélio Tipo de 
esporo 
Exemplo de 
Gênero 
Importância 
Chytridiomycota 
Zygomycota 
Glomeromycota 
Ascomycota 
Basidiomycota 
 
 
 
 
42 
 
REINO FUNGI 
CARACTERÍSTICAS GERAIS DE FUNGOS 
 
Micélio: conjunto ou emaranhado de hifas 
Crescimento radial: formação de colônia fúngica 
Hifas: filamento tubular microscópico 
Tipos de hifas: 
-Hifas septadas 
-Hifas não septadas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Esporo: unidade reprodutiva. 
Tamanho, forma e cores variadas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
43 
 
 
Filo Zigomycota 
 
Características gerais 
 → Hifas não septadas 
 → Reprodução assexuada: esporangiósporos ou aplanósporos 
 → Reprodução sexuada: zigósporo 
Ex: Rhizopusstolonifer 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Zigósporo 
 
 
 
 
 
 
 
44 
 
Filo Glomeromycota 
 
Fungos endomicorrízicos 
 
 Estruturas: arbúsculos, vesículas e esporos 
Micorriza: associação simbiótica entre fungos filamentosos e raízes de plantas 
Segmento de raiz colonizado por Glomusmosseae. 
Raiz clarificada com KOH e corada com azul de tripan para destacar o tecido fúngico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Esporos: Gigaspora margarita (esporos claros/médios), Dentiscutata heterogama 
(esporos marrons/menores) e Gigaspora gigantea (esporos amarelos/maiores). 
 
 
 
 
 
Azigósporo de Scutellospora gregaria 
 
 
 
 
 
 
 
 
Hifa de sustentação Azigósporo de Acaulospora morrowae 
 
 
45 
 
Filo Ascomycota 
 
 
Características gerais 
→ Hifas septadas 
→ Reprodução sexuada: ascósporo 
→ Reprodução assexuada: conídios 
→ Corpos de frutificação: Peritécio, Apotécio, Cleistotécio e Ascostroma 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Peritecio Cleistotécio 
p
o
t
é
c
i
o 
t
i
p
o 
t
a
ç
a 
Peritécio Cleistotécio 
Apotécio tipo taça Apotécio tipo Morel 
(Morchella) 
 
46 
 
Alternaria 
Conidióforos pigmentados, normalmente curtos ou alongados, produzindo em cadeia 
simples ou ramificada de conídios. A forma do conídio é variável, grosseiramente elíptica 
a ovalada. Causa a pinta preta do tomateiro e da batata. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Aspergillus 
Conidióforos longos terminando em projeção tipo clava, lembrando baquetas. Da 
projeção irradiam-se fiálides, dispostas em camada simples ou dupla, das quais se 
projetam cadeias de conídios esféricos. Massa de conídios pode apresentar coloração 
variada. São saprófitas comuns em produtos armazenados. Alguns podem produzir 
toxinas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
47 
 
Cladosporium 
Conidióforos escuros ramificando-se vigorosamente no topo ou acima da porção 
mediana. Forma variável: oval, cilíndrica ou irregular. Causa queima em curcubitáceas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Colletotrichum 
Acérvulos circulares, conidióforo simples. Conídios hialinos, ovais, a oblongos ou 
falcados. Massa de conídios com coloração rósea. Podem estar presentes no acérvulo 
setas longas, septadas e pigmentadas. Causa antracnose em vários hospedeiros 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Curvularia 
Conídios escuros geralmente com três septos transversais, curvos em ângulo. Os 
segmentos internos são normalmente maiores e mais pigmentados que os dois extremos. 
Causa mancha de folha de milho 
 
 
 
 
 
 
 
48 
 
Fusarium 
Conidióforos hialinos de forma variável simples ou ramificados, neste caso curtos e 
irregulares ou terminando em tufos de fiálides. Conidióforos isolados ou reunidos em 
esporodóquio. Macroconídio com vários septos transversais, levemente curvos, 
lembrando uma canoa. Microconídios sem septos e hialinos. As diferentes espécies 
causam diferentes doenças em plantas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nigrospora 
Conidióforos curtos, com septos e inter-septos mais ou menos dilatados, normalmente 
pigmentados. Conídio esférico e negro localizando-se em uma vesícula situada no ápice 
do conidióforo. 
 
 
 
 
 
 
Penicillium 
Conidióforos longos, ramificando-se na parte terminal. Conídios esféricos e catenulados 
produzidos em fiálides dispostas em número variável na ramificação terminal do 
conidióforo (conjunto lembra uma vassoura). Massa de conídios com coloração 
esverdeada. Causa podridão em frutos cítricos. 
 
 
 
 
Pestalotiopsis 
 
49 
 
Conídios com 4 septostransversais, apresentando três secções intermediárias 
pigmentadas e as duas das extremidades, hialinas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
50 
 
Filo Basidiomycota 
 
 
 Características gerais 
 → Hifas septadas 
 → Reprodução sexuada: basidiósporo 
 → Reprodução assexuada: conídios 
 
 
 
 
 
Basidiósporos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
51 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Agaricus bisporus 
(Champignon) 
Lentinula edodes 
(Shiitake) 
Pleurotus ostreatus 
(Shimeji) 
Pleurotus pulmonarius 
(Hiratake marrom) 
Boletus edulis 
(cogumelo silvestre comestível) 
Rubroboletus satanas 
(cogumelo silvestre venenoso) 
 
52 
 
MORFOLOGIA DE COLÔNIAS DE LEVEDURAS 
 
Características macroscópicas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Saccharomyces kluyveri Candida albicans Kluyveromyces lactis Torulaspora delbrueckii 
Arxulaadeninivorans Pichia Pichia 
Saccharomyces cerevisiae 
 
53 
 
Características microscópicas 
 
Reprodução Assexuada: Brotamento 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Reprodução assexuada: fissão 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Formação de pseudomicélio: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
e
p
r
o
d
u
ç
ã
o 
s
e
x
u
a
d
a
: 
a
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c
ó
s
p
o
 
54 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fotomicrografias de células de leveduras (parte inferior): a) células elipsóides de 
Kluyveromyces marxianus (microscopia eletrônica de varredura – MEV); b) Ascósporos de 
Saccharomyces cerevisiae (microscópio ótico, MO, 400x); c) células globosas de S. 
cerevisiae (MEV); d) células globosas de S. cerevisiae em brotamento unipolar (MO, 
400x); e) células globosas de S. cerevisiae em brotamento multipolar (MO 400); f) células 
cilíndricas de Schizosaccharomyces pombe em fissão (contraste de fase, 100 x). Dias & 
Schwan, 2010. 
(Dias & Schwan, 2010) 
 
55 
 
Prática 6 – Isolamento e enumeração de microrganismos 
 
Nos ambientes naturais os microrganismos se encontram, quase sempre, sob 
forma de populações mistas. Assim sendo, para que seja possível estudar as características 
das espécies que compõem estas misturas, é necessário fazer seu isolamento em cultura 
pura. Uma porção representativa da amostra é transferida, com assepsia, para meio de 
cultura sólido (ágar) em placas de Petri. Células microbianas contidas na amostra, 
suficientemente separadas, são imobilizadas no gel de ágar contendo nutrientes e se 
multiplicam, formando um agregado de células idênticas denominado de colônia. 
Cultura pura é aquela em que todos os indivíduos se originaram a partir de uma única 
célula e são mantidas geneticamente idênticas. Quando uma cultura é formada por células 
de uma mesma espécie, porém, não necessariamente geneticamente idênticas, diz-se que 
essa cultura é axênica. Na prática, é muito difícil manter uma cultura pura, por causa das 
mutações que ocorrem numa população elevada de bactérias. Por isso, normalmente uma 
cultura inicialmente pura será, ao final do tempo de crescimento, uma cultura axênica. 
Apesar disso, é comum nos referirmos a essas culturas como sendo puras, pelo fato de 
terem sido obtidas a partir de uma única célula. Os estudos microbiológicos e suas 
aplicações são efetuados com a população dos microrganismos e não com uma única 
célula, sendo somente válidos se realizados com culturas puras. 
Dentre as técnicas conhecidas para isolamento de microrganismos em cultura 
pura, as mais comumente utilizadas são a técnica de esgotamento e a técnica das diluições 
em placas. O isolamento em meio de cultura com ágar baseia-se no princípio de que, 
quando se espalha uma quantidade suficientemente pequena de material, pode-se obter 
células individuais que crescem em colônias completamente separadas umas das outras. 
As técnicas utilizadas são: i- de esgotamento do inóculo (estrias); ii- técnica de semeadura 
por espalhamento (alça de Drigalsky – “Spread Plate”) e, iii- técnica de semeadura em 
profundidade (“pour-plate”). Normalmente, numa população microbiana mista, a 
concentração de microrganismos é bastante elevada, sendo necessário fazer diluições 
sucessivas quando se deseja fazer a contagem em placas e determinar a população viável 
na amostra. Para isso, realizam-se quantas diluições forem necessárias para que cresça na 
placa de Petri um número final de colônias entre 30 e 300, o que facilitará a contagem e 
a estimativa da população microbiana presente. Nesse caso, também, o espalhamento não 
deve ser feito por meio de estrias, mas aplicando-se uma pequena alíquota conhecida 
(normalmente 0,1 mL) sobre a superfície do meio sólido e espalhando-se com alça de 
 
56 
 
Drigalsky (“Spread Plate”). Outra opção é a utilização da técnica “Pour Plate”, na qual 
aplica-se primeiro a alíquota (normalmente 1 mL) e, depois verte-se o meio liquefeito e 
resfriado a 50 oC, fazendo-se movimentos rotatórios até que a suspensão de células fique 
bem distribuída no meio de cultura. O resultado será expresso como UFC (Unidades 
Formadoras de Colônias) por mililitro da amostra. 
Nesta aula prática será realizado o procedimento de isolamento e enumeração de 
microrganismos, por meio do método de diluição em placas. 
 
Objetivos 
1- Realizar diluições seriadas de culturas microbianas ou amostras de solo, para 
plaqueamento e contagem de colônias, expresso em UFC/mL ou g (Unidades Formadoras 
de Colônias por mililitro ou grama) da suspensão ou amostra de solo original; 
2- Executar rotina de plaqueamento. 
 
Materiais 
Meios e culturas: Ágar nutriente fundido, culturas de bactéria ou amostras de solo, 
Equipamentos e utensílios: Placas de Petri estéreis, bico de Bunsen e alças de 
repicagem, pipetas para inoculação, tubos de ensaio com 9 mL de solução salina estéril, 
agitador do tipo vortex para homogeneizar as diluições. 
 
Procedimento 
Contagem de microrganismos pelo método das diluições em placas 
1- A partir da suspensão de cultura bacteriana ou obtida de amostras de solo, realizar 
diluições sucessivas, de 10-1 até 10-6, da seguinte maneira: transferir 1 mL da suspensão 
original para tubo contendo 9 mL de solução salina estéril. Homogeneizar. Essa é a 
diluição 10-1. A partir desse tubo repetir o procedimento para obter os tubos com as 
diluições 10-2, 10-3, e assim sucessivamente até 10-6; 
2- A partir da diluição 10-4, proceder a inoculação de 0,1 mL em placa de Petri contendo 
meio Ágar Nutriente, em triplicata; 
3- Espalhar o inóculo com o auxílio de uma alça de Drigalsky; 
4- Incubar as placas a temperatura ambiente durante 24-48 horas. No caso de se desejar 
o isolamento de microrganismos que cresçam em temperaturas específicas, será 
necessário fazer a incubação em estufas ou incubadoras que permitam o controle da 
temperatura. 
 
57 
 
Esquema do procedimento: 
Fonte: Adaptado de Microbiologia de Brock Michael T. Madigan ... [et al.], 2016. ISBN 978-85-8271-298-6 
 
 
 
 
58 
 
Resultados 
Faça a contagem das colônias obtidas em cada placa, esquematizando os resultados nos 
círculos abaixo, e calcule a população total da amostra expressando a contagem em 
UFC/mL ou (g): 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Grupo Diluição Número de colônias 
População total 
na amostra 
1 
2 
3 
4 
5 
6 
 
 
A ESTIMATIVA DA POPULAÇÃO É DADA PELA FÓRMULA: 
 
𝐔𝐅𝐂/ 𝐦𝐋 𝐨𝐮 𝐠 =
𝐌é𝐝𝐢𝐚 𝐝𝐨 𝐧ú𝐦𝐞𝐫𝐨 𝐝𝐞 𝐜𝐨𝐥ô𝐧𝐢𝐚𝐬 𝐩𝐨𝐫 𝐩𝐥𝐚𝐜𝐚 𝐱 𝐅𝐚𝐭𝐨𝐫 𝐝𝐞 𝐝𝐢𝐥𝐮𝐢çã𝐨
𝐕𝐨𝐥𝐮𝐦𝐞 𝐝𝐚 𝐚𝐥𝐢𝐪𝐮𝐨𝐭𝐚
 
Note que: 
Diluição = alíquota/volume final. Exemplo: alíquota de 1 mL adicionada a um tubo 
contendo 9 mL. Neste caso, o volume final será de 10 mL, portanto, adiluição será 1/10 
= 10-1. 
Fator de diluição = 1/volume da alíquota. Exemplo: alíquota de 0,1 mL, o fator de diluição 
será 1/0,1 = 10. Se a alíquota for de 1 mL, como ocorre, por exemplo na técnica do 
derramamento, o resultado será 1 e, portanto, nada mudará no resultado final. 
 
 
59 
 
Exercícios 
1- Por que os meios sólidos são preferidos para o isolamento dos microrganismos? 
 
 
 
2- Por que, ao realizarmos contagem em placas, consideramos somente aquelas onde 
tenham sido formadas entre 30 e 300 colônias? 
 
 
 
3- Qual é a finalidade das diluições seriadas, efetuadas durante o procedimento de 
enumeração de microrganismos? 
 
 
 
4- Em uma amostra de água contendo 108 cels/mL, qual seria a diluição necessária de 
modo que a estimativa de contagem na placa final seja de 100 colônias? 
 
 
 
5- Com base no esquema abaixo, responda: 
 
a) Qual a diluição em cada etapa (A-F)? 
b) Qual a diluição total em cada uma das etapas (A-F) 
 
 
 
 
 
60 
 
Prática 7 – Obtenção de culturas puras: estrias simples e compostas 
 
Dentre as técnicas conhecidas para isolamento de microrganismos em cultura 
pura, as mais comumente utilizadas são a técnica do esgotamento e a técnica das diluições 
em placas. O isolamento em meio de cultura com ágar baseia-se no princípio de que 
quando se espalha uma quantidade suficientemente pequena de material, pode-se obter 
células individuais que crescem em colônias completamente separadas umas das outras. 
As técnicas utilizadas são a de esgotamento do inóculo (estrias) e a técnica semeadura por 
espalhamento (“Spread Plate”) e semeadura em profundidade (“Pour Plate”). 
Nesta aula prática, será realizado o procedimento para obtenção de cultura pura 
pelo método do esgotamento do inóculo em superfície de ágar, utilizando estrias simples 
ou compostas. 
 
Objetivo: 
Realizar a técnica de isolamento/purificação por estrias simples e compostas de isolados 
obtidos na aula anterior. 
 
Meios de cultivo e culturas: Ágar Nutriente liquefeito; cultura de bactérias em placa e 
meio líquido. 
Equipamentos e utensílios: Placas de Petri com Ágar Nutriente, bico de Bunsen e alças 
de repicagem. 
 
Procedimento: 
1- Esterilize a alça de repicagem e espere esfriar atrás da chama; 
2- Transfira assepticamente a suspensão bacteriana contida na alça de repicagem para a 
superfície do meio de cultura; 
3- Espalhe conforme uma das técnicas: estria simples ou estria composta; 
4- Flambe novamente a alça, deixe-a esfriar no suporte; 
5- Incube as placas em posição invertida, a temperatura ambiente, por 24 horas. Observe 
o crescimento de colônias isoladas. 
 
 
 
 
 
61 
 
 
 
 
 
 
 
62 
 
Resultados 
Esquematize o crescimento obtido na superfície da placa estriada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Exercício 
1 - Indique uma colônia que você selecionaria para o isolamento. Se você não obteve uma 
colônia isolada, sugira as possíveis razões para essa falha e o que faria para corrigi-la. 
 
 
63 
 
Prática 8 – Preparações microscópicas fixadas (coloração de Gram) e 
Antibiograma 
 
Parte 1: Coloração diferencial de Gram 
 
Preparações microscópicas fixadas e coradas são úteis para visualizar os 
microrganismos e diferenciá-los em grupos, para fins de diagnóstico ou de estudos de 
suas propriedades. Existem várias técnicas de preparação, desde as mais simples, como 
as preparações a fresco sem coloração, até as que exigem maiores cuidados na montagem, 
como é o caso das preparações fixadas e coradas. Nas preparações a fresco, em geral, são 
utilizados corantes que não comprometem a vitalidade das células (não tóxicos). O uso 
de compostos orgânicos coloridos ou corantes facilita a observação de células de 
microrganismos. Existem corantes que se ligam a elementos químicos específicos da 
célula microbiana, corantes que fluorescem, que mudam de cor na presença de reações 
químicas e corantes que facilitam a visualização. Em geral, os microbiologistas usam 
preparações coradas para mostrar as diferentes estruturas de microrganismos, para 
identificar suas estruturas internas e para ajudar a identificar microrganismos similares. 
Corante é geralmente um sal, em que um dos íons é um cromóforo. Se o cromóforo é 
positivo, o corante é básico ou catiônico, como por exemplo, o azul de metileno, o cristal 
violeta e a fucsina. Se o cromóforo é negativo, o corante é ácido ou aniônico, como por 
exemplo, o ácido pícrico. Corantes básicos são ideais para corar bactérias, porque os 
ácidos nucléicos e alguns componentes da parede celular apresentam carga negativa e 
atraem os cromóforos catiônicos. Nas técnicas de coloração simples, células microbianas 
são inicialmente espalhadas sobre a lâmina, formando um esfregaço; em seguida, são 
fixadas pelo calor e coradas com um único corante. Essa técnica é útil para visualizar a 
forma (cocos, bacilo ou espirilo) e o arranjo de células bacterianas. Algumas estruturas 
internas das células também podem ser visualizadas, como grânulos metacromáticos 
(polifosfato) e de glicogênio. 
A técnica de coloração diferencial requer o uso de, pelo menos, três reagentes 
químicos, aplicados sequencialmente sobre o esfregaço fixado. O primeiro reagente é um 
corante que confere cor a todas as células; o segundo reagente é um descolorante, que 
pode ou não remover completamente o primeiro corante da célula ou de algumas de suas 
estruturas. As estruturas descoloradas podem adquirir a cor de um segundo corante, 
denominado de corante de contraste. Assim, grupos de células ou suas estruturas podem 
 
64 
 
ser diferenciados, com base no corante que é retido. Técnicas de coloração diferencial 
permitem não só a visualização de estruturas como flagelo, cápsula, esporo e núcleo, mas 
também a separação de microrganismos em grupos. A técnica diferencial mais importante 
em bacteriologia é a coloração de Gram, que separa as bactérias em dois grandes grupos, 
Gram-positivo e Gram-negativo, sendo importante para o diagnóstico e classificação das 
bactérias. A coloração de Gram envolve a aplicação de quatro soluções, conforme 
descrito a seguir. 
Cristal violeta (CV), primeiro corante que cora as células de roxo escuro. 
Lugol ou solução de Iodo (I), é a segunda solução, um mordente que aumenta a 
interação entre a célula bacteriana e o primeiro corante, formando um complexo 
insolúvel, Cristal violeta-Iodo (CV-I). 
Álcool, a terceira solução, é um descolorante. As bactérias Gram positivas, quando 
lavadas com descolorante, retêm o complexo CV-I e as bactérias Gram negativas perdem 
o complexo CV-I, ficando incolores. A ação do álcool com removedor do complexo CV-
I da célula depende da concentração de lipídeos e da espessura da parede celular 
bacteriana. 
O último reagente é o corante de contraste, Safranina ou Fucsina, diferente da cor do 
cristal-violeta, corando as bactérias Gram-negativas de rosa-avermelhado, mas não altera 
a cor roxo-escura (azulada) das bactérias Gram-positivas. 
 
Objetivos 
1- Realizar a técnica de coloração diferencial de Gram e porterior visualização em 
microscópico; 
2- Diferenciar bactérias de acordo com sua a forma e arranjo predominante, além da 
resposta a coloração de Gram. 
 
Materiais 
Microrganismos: Cultura de bactérias em meio líquido ou sólido. 
Meios e Soluções: Fucsina ou safranina, cristal violeta, água destilada. 
Equipamentos e utensílios: Microscópio ótico, lâminas, alça de repicagem, bico de 
Bunsen, bandejas e suportes para lâminas. 
 
 
 
65 
 
Procedimento 
1- Limpe bem uma lâmina com papel toalha ou higiênico. Nunca passe sobre a chama. 
Deixe-a sobre um papel na bancada. 
2- Esterilize a alça de repicagem, aquecendo-a ao rubro no bico de Bunsen e espere 
esfriar; 
3- Quando a bactéria estiver em meio líquido, transfira assepticamente com a alça de 
repicagem uma gota da cultura de bactérias para o centro da lâmina.Se a cultura estiver 
em meio sólido, prepare uma suspensão de células da seguinte maneira: Coloque uma 
gota de água destilada sobre a lâmina e colete o material assepticamente, raspando, 
levemente a superfície do ágar com a alça de repicagem (com cuidado para não retirar 
pedaços do meio de cultura, pois o crescimento do microrganismo ocorre somente na 
superfície); 
4- Prepare o esfregaço, espalhando a suspensão com a alça de repicagem; 
5- Deixe o esfregaço secar ao ar. Nunca passe a lâmina ainda úmida sobre o fogo do bico 
de Bunsen. 
6- Fixe o esfregaço três vezes, passando o lado oposto ao esfregaço acima da chama do 
bico de Bunsen. Evite o aquecimento excessivo, para não queimar e distorcer as células; 
7- Deixe a lâmina esfriar; 
8- Inicie a coloração de Gram. 
Respeite o tempo indicado para cada reagente! 
9- Cubra o esfregaço com Cristal Violeta, deixando em repouso por 1 minuto; em seguida, 
utilizando a piseta, lave com água destilada, gotejando sempre acima do esfregaço e não 
diretamente sobre o mesmo; 
10- Cubra com solução de Lugol, por um minuto. Lave a preparação, utilizando a piseta 
com água destilada (evite jato de água sobre o esfregaço, para não o desprender); 
11- Lave a lâmina com etanol 95 %, rapidamente, até que não se desprenda mais corante 
da preparação; 
12- Lave o excesso de álcool com água; 
13- Cubra o esfregaço com solução de Fucsina, durante 30 segundos; 
14- Lave a lâmina com água. Em seguida deixe secar ao ar. 
15- Manuseie corretamente o microscópio ótico (se você tem dúvida quanto a utilização 
do equipamento, pergunte ao professor como usá-lo). 
Focalize o material corado, sequencialmente, com as objetivas de 4X, 10X e 40X; 
 
66 
 
16- Trave o microscópio; adicione uma gota de imersão sobre o esfregaço e visualize com 
a objetiva de 100X, usando o micrométrico. 
17- Terminada a observação, desligue a luz, gire o revólver para encaixar a objetiva de 
menor aumento, passando pela objetiva de 10X; abaixe a platina e retire a lâmina. 
18- Após a observação, descarte a lâmina e a lamínula nas bandejas com detergente e 
desinfetante, colocadas na bancada lateral. 
 
Preparo de lâminas (esfregaço) 
 
 
 
 
 
 
67 
 
Coloração diferencial de Gram 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
68 
 
Resultados 
Desenhe os campos observados, fazendo distinção entre a forma e o arranjo das bactérias. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Bactéria Gram Forma Arranjo 
predominante 
1 
2 
3 
 
 
 
69 
 
Exercícios 
1- Qual é o propósito da fixação do esfregaço pelo calor? 
 
 
 
 
2- Cite vantagens e desvantagens da preparação microscópica fixadas e coradas. 
 
 
 
 
3- Por que os corantes básicos são ideais para corar bactérias? 
 
 
 
 
4- Por que a coloração de Gram é importante em microbiologia? 
 
 
 
 
5- Qual é a importância da solução de Lugol (iodo) na coloração de Gram? 
 
 
 
 
6- Qual a função do álcool na técnica de coloração de Gram? 
 
 
 
 
 
70 
 
Parte 2: Antibiograma 
 
Os antibióticos são metabólitos produzidos por microrganismos, que mesmo em 
baixas concentrações, exibem capacidade de ocasionar morte ou inibição do crescimento 
de outros microrganismos. De modo geral, fungos e actinobactérias (além de outras 
bactérias) são considerados os principais produtores de antibióticos, porém, ampla faixa 
desses compostos pode também ser sintetizados quimicamente e alterados em 
laboratórios farmacêuticos a fim de se evitar resistências e/ou diminuir efeitos colaterais. 
O primeiro antibiótico identificado foi a penicilina. Alexander Fleming, médico 
microbiologista conduzia pesquisas sobre substâncias capazes de matar ou impedir o 
crescimento de bactérias nas feridas infectadas de combatentes da Primeira Guerra 
Mundial (1914 – 1918), que morriam em consequência dessas infecções. Em 1928 
Fleming descobriu a penicilina ao observar halos de inibição de crescimento em culturas 
de estafilococos contaminadas por fungos, o que parecia indicar que aquele fungo 
produzia uma substância bactericida. O fungo foi posteriormente identificado como 
Penicillium, dando origem ao nome penicilina, para a substância por ele produzida. A 
aplicação da penicilina em larga escala ocorreu apenas na década de 1940, principalmente 
em decorrência da Segunda Guerra Mundial, onde acredita-se ter salvo milhares de vidas. 
Para utilização clínica dos antibióticos é preciso considerar algumas variáveis, 
como seletividade, dosagem, efeitos na microbiota intestinal, entre outros. A 
determinação laboratorial da seletividade ou resistência de uma dada bactéria a um ou 
vários antibióticos é realizada por meio do ensaio chamado antibiograma. O 
antibiograma pode ser realizado de duas maneiras: por diluição seriada do antibiótico 
em tubos ou placas ou pelo método de difusão em meio sólido, também conhecido como 
método de Kirby-Bauer. Por conta da praticidade, este último método é o mais utilizado. 
Utiliza-se discos de papel de filtro impregnados com doses conhecidas do antibiótico a 
ser testado, que são colocados em contato com a cultura bacteriana de interesse, na 
superfície do meio. A placa é incubada nas condições específicas de crescimento da 
bactéria e a susceptibilidade ou resistência ao antibiótico é avaliada por meio da aferição 
do diâmetro de halos de inibição em torno dos discos. 
 
 
71 
 
Objetivos 
1- Demonstrar a atividade antimicrobiana de alguns antibióticos; 
2- Realizar o teste de antibiograma pelo método de difusão em meio sólido (método de 
Kirby-Bauer), para determinar a sensibilidade de bactérias a alguns antibióticos. 
 
Materiais 
Meios e culturas: Placas de Petri contendo ágar nutriente; culturas de bactérias obtidas 
na aula anterior. 
Reagentes: discos de papel de filtro contendo diferentes antibióticos. 
 
Procedimento 
1- Transfira, assepticamente, 0,1 mL da suspensão de células para as placas contendo 
meio sólido. Espalhe a alíquota uniformemente sobre o meio de cultura, com o auxílio da 
alça de Drigalsky, previamente flambada com álcool. 
2- Transfira, de forma asséptica, os discos de papel contendo os antibióticos para a 
superfície do meio de cultura previamente inoculado com a bactéria. Utilize uma pinça 
previamente flambada para realizar esse procedimento. 
3- Incube as placas a 37 oC, por 16 a 18 h. 
4- Observe o crescimento da bactéria nas placas, identificando os halos de inibição em 
torno do disco de papel. Com o auxílio de uma régua, registre o diâmetro (mm) dos halos 
no quadro disponível nos Resultados. 
5- Compare os resultados obtidos com o quadro de referência abaixo (Quadro 1), e avalie 
se a bactéria é sensível ou resistente a cada um dos antibióticos testados. 
 
Quadro 1 – Avaliação do diâmetro de halo de inibição de diferentes antibióticos 
Antibiótico 
Concentração 
no disco (µg) 
Diâmetro do halo de inibição (mm) 
Resistente 
< ou = 
Faixa 
intermediária 
Sensível 
> ou = 
Ampicilina 10 11 12-13 14 
Canamicina 30 13 14-17 18 
Cloranfenicol 30 12 13-17 18 
Estreptomicina 10 11 12-14 15 
Gentamicina 10 12 13-14 15 
Ácido 
Nalidíxico 
30 13 14-18 19 
 
 
 
72 
 
Resultados 
Esquematize o crescimento obtido na superfície da placa. Indique os discos de 
antibióticos e as zonas de inibição se foram observadas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Exercício 
1- Existem diferenças do modo de ação dos antibióticos contra bactérias Gram positivas 
e Gram negativas? 
 
 
 
 
2- Quais os principais mecanismos de ação dos antibióticos sobre as células microbianas 
e como isso influencia no espectro de ação? 
 
 
 
 
3- Cite os principais microrganismos produtores de antibióticos. Dê exemplos de alguns 
gêneros. 
 
 
73 
 
Prática 9 – Metabolismo microbiano: fermentação alcoólica 
 
Metabolismo pode ser definido como o conjunto de todas as reações químicas 
que ocorrem