Ensaios imunológicos

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PRINCIPAIS TÉCNICAS 
IMUNOLÓGICAS 
REAGENTES MARCADOS: são testes que 
depende da emissão de um sinal para o 
resultado 
- Imunoensaios enzimáticos: o sinal é a 
mudança de cor. EX: ELISA, 
quimioluminescência, imunoblot e 
imunocromatografia. 
- Imunoensaios radiativos: o sinal é a 
emissão de radiação. EX: 
radioimunoensaio. 
- Imunoensaios fluorescentes: o sinal é 
fluorescência 
REAGENTES NÃO MARCADOS: são testes 
que não depende da emissão de um sinal para 
o resultado. 
- Reação de aglutinação/ 
hemaglutinação 
- Reação de precipitação 
- 
TIPOS DE TESTES 
IMUNOLÓGICOS 
NÃO COMPETITIVOS: o resultado é 
proporcional ao sinal emitido 
● DIRETOS: detectam ou dosam o 
antígeno, ou seja detecta a doença 
diretamente 
● INDIRETOS: detectam ou dosam 
imunoglobulinas, ou seja, detecta a 
doença indiretamente 
● CAPTURA: detectam ou dosam IgM. 
São parecidos com os indiretos mas 
são mais específicos. 
COMPETITIVOS: o resultado é inversamente 
proporcional ao sinal emitido 
QUALITATIVO: respondem apenas se a 
amostra é positiva (reagente) ou negativa 
QUANTITATIVOS: faz dosagem 
OBS: um teste pode ser qualitativo e 
quantitativo ao mesmo tempo. 
 
IMUNOENSAIOS 
ENZIMÁTICOS 
 
ELISA: 
 (Ensaio imunoadsorvente ligada a enzima) 
O princípio básico baseia-se na utilização 
de um dos componentes (antígeno ou 
anticorpo) em fase sólida e na utilização de um 
reagente conjugado (também pode ser um 
anticorpo ou antígeno, ligado a uma enzima). 
É um tipo de reação com reagentes 
marcados e o tipo de sinal emitido é a mudança 
de cor, que é identificada pelo 
espectrofotômetro. 
Passo a passo: 
● DIRETA: a placa vem com anticorpos 
adsorvidos 
1) Colocar o soro do paciente na 
placa e incubar por um tempo 
(determinado pelo fabricante). 
- Os antígenos do 
paciente vão se ligar 
aos anticorpos da 
placa. 
2) Lavar a solução para tirar o 
que não for específico, colocar 
o reagente marcado (enzima), 
incubar e lavar novamente. 
- O reagente vai 
interagir com o Ag. e 
se juntar a ele 
formando então, um 
“sanduíche”(anticorpo 
- antígeno - reagente). 
3) Adicionar o substrato que irá 
interagir e ser catalisada 
gerando um sinal (luz). 
 
 
● INDIRETA: a placa vem com antígenos 
adsorvidos 
1) Colocar o soro do paciente na 
placa e incubar por um tempo 
(determinado pelo fabricante). 
- Os anticorpos do 
paciente vão se ligar 
aos antígenos da 
placa. 
2) Lavar a solução para tirar o 
que não for específico, colocar 
o reagente marcado 
(anticorpo), incubar e lavar 
novamente. 
- O reagente vai 
interagir com o Ac. e 
se juntar a ele. 
3) Adicionar o substrato que irá 
interagir e ser catalisada 
gerando um sinal (luz). 
 
 
QUIMIOLUMINESCÊNCIA: 
É um tipo de teste completamente 
automatizado, o que ajuda a evitar erros. 
Na maioria das vezes é feito de maneira não 
competitiva direta ou indireta, porém existem 
variações para que seja feito como de captura 
ou competitivo. É quantitativo e qualitativo. 
É um teste muito semelhante ao ELISA e as 
aplicações são basicamente as mesmas, 
porém no caso da quimioluminescência o sinal 
emitido é a emissão de luz, e não a mudança 
de cor. 
 
IMMUNOBLOT 
(IMMUNOBLOTTING): 
Também conhecido como WESTEN 
BLOTTING, mesmo que esse termo não se 
refira a todas as etapas do teste. 
Etapas: 
● ELETROFORESE DE PROTEÍNAS; é 
uma eletroforese, feita no gel de 
poliacrilamida, para separar as 
proteínas. 
● ELETROTRANSFERÊNCIA: as 
proteínas são transferidas para uma 
membrana de nitrocelulose. 
- Coloca-se a membrana em 
contato com o gel, juntamente 
com +/- 5 folhas de papel-filtro, 
formando um sanduíche. 
- Coloca esse “sanduíche” no 
equipamento que faz com que 
as proteínas corram para o 
polo positivo, ficando presas 
na membrana. 
● IMUNOBLOT (ensaio 
imunoenzimático): geralmente essa é a 
única parte feita pelo próprio 
laboratório, que compra a membrana 
prona do fabricante. 
- Coloca o soro do paciente 
junto a membrana com as 
proteínas, e adiciona um 
substrato (anticorpo ou 
antígeno, depende do analito) 
marcado por uma enzima. 
- Caso o soro do paciente 
contenha o antígeno ou 
anticorpo pesquisado, ele irá 
reagir com o substrato 
marcado mudando de cor 
(sinal). 
OBS: para o teste ser considerado válido os 
controles (positivo e negativo) precisam estar 
adequados. 
É considerado como o padrão ouro para 
diagnóstico de HIV. 
 
IMUNOCROMATOGRAFIA: 
Também conhecido como teste rápido, é um 
tipo de teste que dispensa reagentes adicionais 
e equipamentos. É muito usado para triagem, 
em emergências e locais sem estruturas 
laboratoriais. 
O sistema é realizado em uma membrana 
de nitrocelulose e pode ser empregado um 
corante insolúvel como revelador dá interação 
antígeno-anticorpo. 
Como ocorre: 
● Se o analito é um antígeno: existe um 
anticorpo monoclonal fixado na 
membrana de nitrocelulose 
- A amostra é aplicada e o 
antígeno do paciente vai se 
ligar ao anticorpo da 
membrana. 
- Um anticorpo marcado com 
corante se liga ao antígeno 
formando um imunocomplexo, 
que é revelado pelo acúmulo 
desse corante na linha de 
captura do teste. 
 
● Se o analito é um anticorpo: existe um 
antígeno fixado na membrana de 
nitrocelulose. 
- A amostra é aplicada e o 
anticorpo do paciente vai se 
ligar ao antígeno da 
membrana. 
- Um anticorpo marcado com 
corante se liga formando um 
imunocomplexo, que é 
revelado pelo acúmulo desse 
corante na linha de captura do 
teste. 
 
 Assim como outros testes, possui um 
controle que sempre deve aparecer, 
independente do resultado do teste, para que 
ele seja considerado válido. 
 
IMUNOENSAIOS 
RADIOATIVOS 
 
RADIOIMUNOENSAIO (RIA): 
Radioimunoensaio é um termo usado mais 
quando o analito é um antígeno e tem um 
antígeno marcado. Quando é um anticorpo é 
chamado de IMUNORRADIOMÉTRICO 
(IRMA). 
Existem várias vantagens para o uso do 
método, como a alta sensibilidade e 
especificidade, além dá alta afinidade, baixo 
custo e rapidez. 
Porém por utilizar radioatividade, a 
instabilidade dos radioisótopos causa algumas 
desvantagens, como riscos operacionais, custo 
elevado em materiais de biossegurança e 
problemas de descarte. 
O princípio do teste é a competição entre a 
substância a ser detectada (antígeno ou 
anticorpo do paciente) e a mesma substância 
marcada radioisotopicamente por um receptor 
comum. 
Como ocorre: 
● Quando o analito é um antígeno: existe 
um anticorpo preso a placa 
- Coloca-se o soro do paciente e 
o antígeno marcado na placa, 
incuba e lava. 
- Se o paciente tiver antígenos, 
eles irão competir com o Ag. 
marcado para interagir com o 
anticorpo da placa. Nesse 
caso, a radioatividade diminui 
pois nem todos os Ag. 
marcados se prendem ao Ac. e 
são lavados. 
 
 
● Quando o analito é um anticorpo: 
existe um antígeno preso a placa 
- Coloca-se o soro do paciente e 
o anticorpo marcado na placa, 
incuba e lava. 
- Se o paciente tiver anticorpos, 
eles irão competir com o Ac. 
marcado para interagir com o 
antígeno dá placa. Assim, a 
radioatividade diminui pois 
nem todos os Ac. marcados se 
prendem ao Ag. e são lavados. 
ATENÇÃO: quanto MENOR a leitura 
(radioatividade), MAIOR a concentração do 
paciente e vice-versa. 
 
IMUNOENSAIOS 
FLUORESCENTES 
 
IMUNOFLUORESCÊNCIA: 
Teste usado principalmente para detectar 
antígenos/marcadores em tecidos (biópsia). 
O princípio da técnica é a utilização de 
antígenos ou anticorpos conjugados a uma 
substância que, quando excitada pela radiação 
UV, emite luz. Dessa forma, um anticorpo 
conjugado pode ser usado para detectar um 
antígeno e vice-versa. 
Como ocorre: 
● IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA: 
identifica um antígeno 
- A amostra do paciente é fixada 
na lâmina; 
- Colocar um anticorpo marcado 
com fluorescência que vai 
detectar o antígenodo 
paciente. Incuba e lava. 
- Analisar a lâmina no 
microscópio de luz UV 
(microscópio de 
fluorescência). 
OBS: se quiser descobrir a 
localização do antígeno basta 
usar um corante inespecífico. 
 
 
● IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA: 
identifica um anticorpo. Amostra: soro 
- A amostra do paciente deve 
ser colocada na lâmina que já 
possui um antígeno. Incuba e 
lava. 
- Adicionar um conjugado 
(anticorpo + fluorocromo) que 
vai reconhecer o anticorpo do 
paciente. Incuba e lava. 
- Analisar a lâmina no 
microscópio de luz UV 
(microscópio de fluorescência) 
- Usada para o diagnóstico de 
várias doenças infecciosas. 
 
 
 
CITOMETRIA DE FLUXO: 
Trabalha com células em suspensão 
(movimento), então as amostras são limitadas. 
O princípio consiste na utilização de 
anticorpos monoclonais conjugados a 
fluorocromo. Podem ser usadas diferentes 
combinações diferentes de fluorocromo para 
identificar a célula. 
Como é feito: 
● Faz a marcação das células em 
suspensão (pode marcar o núcleo, 
citoplasma…) 
● Leva a amostra para o citômetro de 
fluxo, ele puxa a amostra por um 
dispositivo capilar 
- Cada célula que passa solta 
um tipo de fluorescência que é 
reconhecida e passada para o 
computador 
● O computador gera um gráfico com os 
resultados para que eles possam ser 
interpretados. 
O citômetro pode ser programado para 
separar células específicas em tubos diferentes 
para testes mais complexos. Ele pode medir 
diversos parâmetros a partir de detectores 
específicos, são eles: 
● FSC e SSC: detectam tamanhos e 
grânulos (analisa a complexidade do 
citoplasma) 
● FL1, FL2, FL3…: são os filtros/canais, 
detectam as fluorescências. 
Os gráficos gerados podem ser de dois 
tipos, vai depender do objetivo do exame: 
● HISTOGRAMA: detecta uma única 
fluorescência 
 
● DOTPLOT: detecta uma fluorescência 
em relação a outra. 
- Determina um limite entre as 
células que realmente estão 
emitindo fluorescência e das 
que estão emitindo uma 
fluorescência inespecífica. 
 
 
IMUNOHISTOQUÍMICA 
 (teste enzimático): 
O imunoensaio enzimático é muito parecido 
com a imunofluorescência, a principal diferença 
é o marcador, que é uma enzima e não um 
fluorocromo. 
Usado principalmente para a detecção de 
amostras (marcadores/antígenos) em tecidos. 
É muito usado para a detecção de marcadores 
tumorais. 
Segue os mesmos passos da 
imunofluorescência, porém ao final é 
necessário colocar um substrato, que faz com 
que o tecido fique marrom. 
 
REAÇÃO DE 
AGLUTINAÇÃO E 
HEMAGLUTINAÇÃO 
 (Testes com reagentes não marcados) 
A técnica é caracterizada pela formação de 
agregados visíveis (aglutinados) como 
resultado dá interação de anticorpos 
específicos e partículas insolúveis que 
possuem determinantes antigênicos. 
Pode ser utilizado para o diagnóstico de 
doenças infecciosas e autoimunes, detecção 
de hormônios e drogas, e para tipagem 
sanguínea. 
● AGLUTINAÇÃO EM LÁTEX: pode ser 
direto (buscando antígeno) ou indireto 
(buscando anticorpo) 
- Pesquisa o fator reumatóide 
(presente em inflamações), 
antígeno de bactéria, drogas, 
hormônios, anticorpos contra 
infecções, proteína C reativa, 
Ac. anti-nucleares (processos 
autoimunes). 
 
● HEMAGLUTINAÇÃO: pesquisa de 
moléculas solúveis ou na superfície. 
Sempre são necessárias hemácias 
para esses testes, podendo ser do 
paciente ou nao, depende do motivo e 
do tipo do teste. 
- DIRETA: detecta anticorpos 
que funcionam como. 
antígenos. 
● Adicionar o soro (com 
imunoglobulinas) a 
amostra do paciente. 
Se for positivo as 
hemácias se juntam 
formando um 
aglutinado. 
● Usado por exemplo no 
diagnóstico de 
doenças autoimunes e 
na doença hemolítica 
do recém-nascido. 
- INDIRETA: detecta anticorpo. 
● Adiciona o soro de 
coombs a amostra do 
paciente. Se for 
positivo as hemácias 
se juntam formando 
um aglutinado. 
● Usado por exemplo 
em processos de 
hemotransfusão. 
OBS: o controle positivo precisa aglutinar e o 
negativo não pode aglutinar para o teste ser 
considerado válido. 
 
 
REAÇÃO DE 
PRECIPITAÇÃO 
 (Testes com reagentes não marcados) 
É um teste em que são usados anticorpos e 
antígenos solúveis. 
O resultado positivo é indicado pela 
formação de um precipitado visível quando as 
duas soluções (amostra e reagente NÃO 
marcado) se encontram e reagem. 
É preciso ter atenção pois a formação do 
precipitado pode ser inibida pelo excesso de 
anticorpo, gerando o efeito prozona, ou pelo 
excesso de antígeno, gerando o efeito prozona. 
Para evitar que isso ocorra é preciso fazer a 
diluição seriada da amostra.