6 TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS DE REAGENTES MARCADOS (IMUNOFLUORESCÊNCIA, RADIOIMUNOENSAIO, IMUNOENZIMÁTICOS)

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20/04/2021 UNIP - Universidade Paulista : DisciplinaOnline - Sistemas de conteúdo online para Alunos.
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Testes utilizados em Imunologia Clínica – Testes de Reagentes Marcados 
 
Características
Alta sensibilidade
Boa especificidade
Direta – detecção de Antígeno
Indireta – detecção de Anticorpo
Competição – amostra compete com reagente marcado
Custo mais alto – produção dos reagentes
Permitem automação completa ou não
Permite detectar anticorpo de uma classe específica que sejam específicos para
um eterminado antigeno
Reagente marcado – antígeno ou anticorpo
Sistema heterogêneo – lavagem – retira reagente não ligado
Reagente marcado
Marcação não modifica interação Ag-Ac.
Alto custo.
Permite detecção de classes específicas de anticorpo para um determinado
antígeno.
Tipo de marcador determina nome do teste.
Marcador
Radioisótopo = RADIOIMUNOENSAIO.
Fluorocromo = IMUNOFLUORESCÊNCIA.
Enzima = ELISA, IMUNO-DOT, WESTERN BLOT
Radioimunoensaio
Primeira técnica com reagente marcado.
Desenvolvido em 1956 – detecção de Ac anti-insulina em pacientes tratados
com o hormônio.
 Radioisótopos - I125 ou I131 – ligação a resíduos de tirosina em proteínas.
Vantagens: quantitativo, rapidez, precisão, limiar de detecção em nano ou
picogramas.
Desvantagens: alto custo do teste, vida média dos reagentes e risco operacional
– radiosótopos.
Uso: antígeno e anticorpo, marcadores tumorais, hormônios. 
Princípio
quantidade de reagente marcado (radioativo) quantifica o Ag ou Ac não
marcado presente na amostra através de ligação específica.
medida da resposta - contagem radioativa - tipo de radiação emitida.
Realizado em 3 estágios 
Estágio 1 – construção da curva de calibração – diluição seriada do padrão 
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Estágio 2 – interpolação dos resultados 
Estágio 3 – controle de qualidade (amostras com [ ] conhecida) 
Imunofluorescência 
Princípio
?Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem
covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o
antígeno. 
Fluorocromos 
são substâncias que, absorvem luz de um comprimento de onda menor quando
excitados com luz UV, emitem luz em comprimento de onda maior
(fluorescência). 
características: estabilidade, grande capacidade de absorção, absorção e
fluorescência de luz no espectro visível, nenhuma interferência com a reação
imunológica.
desvantagens: custo do equipamento, sensibilidade limitada.
dificuldade de automação.
vantagens: específica e reprodutível. 
Tipos: direta, indireta e citometria de fluxo.
Cuidados:
Padronização adequada do conjugado fluorescente (titulação).
Treinamento do pessoal que realizará a leitura, sendo subjetiva, deve ser
padronizada para evitar erros que super ou subestimem a fluorescência.
Ragentes necessários: 
Ac marcados – alta especificidade – poli ou monoclonais.
Antígeno ou amostras fixas em lâmina de vidro.
Glicerina alcalina – pH 8,5 – montagem da com lamínulas – melhoram a
intensidade da emissão de fluorescência.
 Azul de Evans ou vermelho Congo – corantes de fundo – melhoram a
visualização da fluorescência.
Lâmina de sílica não fluorescente e de espessura mínima.
São fatores que interferem na imunofluorescência:
a qualidade do vidro/lâmina/lamínula.
qualidade e tratamento dos Ag fixados antigenicidade e acessibilidade.
temperaturas e tempo de incubação.
lavagens adequadas.
montagem da preparação em glicerina alcalina.
microscópio perfeitamente calibrado e limpo.
corantes: diminuem a coloração de fundo, facilitando a leitura da
fluorescência (azul de Evans). 
Microscópio
fonte de luz de alta intensidade
lâmpada de mercúrio ou halogênio
filtros de excitação (ativam a fluorescência)
filtros de barreira (remover interferentes) 
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microscópios de transiluminação
microscópios de epiiluiminação (apresentam a vantagem de combinar a luz
transmitida para exame de contraste de fase, análise da amostra em diferentes
comprimentos de onda, no caso de utilização de mais de um fluorocromo) (a luz
UV não tem chance de atravessar a ocular) ?
Reações de Imunofluorescência
Reação de Imunofluorescência direta.
Reação de Imunofluorescência indireta.
Reação de Imunofluorescência de captura.
Reação de Imunofluorescência amplificada com complemento.
Reação de Imunofluorescência amplificada com sistema avidina-biotina
Imunofluorescência Direta
Conjugado - Ac marcado com fluorocromo.
Vantagens: alta sensibilidade e especificidade, possibilidade de localizar
componentes intracelulares com fluorocromos contrastantes.
Desvantagens: um conjugado para cada antígeno.
Uso: imunohistoquímica – doenças renais e de pele.
Imunofluorescência Indireta
Conjugado Ac antiimunoglobulina específico para as diferentes classes de
anticorpos.
Diluições seriadas – título de Ac – máxima diluição onde há fluorescência.
Vantagens: sensível, específica, reprodutível , fácil, padronizada, mesmo
conjugado determina Ac produzidos em diferentes doenças.
Desvantagens: custo do microscópio, subjetividade na leitura e dificuldade de
automação.
Técnicas Imunoenzimáticas - Enzimaimunoensaio
Anticorpos ou antígenos marcados com enzimas – conjugado.
Enzima
elevada especificidade.
fácil de ser obtida na forma purificada.
conjugação a antígenos e anticorpos – sem interferências.
produto de reação com substrato – fácil de ser quantificado, mesmo com
pequenas quantidades de enzima.
estável.
custo acessível.
diferentes tipos – fosfatase alcalina, peroxidase.
determina o tipo de substrato.
enzimas Peroxidase e Fosfatase Alcalina
Substrato Cromogênico
ao serem consumidos por enzimas geram produtos coloridos solúveis ou
insolúveis.
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quantificação do produto – espectrofotômetro, cor visual ou comparação com
padrão.
depende do tipo da enzima utilizada.
Substrato Fluorigênicos
emitem luz fluorescente após serem consumidos pela enzima.
quantificação da luz emitida pelo produto – fluorômetro.
Substrato Quimiluminescente
amplificação de sinal - hormônios e marcadores tumorais.
emitem brilho após serem consumidos pela enzima.
quantificação do brilho emitido pelo produto – luminômetro.
Ensaio heterogêneo - etapa de lavagem – retira reagente marcado não ligado a fase
sólida
Fase sólida
conhecido como suporte.
tubos, microplacas, micropartículas ou tiras.
partículas de agarose, poliacrilamida, dextran, poliestireno.
micropartículas – lavagem – decantação, centrifugação, adsorção em fibra de
vidro ou captura.
tipos: ELISA, dot – ELISA, IMUNNOBLOT
Western Blotting (WB)
identificação de proteínas reconhecidas pelo anticorpo.
separação das proteínas – peso molecular (massa nolecular) - eletroforese em
gel de poliacrilamida.
transferência eletroforética - nitrocelulose.
incubação com amostras - presença de anticorpos específicos - complexo
formado – conjugado.
visualização = cromógeno - precipitado colorido.
teste confirmatório/específico.
 
Sugestão: Estudar pelo livro:
"Diagnóstico laboratorial das Principais Doenças Infecciosas e Auto-Imunes" autores
Antonio Walter Ferreira e Sandra Ávila. Ed Guanabara Koogan, 2001.
"Diagnóstico laboratorial das Principais Doenças Infecciosas e Auto-Imunes" autores
Antonio Walter Ferreira e Sandra Ávila. Ed Guanabara Koogan, 2013.
 
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Exercício 1:
Os testes imunológicos para a pesquisa de antígenos ou anticorpos podem ser
divididos em testes com reagentes não marcados (precipitação e aglutinação) e
reagentes marcados (imunofluorescência,radioimunoensaio e imunoenzimáticos).
De acordo com as características de cada técnica:
A)
Os testes de imunofluorescência são os únicos que permitem total automação.
 
B)
Os testes de radioimunoensaio por utilizarem radioisótopos como marcadores não
apresentam risco ao operador (técnico).
 
C)
Os testes ELISA (enzimáticos) para a pesquisa de anticorpos podem ser empregados
em vários sistemas como por exemplo no diagnóstico do HIV e rubéola.
 
D)
Os testes ELISA não podem ser automatizados por perderem a sensibilidade.
 
E)
Os testes ELISA e de imunofluorescência apresentam baixa sensibilidade e
especificidade e não são empregados na rotina laboratorial. 
Comentários:
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Exercício 2:
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Para a investigação de HIV testes como ELISA e Western blotting podem ser
empregados. De acordo com a característica do teste, o que é correto afirmar?
A)
O teste de Western blotting é usada para a triagem de pacientes com suspeita de
HIV.
B)
Na técnica de Western blotting as proteínas são separadas pelo peso molecular
devido a adição do detergente aniônico (SDS). A eletroforese é realizada em gel de
poliacrilamida.
C)
Os testes ELISA e Western blotting apresentam baixa sensibilidade e especificidade.
D)
O teste de Western Blotting não é considerada uma técnica específica.
E)
O resultado reagente no testes de Western blotting deve ser confirmado pelo teste
ELISA.
Comentários:
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Exercício 3:
Para os testes imunoenzimáticos do tipo ELISA a reação é revelada 
A)
pela adição de um substrato cromogênico solúvel, estável e colorido.
B)
pela adição de um substrato cromogênico insolúvel, precipita quando é consumido
pela enzima.
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C)
solúvel e fluorescente para melhor identificação do imunocomplexo.
D)
insolúvel para determinar a fase da doença junto com o conjugado.
E)
insolúvel e específico para não interferir na reação antígeno-anticorpo.
Comentários:
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Exercício 4:
A técnica de Imunofluorescência é definida como uma técnica que possibilita a
visualização de antígenos nos tecidos ou em suspensões celulares, por meio da
utilização de anticorpos específicos, e também podem pesquisar anticorpos.
Utilizam marcadores com fluorocromo, capazes de absorverem a luz ultra-violeta
(UV), emitindo-a num determinado comprimento de onda, permitindo sua
observação ao microscópio de fluorescência (com luz UV). Dentre os fluorocromos
mais comumente utilizados estão: Fluresceína (FITC) e Rodamina (TRICT). No caso
do teste de Imunofluorescência Direta, considere as sentenças abaixo
I. Pesquisa de antígenos e são testes sensíveis e específico.
II. Pesquisa de anticorpos e apresentam baixa sensibilidade e alta especificidade.
III. Apresentam marcadores específicos, fluorocromos, mas as técnicas não são
automatizadas.
É correto apenas o que se afirma em
A)
I.
B)
II.
C)
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III.
D)
I e II.
E)
I e III.
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Exercício 5:
Na técnica de Imunofluorescência Indireta, conhecida como técnica de dupla camada, é empregada na detecção de
anticorpos no soro do paciente. Esta técnica tem como vantagem possibilitar uma fluorescência mais evidente, uma vez
que os anticorpos fluorescentes associam-se somente aos anticorpos primários, além de permite trabalhar com
diversos anticorpos primários específicos para distintos tipos de antígenos, sendo capaz de identificar qual a classe a
qual o anticorpo pertence. Sobre essa técnica o que é correto afirmar?
 
A)
Por meio de antígenos fixados em uma lâmina, na qual se aplica a amostra (soro) o imunocomplexo é revelado pela adição
de um anti-anticorpo fluorescente que determina também a fase da doença (IgM ou IgG).
B)
Por meio de antígenos fixados em uma lâmina, na qual se aplica a amostra (soro) o imunocomplexo é revelado pela adição
de um anti-anticorpo marcado com uma enzima revelado pelo substardo que determina também a fase da doença (IgM ou IgG).
C)
Por meio de antígenos fixados em uma lâmina determina o funcionamento da técnica (controle interno).
D)
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Por meio de antígenos fixados em uma lâmina interage com o antígeno da amostra e determina a
fase da doença.
E)
Por meio de anticorpos fixados em uma lâmina, na qual se aplica a amostra (soro) o imunocomplexo é revelado pela adição
de um anti-anticorpo fluorescente que determina também a fase da doença (IgM ou IgG).
Comentários:
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Exercício 6:
A Quimioluminescência é um tipo de reação química, que ao se processar gera
energia luminosa. Durante uma reação química, os reagentes se transformam em
estados intermediários eletronicamente excitados, e ao passarem para um estado de
menos excitado, liberam a energia absorvida na forma de luz.O composto químico
Luminol, é um dos representantes mais conhecidos da quimioluminescência. Nos
laboratórios de análises clínicas os hormônios, drogas e microorganismos podem ser
identificados por testes colorimétricos. Nesses métodos utilizam-se de anticorpos
ligados a um marcador luminescente (cromógeno) que pode ser o próprio luminol ou
mais modernamente derivados de acridina, sistema avidina-biotina. A fluoresceína,
também, é largamente utilizada na determinação de bromo e iodo, formando os
compostos: eosina (coloração rosa) e eritrosina (coloração rosa-arroxeado),
respectivamente. Sobre o teste ELISA (Enzyme Linked ImmunonoSorbentAssay)
indireto é correto afirmar:
 
A)
é um teste sensível para a pesquisa de anticorpos com revelação da enzima e
substrato.
B)
é um teste sensível e específico com a revelação da enzima com o substrato
luminescente.
C)
é um teste sensível e aplica-se a pesquisa de anticorpos.
D)
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são testes de baixa especificidade pouco usados em bancos de sangue. 
E)
são testes recomendados para a pesquisa de antígeno e anticorpos.
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