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PRINCIPAIS TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS REAGENTES MARCADOS: são testes que depende da emissão de um sinal para o resultado - Imunoensaios enzimáticos: o sinal é a mudança de cor. EX: ELISA, quimioluminescência, imunoblot e imunocromatografia. - Imunoensaios radiativos: o sinal é a emissão de radiação. EX: radioimunoensaio. - Imunoensaios fluorescentes: o sinal é fluorescência REAGENTES NÃO MARCADOS: são testes que não depende da emissão de um sinal para o resultado. - Reação de aglutinação/ hemaglutinação - Reação de precipitação - TIPOS DE TESTES IMUNOLÓGICOS NÃO COMPETITIVOS: o resultado é proporcional ao sinal emitido ● DIRETOS: detectam ou dosam o antígeno, ou seja detecta a doença diretamente ● INDIRETOS: detectam ou dosam imunoglobulinas, ou seja, detecta a doença indiretamente ● CAPTURA: detectam ou dosam IgM. São parecidos com os indiretos mas são mais específicos. COMPETITIVOS: o resultado é inversamente proporcional ao sinal emitido QUALITATIVO: respondem apenas se a amostra é positiva (reagente) ou negativa QUANTITATIVOS: faz dosagem OBS: um teste pode ser qualitativo e quantitativo ao mesmo tempo. IMUNOENSAIOS ENZIMÁTICOS ELISA: (Ensaio imunoadsorvente ligada a enzima) O princípio básico baseia-se na utilização de um dos componentes (antígeno ou anticorpo) em fase sólida e na utilização de um reagente conjugado (também pode ser um anticorpo ou antígeno, ligado a uma enzima). É um tipo de reação com reagentes marcados e o tipo de sinal emitido é a mudança de cor, que é identificada pelo espectrofotômetro. Passo a passo: ● DIRETA: a placa vem com anticorpos adsorvidos 1) Colocar o soro do paciente na placa e incubar por um tempo (determinado pelo fabricante). - Os antígenos do paciente vão se ligar aos anticorpos da placa. 2) Lavar a solução para tirar o que não for específico, colocar o reagente marcado (enzima), incubar e lavar novamente. - O reagente vai interagir com o Ag. e se juntar a ele formando então, um “sanduíche”(anticorpo - antígeno - reagente). 3) Adicionar o substrato que irá interagir e ser catalisada gerando um sinal (luz). ● INDIRETA: a placa vem com antígenos adsorvidos 1) Colocar o soro do paciente na placa e incubar por um tempo (determinado pelo fabricante). - Os anticorpos do paciente vão se ligar aos antígenos da placa. 2) Lavar a solução para tirar o que não for específico, colocar o reagente marcado (anticorpo), incubar e lavar novamente. - O reagente vai interagir com o Ac. e se juntar a ele. 3) Adicionar o substrato que irá interagir e ser catalisada gerando um sinal (luz). QUIMIOLUMINESCÊNCIA: É um tipo de teste completamente automatizado, o que ajuda a evitar erros. Na maioria das vezes é feito de maneira não competitiva direta ou indireta, porém existem variações para que seja feito como de captura ou competitivo. É quantitativo e qualitativo. É um teste muito semelhante ao ELISA e as aplicações são basicamente as mesmas, porém no caso da quimioluminescência o sinal emitido é a emissão de luz, e não a mudança de cor. IMMUNOBLOT (IMMUNOBLOTTING): Também conhecido como WESTEN BLOTTING, mesmo que esse termo não se refira a todas as etapas do teste. Etapas: ● ELETROFORESE DE PROTEÍNAS; é uma eletroforese, feita no gel de poliacrilamida, para separar as proteínas. ● ELETROTRANSFERÊNCIA: as proteínas são transferidas para uma membrana de nitrocelulose. - Coloca-se a membrana em contato com o gel, juntamente com +/- 5 folhas de papel-filtro, formando um sanduíche. - Coloca esse “sanduíche” no equipamento que faz com que as proteínas corram para o polo positivo, ficando presas na membrana. ● IMUNOBLOT (ensaio imunoenzimático): geralmente essa é a única parte feita pelo próprio laboratório, que compra a membrana prona do fabricante. - Coloca o soro do paciente junto a membrana com as proteínas, e adiciona um substrato (anticorpo ou antígeno, depende do analito) marcado por uma enzima. - Caso o soro do paciente contenha o antígeno ou anticorpo pesquisado, ele irá reagir com o substrato marcado mudando de cor (sinal). OBS: para o teste ser considerado válido os controles (positivo e negativo) precisam estar adequados. É considerado como o padrão ouro para diagnóstico de HIV. IMUNOCROMATOGRAFIA: Também conhecido como teste rápido, é um tipo de teste que dispensa reagentes adicionais e equipamentos. É muito usado para triagem, em emergências e locais sem estruturas laboratoriais. O sistema é realizado em uma membrana de nitrocelulose e pode ser empregado um corante insolúvel como revelador dá interação antígeno-anticorpo. Como ocorre: ● Se o analito é um antígeno: existe um anticorpo monoclonal fixado na membrana de nitrocelulose - A amostra é aplicada e o antígeno do paciente vai se ligar ao anticorpo da membrana. - Um anticorpo marcado com corante se liga ao antígeno formando um imunocomplexo, que é revelado pelo acúmulo desse corante na linha de captura do teste. ● Se o analito é um anticorpo: existe um antígeno fixado na membrana de nitrocelulose. - A amostra é aplicada e o anticorpo do paciente vai se ligar ao antígeno da membrana. - Um anticorpo marcado com corante se liga formando um imunocomplexo, que é revelado pelo acúmulo desse corante na linha de captura do teste. Assim como outros testes, possui um controle que sempre deve aparecer, independente do resultado do teste, para que ele seja considerado válido. IMUNOENSAIOS RADIOATIVOS RADIOIMUNOENSAIO (RIA): Radioimunoensaio é um termo usado mais quando o analito é um antígeno e tem um antígeno marcado. Quando é um anticorpo é chamado de IMUNORRADIOMÉTRICO (IRMA). Existem várias vantagens para o uso do método, como a alta sensibilidade e especificidade, além dá alta afinidade, baixo custo e rapidez. Porém por utilizar radioatividade, a instabilidade dos radioisótopos causa algumas desvantagens, como riscos operacionais, custo elevado em materiais de biossegurança e problemas de descarte. O princípio do teste é a competição entre a substância a ser detectada (antígeno ou anticorpo do paciente) e a mesma substância marcada radioisotopicamente por um receptor comum. Como ocorre: ● Quando o analito é um antígeno: existe um anticorpo preso a placa - Coloca-se o soro do paciente e o antígeno marcado na placa, incuba e lava. - Se o paciente tiver antígenos, eles irão competir com o Ag. marcado para interagir com o anticorpo da placa. Nesse caso, a radioatividade diminui pois nem todos os Ag. marcados se prendem ao Ac. e são lavados. ● Quando o analito é um anticorpo: existe um antígeno preso a placa - Coloca-se o soro do paciente e o anticorpo marcado na placa, incuba e lava. - Se o paciente tiver anticorpos, eles irão competir com o Ac. marcado para interagir com o antígeno dá placa. Assim, a radioatividade diminui pois nem todos os Ac. marcados se prendem ao Ag. e são lavados. ATENÇÃO: quanto MENOR a leitura (radioatividade), MAIOR a concentração do paciente e vice-versa. IMUNOENSAIOS FLUORESCENTES IMUNOFLUORESCÊNCIA: Teste usado principalmente para detectar antígenos/marcadores em tecidos (biópsia). O princípio da técnica é a utilização de antígenos ou anticorpos conjugados a uma substância que, quando excitada pela radiação UV, emite luz. Dessa forma, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um antígeno e vice-versa. Como ocorre: ● IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA: identifica um antígeno - A amostra do paciente é fixada na lâmina; - Colocar um anticorpo marcado com fluorescência que vai detectar o antígenodo paciente. Incuba e lava. - Analisar a lâmina no microscópio de luz UV (microscópio de fluorescência). OBS: se quiser descobrir a localização do antígeno basta usar um corante inespecífico. ● IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA: identifica um anticorpo. Amostra: soro - A amostra do paciente deve ser colocada na lâmina que já possui um antígeno. Incuba e lava. - Adicionar um conjugado (anticorpo + fluorocromo) que vai reconhecer o anticorpo do paciente. Incuba e lava. - Analisar a lâmina no microscópio de luz UV (microscópio de fluorescência) - Usada para o diagnóstico de várias doenças infecciosas. CITOMETRIA DE FLUXO: Trabalha com células em suspensão (movimento), então as amostras são limitadas. O princípio consiste na utilização de anticorpos monoclonais conjugados a fluorocromo. Podem ser usadas diferentes combinações diferentes de fluorocromo para identificar a célula. Como é feito: ● Faz a marcação das células em suspensão (pode marcar o núcleo, citoplasma…) ● Leva a amostra para o citômetro de fluxo, ele puxa a amostra por um dispositivo capilar - Cada célula que passa solta um tipo de fluorescência que é reconhecida e passada para o computador ● O computador gera um gráfico com os resultados para que eles possam ser interpretados. O citômetro pode ser programado para separar células específicas em tubos diferentes para testes mais complexos. Ele pode medir diversos parâmetros a partir de detectores específicos, são eles: ● FSC e SSC: detectam tamanhos e grânulos (analisa a complexidade do citoplasma) ● FL1, FL2, FL3…: são os filtros/canais, detectam as fluorescências. Os gráficos gerados podem ser de dois tipos, vai depender do objetivo do exame: ● HISTOGRAMA: detecta uma única fluorescência ● DOTPLOT: detecta uma fluorescência em relação a outra. - Determina um limite entre as células que realmente estão emitindo fluorescência e das que estão emitindo uma fluorescência inespecífica. IMUNOHISTOQUÍMICA (teste enzimático): O imunoensaio enzimático é muito parecido com a imunofluorescência, a principal diferença é o marcador, que é uma enzima e não um fluorocromo. Usado principalmente para a detecção de amostras (marcadores/antígenos) em tecidos. É muito usado para a detecção de marcadores tumorais. Segue os mesmos passos da imunofluorescência, porém ao final é necessário colocar um substrato, que faz com que o tecido fique marrom. REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO E HEMAGLUTINAÇÃO (Testes com reagentes não marcados) A técnica é caracterizada pela formação de agregados visíveis (aglutinados) como resultado dá interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que possuem determinantes antigênicos. Pode ser utilizado para o diagnóstico de doenças infecciosas e autoimunes, detecção de hormônios e drogas, e para tipagem sanguínea. ● AGLUTINAÇÃO EM LÁTEX: pode ser direto (buscando antígeno) ou indireto (buscando anticorpo) - Pesquisa o fator reumatóide (presente em inflamações), antígeno de bactéria, drogas, hormônios, anticorpos contra infecções, proteína C reativa, Ac. anti-nucleares (processos autoimunes). ● HEMAGLUTINAÇÃO: pesquisa de moléculas solúveis ou na superfície. Sempre são necessárias hemácias para esses testes, podendo ser do paciente ou nao, depende do motivo e do tipo do teste. - DIRETA: detecta anticorpos que funcionam como. antígenos. ● Adicionar o soro (com imunoglobulinas) a amostra do paciente. Se for positivo as hemácias se juntam formando um aglutinado. ● Usado por exemplo no diagnóstico de doenças autoimunes e na doença hemolítica do recém-nascido. - INDIRETA: detecta anticorpo. ● Adiciona o soro de coombs a amostra do paciente. Se for positivo as hemácias se juntam formando um aglutinado. ● Usado por exemplo em processos de hemotransfusão. OBS: o controle positivo precisa aglutinar e o negativo não pode aglutinar para o teste ser considerado válido. REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO (Testes com reagentes não marcados) É um teste em que são usados anticorpos e antígenos solúveis. O resultado positivo é indicado pela formação de um precipitado visível quando as duas soluções (amostra e reagente NÃO marcado) se encontram e reagem. É preciso ter atenção pois a formação do precipitado pode ser inibida pelo excesso de anticorpo, gerando o efeito prozona, ou pelo excesso de antígeno, gerando o efeito prozona. Para evitar que isso ocorra é preciso fazer a diluição seriada da amostra.
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