Métodos laboratoriais - analises microb e imunol aula 6

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DESCRIÇÃO
Abordagem dos principais métodos laboratoriais empregados na imunologia clínica.
PROPÓSITO
Compreender os principais métodos laboratoriais empregados na imunologia clínica, bem como sua importância e aplicabilidades na rotina
laboratorial para auxiliar na escolha da melhor metodologia para um diagnóstico confiável, rápido, de baixo custo e que possibilite um
tratamento eficaz e cuidadoso ao paciente.
OBJETIVOS
MÓDULO 1
Descrever os principais métodos laboratoriais imunológicos com reagentes não marcados
MÓDULO 2
Explicar os métodos laboratoriais imunológicos com reagentes marcados
INTRODUÇÃO
Neste tema, vamos explorar um pouco mais sobre a metodologia dos principais testes imunológicos empregados em um laboratório de
análises clínicas.
Você sabe o que é um teste imunológico?
Os testes imunológicos são metodologias amplamente empregadas para detectar anticorpos contra os microrganismos (Parasitas, fungos,
vírus e bactérias) . Isto é, antígenos que podem ser o próprio patógeno que causou a enfermidade ou qualquer substância que se comporte
como um antígeno em uma interação com o anticorpo, como:
Hormônios
Drogas
Ácidos nucléicos
Receptores das células.
A partir desses testes, podemos fornecer uma confirmação diagnóstica, o diagnóstico precoce, a fim de acompanhar a evolução e o
tratamento de uma doença, além de confirmar a presença de uma substância no organismo.
Atualmente, existe uma enorme variabilidade de testes imunológicos, como, por exemplo, as reações de precipitação, reações de
aglutinação, reações de fixação de complemento, ensaios imunocromáticos, imunoenzimáticos, dentre outros. Todas essas técnicas são
baseadas no reconhecimento antígeno-anticorpo e podem ser feitas a partir de reagentes marcados com algum corante fluorescente ou
quimioluminescentes, radioisótopos, enzimas que geram uma coloração ao final da reação ou reagentes não marcados, gerando uma
interação que é visível a olho nu.
 DICA
Imunosorologia é a detecção quantitativa e qualitativa da interação antígeno e anticorpo que visa o diagnóstico.
Você certamente já ouviu falar em ELISA, ensaios de precipitação e teste rápido. Sabe qual a diferença entre eles? Ao longo desta jornada,
vamos entender como esses testes são realizados e como cada técnica pode ser empregada, compreendendo a diferença entre eles e as
principais vantagens e desvantagens. Para melhor entendimento, vamos dividir esses testes em dois grandes grupos:
Métodos que usam reagentes não marcados
Métodos que usam reagentes marcados.
MÓDULO 1
 Descrever os principais métodos laboratoriais imunológicos com reagentes não marcados
MÉTODOS LABORATORIAIS IMUNOLÓGICOS COM REAGENTES
NÃO MARCADOS
Como mencionamos, os métodos laboratoriais imunológicos que utilizam imunorreagentes livres de marcação são técnicas que possibilitam
uma interação antígeno e anticorpo que podemos visualizar. Nesse tipo de reação, ocorre o reconhecimento de anticorpos com antígenos
solúveis e a formação de precipitados insolúveis.
Quando o antígeno pesquisado é um microrganismo, como uma bactéria, um protozoário, uma hemácia, ou seja, um antígeno particulado, os
anticorpos, ao reconhecerem o antígeno, irão se aglutinar (Figura 1). De modo diferente, quando o antígeno está ligado à superfície celular, o
resultado da interação com o anticorpo pode ser a lise celular (Citólise) .
PRECIPITADOS
São produtos que não são capazes de se dissolver.
 
Fonte: Soleil Nordic/Shutterstock
 Figura 1: Interação entre antígeno e anticorpo, resultando em aglutinação.
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Dentre as técnicas imunológicas com reagentes não marcados, destacam-se:
REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO
AGLUTINAÇÃO
FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO
REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO
São técnicas que consistem no reconhecimento de antígenos solúveis com seus anticorpos complementares que também estão em solução,
originando um agregado (Imunocomplexo) que não se solubiliza (Precipitado) e é visível (Figuras 2 e 3).
 
Fonte: O autor
 Figura 2: Imunocomplexos.
 
Fonte: Wikimedia
 Figura 3: Formação dos imunocomplexos.
É importante ressaltar que, para que a reação de precipitação seja visível, um fator determinante é a concentração de antígeno (Ag) e
anticorpo presentes (Ac) . Quando as concentrações dessas duas moléculas são equivalentes, ocorre uma precipitação máxima e, assim, é
possível visualizar a precipitação. Chamamos esse fenômeno de zona de equivalência. De forma diferente, quando existe excesso de
antígeno ou anticorpo, a interação diminui e a formação de precipitado também, gerando resultados falso-negativos. Quando temos excesso
de anticorpos, ocorrem reações que não são visíveis a olho nu (Precipitação subótima) , esse fenômeno é chamado de prozona (Figura 4).
PROZONA
Esse efeito pode ser observado em outros testes sorológicos, como aglutinação. Durante os exames, a partir dessa técnica, são
realizadas diferentes diluições para evitar resultados falhos.
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Fonte: Soleil Nordic/Shutterstock
 Figura 4: Curva que mostra a reação de precipitação entre antígeno e anticorpo.
Entenda melhor a figura:
A
Na figura, temos em (A) excesso de anticorpos, o que resulta em precipitados pequenos que não são visíveis a olho nu, efeito prozona.
B
Representa a zona de equivalência, com concentrações de antígeno e anticorpo equivalentes e precipitação máxima e visível.
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C
Em (C), o excesso de antígeno também gera precipitados pequenos, não visíveis a olho nu, efeito pós-zona.
Nas reações de precipitação, para verificar a interação antígeno e anticorpo, são utilizados diferentes meios reacionais, como, por exemplo, o
meio líquido ou semissólido. Quando realizadas em meio semissólido, essas reações são dividias em imunodifusão e imunoeletroforese. As
principais vantagens dessa técnica são rapidez, fácil execução, baixo custo, podem ser testadas diferentes amostras e boa especificidade.
No entanto, elas apresentam uma baixa sensibilidade.
Agora vamos conhecer as peculiaridades de cada técnica de precipitação:
REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO EM MEIO LÍQUIDO, TÉCNICA DE
PRECIPITINA E/OU DO ANEL
A precipitação ocorre em tubos de ensaio ou em capilares e visa pesquisar a presença de antígenos. Para isso, os tubos apresentam uma
solução de anticorpos já conhecida, também chamada de soro hiperimune e nele, cuidadosamente, é adicionado uma amostra, para formar
duas fases: uma inferior, com o soro hiperimune, e outra superior, com a amostra. Se o antígeno pesquisado estiver presente na amostra,
este migrará em direção ao soro, formando um gradiente de concentração. Quando ocorrer a interação antígeno e anticorpo e esta estiver na
zona de equivalência, é possível verificar a formação de um precipitado visível (Um anel de turvação) (Figura 5). Tal técnica é mais utilizada
em laboratórios de pesquisa.
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Fonte: O autor
 Figura 5: Esquema de reações de precipitação em meio líquido.
Antes de estudarmos as técnicas de precipitação em meio semissólido, devemos conhecer mais um pouco sobre imunodifusão.
IMUNODIFUSÃO
Consiste na migração de antígenos solúveis em uma matriz gelatinosa (ágar ou um gel de agarose) que contém um anticorpo em sua
composição. É importante ressaltar que algumas técnicas podem pesquisar anticorpos solúveis em uma matriz que apresente o antígeno
correspondente. Quando as moléculas estão livres, a difusão permanece constante, mas, quando ocorre a interação de antígenos solúveis
com os anticorpos, o precipitado (Imunopreciptado) formado fica preso no gel de acordo com o peso molecular desse complexo e assim,
podem ser visualizados.
As técnicas de imunodifusão dependem de alguns parâmetros, são eles: concentração, pureza e tamanho dos poros do gel, concentração
dos antígenos e anticorpos, tempo de difusão, temperatura, especificidade e avidez da interação antígeno e anticorpo.
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Dependendo do tipo de migração do antígeno e doanticorpo sobre a matriz, a imunodifusão pode ser dividida em simples, dupla ou radial.
ESPECIFICIDADE
Capacidade de um anticorpo apenas reconhecer o seu antígeno específico.
AVIDEZ
Força de interação total do antígeno com o anticorpo.
IMUNODIFUSÃO SIMPLES OU IMUNODIFUSÃO UNIDIRECIONAL EM MEIO
SEMISSÓLIDO
Quando um dos componentes (Ag ou Ac) fica fixado ao gel, enquanto o outro vai migrando até que se forme os imunocomplexos.
O antígeno é colocado sobreposto a uma coluna de ágar, contendo o soro hiperimune. As moléculas do antígeno irão penetrar no ágar e se
difundirem com uma velocidade diferente para cada substância, dependendo do peso molecular. Após o tempo de incubação de normalmente
uma semana, será possível observar o que chamamos de disco (banda) ou zona de precipitação (Figura 06).
 
Fonte: Biosciencenotes
 Figura 6: Imunodifusão simples.
IMUNODIFUSÃO DUPLA OU IMUNODIFUSÃO DE OUCHTERLONY
Quando o antígeno e o anticorpo migram ao mesmo tempo, um em direção ao outro para a formação do imunocomplexos. Esse teste é
realizado em uma lâmina de vidro ou placa de Petri, que é coberta por uma camada fina de gel, com dois orifícios, onde em um é colocado o
antígeno e no outro o anticorpo, caso haja formação de imunocomplexos, há o aparecimento de bandas ou linhas de precipitação (Figura 7).
Essa é uma técnica semiqualitativa, que pode ser utilizada para o diagnóstico de doenças infectocontagiosas, como candidíase,
histoplasmose e aspergilose.
Após a imunodifusão, podemos utilizar um corante para marcar as proteínas, a fim de visualizar melhor as linhas de precipitação. A utilização
desses corantes é preconizada quando temos uma baixa concentração de antígenos e anticorpos, o que torna as bandas não visíveis.
 
Fonte: Biosciencenotes
 Figura 7: Imunodifusão dupla.
IMUNODIFUSÃO RADIAL SIMPLES (IMUNODIFUSÃO DE MANCINI)
Quando o movimento do antígeno ocorre em todas as direções em um meio semissólido. Para isso, uma lâmina de vidro ou uma placa de
Petri é coberta com um gel impregnado de anticorpo distribuído uniformemente, em seguida, as amostras em investigação são colocadas em
pequenos orifícios. Os antígenos presentes na amostra irão se difundir de forma radial e, à medida que vão encontrando os anticorpos, há
formação de imunocomplexos e de um halo de precipitação ao redor do orifício (na forma de anel). Quanto maior a concentração do
antígeno, maior é o tamanho do halo (Figura 8).
 
Fonte: Microbenotes
 Figura 8: Imunodifusão radial.
Além das amostras testes, nessa técnica, são utilizadas soluções padrões com concentrações conhecidas de antígenos. A partir do tamanho
dos halos de precipitação obtidos com os antígenos controles (padrão), podemos originar uma curva padrão e descobrir a concentração de
antígenos presentes em amostras de soros de pacientes, possibilitando uma análise quantitativa. Essa técnica pode ser utilizada para
quantificação de proteínas, como:
Imunoglobulinas
Proteínas séricas
Fatores do complemento
Proteínas de fase aguda (PCR)
IMUNOELETROFORESE (MÉTODO DE GRABAR E WILLIAMS)
A imunoeletroforese é uma técnica de imunopreciptação em meio semissólido (gel) que associa as técnicas de imunodifusão e a
eletroforese. Como vimos, a imunodifusão verificará a difusão do antígeno (ou anticorpo) sobre uma superfície gelatinosa composta de
anticorpos (ou antígeno) e a formação de zona de precipitação, indicando o reconhecimento antígeno-anticorpo.
Mas e a eletroforese, você conhece?
 
Fonte: Shutterstock
A eletroforese é uma técnica que consiste na migração e separação de moléculas de acordo com a carga após a geração de um campo
elétrico. Ela utiliza diferentes meios de suporte, como fitas ou membranas de poliacetato de celulose e géis de agarose.
No nosso organismo, diversas moléculas, como proteínas, aminoácidos, polipeptídios, nucleotídeos e ácido nucleico, apresentam grupos
funcionais ionizáveis que adquirem cargas (positiva ou negativa) em um determinado pH. Assim, quando um campo elétrico é gerado, as
moléculas migrarão para o polo positivo (Ânodo) ou negativo (Cátodo) de acordo com a sua carga líquida. Para verificação de proteínas,
normalmente, é utilizado um tampão com pH entre 8,2 e 8,6 e, nessa solução, as moléculas são carregadas negativamente e migram em
direção ao ânodo (+) . As imunoglobulinas, em média, têm pouca carga neste pH e, portanto, migram pouco desde o ponto de aplicação da
amostra (origem). Além disso, a migração também depende do tamanho e conformação das moléculas, proteínas de alto peso molecular
migram menos que as de baixo peso molecular.
Essa técnica é amplamente utilizada para:
Verificação analítica, como na avaliação de proteína sérica
Análises preparatórias, ou seja, na purificação de proteína que depois será estudada
Para a detecção específica de enzimas e suas isoformas (por meio de sua atividade particular)
Detecção de antígenos (em combinação com uma variedade de técnicas imunológicas)
 SAIBA MAIS
As proteínas separadas por eletroforese podem ser fixadas e coradas com vários tipos de corantes, como o preto de amido 10 B (azul
escuro); Ponceau-S (vermelho); Coomassie G-250 (azul claro) ou Coomassie R-250 (violeta azul).
Agora que conhecemos mais sobre a eletroforese, vamos entender a técnica de imunoeletroforese.
A imunoeletroforese é realizada em duas etapas:
 
Fonte: Adaptado de The Biotech Notes
A primeira separa as proteínas através da eletroforese. Para isso, um gel é preparado, colocado em uma cuba de eletroforese, e o tampão é
escolhido para que as partículas a serem analisadas fiquem com as cargas negativas e migrem para o polo positivo. As amostras a serem
testadas (misturas de anticorpos ou antígenos) são aplicadas no gel (Figura 9A).
 Figura 9A: Esquema representando uma imunoeletroforese.
 
Fonte: Adaptado de The Biotech Notes
Nesse aparato, é aplicada uma diferença de potencial, que será responsável pela migração e separação das moléculas de acordo com a
carga, tamanho e conformação (Figura 9B).
 Figura 9B: Esquema representando uma imunoeletroforese.
 
Fonte: Adaptado de The Biotech Notes
Após a corrida eletroforética, é feita a imunodifusão de cada componente que foi separado no gel. Para isso, é cortada uma canaleta entre os
poços onde é colocado o antígeno ou anticorpo correspondente (figura 9C).
 Figura 9C: Esquema representando uma imunoeletroforese.
 
Fonte: Adaptado de The Biotech Notes
À medida que ocorre uma interação antígeno-anticorpo, vamos ter uma linha de precipitação em forma de arco na região de equivalência.
Cada banda formada representa a formação de um complexo imune específico (Figura 9D).
 Figura 9D: Esquema representando uma imunoeletroforese.
Essa é uma técnica qualitativa e semiquantitativa que possibilita distinguir substâncias de acordo com suas cargas elétricas, seus pesos
moleculares, tamanhos, sua conformação espacial, concentração e suas propriedades antigênicas. Ela é muito empregada no diagnóstico de
gamopatias monoclonais, como o mieloma múltiplo e macroglobulinemia.
 SAIBA MAIS
O mieloma múltiplo é uma neoplasia da medula óssea que leva à proliferação das células B e ao aumento descontrolado da produção de
anticorpos monoclonais (normalmente, do tipo IgG ou IgA) e fragmentos deles, chamados de proteína M. Nessa doença, as proteínas
monoclonais de IgM, IgA, IgD e IgE podem estar presentes em quantidades relativamente pequenas quando comparadas à IgG. Um
resultado de imunoeletroforese que não detecta a porção da cadeia leve das imunoglobulinas não-IgG, mostra uma alteração no padrão de
produção desses anticorpos, o que é indicativo de gamopatias como o mieloma.
A partir da técnica de Grabar e Williams, outras metodologias foram desenvolvidas, são elas:
REAÇÃO DE IMUNOELETROFORESE UNIDIMENSIONAL SIMPLES
(ELETROFORESE DE FOGUETE OU TÉCNICA DE LAURELL)
É uma adaptação da técnica de Graber e Williams, onde a eletroforese e a imunodifusão ocorrem ao mesmo tempo com o deslocamentoapenas da substância que se deseja analisar. Para isso, uma pequena camada de gel incorporada com o anticorpo ou antígeno é preparada
sobre uma lâmina de vidro. As amostras são aplicadas em poços pré-formados, o tampão é escolhido para que as partículas a serem
analisadas fiquem com as cargas negativas e migrem para o polo positivo e esse conjunto é submetido à eletroforese. Durante a eletroforese,
à medida que a substância vai migrando a partir do orifício de aplicação, ocorre a separação das moléculas e o reconhecimento do antígeno-
anticorpo , com a formação das linhas de precipitação em formato de cone ou foguete. Isto porque, no início, há uma grande concentração da
substância de interesse, que ao longo da corrida eletroforética vai diminuindo até que se esgote. É importante ressaltar que, durante a
técnica, não ocorre a migração da substância que está incorporada ao gel.
REAÇÃO DE IMUNOELETROFORESE DUPLA BIDIMENSIONAL
(CONTRAIMUNOELETROFORESE)
Nesta técnica, antígenos e anticorpos migram ao mesmo tempo por eletroforese, no mesmo eixo, mas em direções opostas, resultando na
precipitação no local onde ocorre o reconhecimento antígeno e anticorpo. A reação de contraimunoeletroforese só é possível quando
antígenos e anticorpos migram em sentidos opostos durante a eletroforese, ou seja, os anticorpos migram para o polo negativo (cátodo),
enquanto os antígenos migram para o polo positivo (ânodo). Nesse método, podemos realizar várias análises em somente uma lâmina, é
uma metodologia rápida e mais sensível que a imunodifusão, além de poder ser realizado em membranas de acetato de celulose.
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ANTÍGENOS MIGRAM PARA O POLO POSITIVO
Esse fenômeno pode ser estimulado com o uso de tampões alcalinos.
 
Fonte: O autor.
 Reação de imunoeletroforese dupla bidirecional.
REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
As reações de aglutinação consistem na formação de um agregado visível após a interação de anticorpos específicos com partículas
insolúveis que contêm diferentes determinantes antigênicos (local de ligação do anticorpo, ou epítopo) ligados à superfície dessas
partículas. Diferente da precipitação, onde os anticorpos e antígenos são solúveis, nessa técnica, pelo menos uma substância deve ser
insolúvel.
Mas o que são essas partículas insolúveis?
As partículas insolúveis podem ser um antígeno insolúvel, antígenos expressos na superfície das membras plasmáticas, como os antígenos
presente na membrana dos eritrocitários, ou então partículas cobertas com os antígenos (exemplo: látex).
Essa técnica apresenta alta especificidade e reprodutibilidade, é de fácil execução, simples e barata, mas apresenta baixa sensibilidade. É
amplamente utilizada para tipagem sanguínea, provas de compatibilidade transfusional, detecção de hormônios, detectar patógenos (Vírus,
bactérias, protozoários e fungos) e no diagnóstico das doenças autoimunes. Essas reações são divididas em: reações de aglutinação direta,
indireta, reações de inibição da aglutinação.
AGLUTINAÇÃO DIRETA
Como o nome diz, é a interação direta entre antígenos presentes na superfície de uma célula com o anticorpo correspondente. Os
antígenos podem estar na sua forma integra ou fragmentada. No entanto, para ocorrer uma aglutinação visível, é necessário que o
anticorpo reconheça pelo menos dois sítios antigênicos (bivalente), o que permite a ligação simultânea com mais de um antígeno formando
interações cruzadas e um agrupado de partículas visíveis (rever a Figura 1).
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FIGURA 1
 
Fonte: Shutterstock
 EXEMPLO
Classificação sanguínea, prova de compatibilidade, teste de Coombs direto e indireto e sorotipagem bacteriana são exemplos dessa técnica.
Quando desejamos encontrar um anticorpo específico, devemos fazer diluições seriadas das amostras frente a uma concentração fixa e
conhecida do antígeno correspondente. Após o tempo de incubação, o resultado é expresso como título do anticorpo, ou seja, a última
diluição em que é possível verificar a aglutinação.
AGLUTINAÇÃO PASSIVA OU INDIRETA
Essa reação consiste no reconhecimento de anticorpos presentes no soro com antígenos presentes artificialmente em partículas inertes
(látex ou gelatina) ou então hemácias, que são sensibilizadas por adsorção passiva e desempenham uma função de suporte. Quando uma
amostra de soro ou plasma apresenta um anticorpo que reconheça os antígenos correspondentes nas hemácias ou nas partículas inertes
que formem pontes entre as partículas vizinhas, irá ocorrer a aglutinação (Figura 10). Esse teste apresenta diversas aplicabilidades.
LÁTEX
Partículas de látex são esferas de poliestireno que desempenham um papel de suporte, e é possível adsorver antígenos.
ADSORÇÃO PASSIVA
Adesão de moléculas fluidas a uma superfície sólida.
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Fonte: Wikimedia
 Figura 10: Teste de aglutinação indireta. O teste de Coombs indireto é um exemplo desse teste quando é utilizado hemácias como
suporte.
O teste de Coombs indireto é um exemplo desse teste quando se utiliza hemácias como suporte.
 VOCÊ SABIA
A reação de aglutinação indireta com o látex como partícula inerte é amplamente utilizada para a detecção do fator reumatoide. A artrite
reumatoide é uma doença autoimune que leva à inflamação crônica nas articulações, à ativação desregulada de células B e T e à produção
de autoanticorpos, moléculas que reconhecem a região Fc das imunoglobulinas produzidas no nosso organismo, chamado de fator
reumatoide que normalmente é uma variante de IgM. Na pesquisa do fator reumatoide, o látex é sensibilizado com gama-globulina humana
(antígeno), e essa partícula é reagida com o soro do paciente. Se o soro apresentar o fator reumatoide, teremos a aglutinação.
REAÇÕES DE INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO
Nessas reações, ocorre uma competição entre os antígenos presentes na superfície de hemácias ou de partículas inertes e antígenos
solúveis pelo sítio de ligação com o anticorpo, diminuindo assim a capacidade de interação e aglutinação. Dessa forma, a reação é
positiva quando não temos aglutinação. A competição acontece entre dois antígenos semelhantes, pelo local de ligação com o anticorpo, ou
entre dois anticorpos diferentes pela ligação ao mesmo antígeno. A interação acontecerá entre o antígeno e o anticorpo que apresente uma
reação mais estável.
INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO DIRETA DE HEMÁCIAS POR ANTÍGENOS VIRAIS
Durante uma infecção viral, alguns vírus apresentam a capacidade de se ligar a receptores localizados na superfície de hemácias
danificadas. Assim, essa propriedade é utilizada para a dosagem de anticorpos contra os vírus durante a evolução de uma doença.
Um paciente com uma suspeita de infecção viral faz um exame de sangue para confirmar a presença de anticorpos contra esse vírus. O soro
desse paciente é então diluído e colocado em contato com quantidades fixas de antígenos virais e hemácias. Teremos uma competição da
ligação dos anticorpos aos antígenos livres e os que estão ligados a hemácias. À medida que ocorre a ligação antígeno livre e
anticorpo, a aglutinação diminui. Em seguida, verificamos qual foi a diluição que não houve mais a aglutinação das hemácias, ou seja, a
inibição da propriedade aglutinante, e esse representa o título do anticorpo .
REAÇÃO DE INIBIÇÃO PASSIVA DE PARTÍCULAS INERTES (LÁTEX)
Ocorre pela inibição da ligação entre antígenos ancorados na sua superfície do látex e seus anticorpos correspondentes, quando existem
anticorpos solúveis que competem inibindo a aglutinação.
 
Fonte: Shutterstock
Uma paciente está com suspeita de gravidez e realiza a coleta da urina para o teste. Normalmente, o teste de gravidez detecta o hormônio da
gonodotrofina coriônica (hHCG) em uma reação de inibição de aglutinação.
Vamos entender melhor:
 
Fonte: O autor
REAÇÃO DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO
Podemos identificar e quantificar a presença de antígenos e anticorpos em uma amostra através da formação de imunocomplexos e a
avaliação da capacidade desses complexos em fixare consumir as moléculas do sistema complemento in vitro.
Essa técnica é barata, simples e utilizada para o diagnóstico de alguns agentes infecciosos como a histoplasmose e a coccidioidomicose.
No entanto, esses testes estão sendo substituídos pelos ensaios enzimáticos, que são mais sensíveis, e são empregados apenas como
testes confirmatórios.
O teste é realizado em duas etapas.
ETAPA 1
Na primeira etapa, ocorre a formação dos imunocomplexos (interação antígeno e anticorpo) e a ligação (fixação) com as moléculas do
sistema complemento.
ETAPA 2
Na segunda etapa, as hemácias ligadas aos anticorpos antieritrócitos (hemolisinas) são adicionadas e, após um período, observamos se
ocorreu ou não a hemólise.
A presença de hemólise indica que, na primeira etapa, não houve a formação do imunocomplexo e a fixação do complemento, ficando
as moléculas do sistema complemento livres e capazes de interagir com o complexo hemácias-hemolisinas. De forma diferente, a ausência
de hemólise informa que houve a formação do imunocomplexo e a fixação das moléculas do sistema complemento, ou seja, uma reação
positiva. É importante ressaltar que, nessa reação, os antígenos e anticorpos isolados não podem ativar o sistema complemento, pois
geraria resultados falhos.
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Fonte: O autor.
 Esquema mostrando a reação de fixação do complemento.
O sistema hemácia-hemolisina funciona como um sistema revelador.
IMUNOFIXAÇÃO, NEFELOMETRIA E FLOCULAÇÃO
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. APRENDEMOS QUE OS TESTES IMUNOLÓGICOS SÃO BASEADOS NO RECONHECIMENTO ANTÍGENO-
ANTICORPO E PODEM SER FEITOS A PARTIR DE REAGENTES MARCADOS OU NÃO MARCADOS, GERANDO
UMA INTERAÇÃO QUE É VISÍVEL A OLHO NU, COMO A AGLUTINAÇÃO. SOBRE A AGLUTINAÇÃO, ANALISE
AS ASSERTIVAS A SEGUIR: 
 
I. SÃO REAÇÕES QUE OCORREM ENTRE ANTÍGENOS NATURAIS INSOLÚVEIS OU ADSORVIDOS À
SUPERFÍCIE DE PARTÍCULAS INERTES COM OS ANTICORPOS CORRESPONDENTES. 
II. A ALTA SENSIBILIDADE E BAIXA ESPECIFICIDADE SÃO VANTAGENS DAS REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO. 
III. PODE SER UTILIZADA PARA TIPAGEM SANGUÍNEA, PROVAS DE COMPATIBILIDADE TRANSFUSIONAL,
DETECÇÃO DE HORMÔNIOS, DETECTAR PATÓGENOS (VÍRUS, BACTÉRIAS, PROTOZOÁRIOS E FUNGOS) E
NO DIAGNÓSTICO DAS DOENÇAS AUTOIMUNES. 
 
ESTÃO CORRETAS AS ASSERTIVAS:
A) I e II
B) II e III
C) I e III
D) III
2. ESTUDAMOS QUE A DETECÇÃO DE UM ANTÍGENO OU ANTICORPO PODE SER REALIZADA A PARTIR DA
CAPACIDADE DOS IMUNOCOMPLEXOS DE FIXAR E CONSUMIR O SISTEMA COMPLEMENTO, NO TESTE
CHAMADO DE REAÇÃO DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO. SOBRE ESSE MÉTODO, ASSINALE A
ALTERNATIVA INCORRETA.
A) O teste de fixação do complemento é um teste utilizado para o diagnóstico de alguns agentes infecciosos como a histoplasmose e
coccidioidomicose.
B) O teste de fixação de complemento é feito em duas etapas, na primeira etapa, ocorre a fixação do complemento e, na segunda, a
revelação da reação que é verificada pela ausência ou presença de lise nas hemácias.
C) A interação do antígeno e anticorpo possibilita a fixação do sistema complemento e, nesse caso, ele é consumindo não ficando disponível
para uma segunda reação.
D) Se o complemento foi fixado na primeira etapa da reação, na segunda etapa após a revelação, veremos a hemólise, ou seja, um resultado
positivo.
GABARITO
1. Aprendemos que os testes imunológicos são baseados no reconhecimento antígeno-anticorpo e podem ser feitos a partir de
reagentes marcados ou não marcados, gerando uma interação que é visível a olho nu, como a aglutinação. Sobre a aglutinação,
analise as assertivas a seguir: 
 
I. São reações que ocorrem entre antígenos naturais insolúveis ou adsorvidos à superfície de partículas inertes com os anticorpos
correspondentes. 
II. A alta sensibilidade e baixa especificidade são vantagens das reações de aglutinação. 
III. Pode ser utilizada para tipagem sanguínea, provas de compatibilidade transfusional, detecção de hormônios, detectar patógenos
(vírus, bactérias, protozoários e fungos) e no diagnóstico das doenças autoimunes. 
 
Estão corretas as assertivas:
A alternativa "C " está correta.
 
A aglutinação é uma técnica que apresenta alta especificidade e baixa sensibilidade, pois, se os anticorpos e antígenos não estiverem nas
concentrações equivalentes, pode ocorrer resultados falso negativos (o paciente tem a doença, mas o teste não detecta).
2. Estudamos que a detecção de um antígeno ou anticorpo pode ser realizada a partir da capacidade dos imunocomplexos de fixar
e consumir o sistema complemento, no teste chamado de reação de fixação do complemento. Sobre esse método, assinale a
alternativa INCORRETA.
A alternativa "D " está correta.
 
Na reação de fixação do complemento, quando temos a ligação do antígeno-anticorpo, o complexo formado é capaz de se ligar, fixar e
consumir o sistema complemento, não ficando assim disponível para hemolisar as hemácias ligadas à hemolisina (anticorpo antieritrocitário)
quando for adicionado o sistema revelador. Nesse caso, uma reação é positiva quando não vemos hemólise.
MÓDULO 2
 Explicar os métodos laboratoriais imunológicos com reagentes marcados
MÉTODOS LABORATORIAIS IMUNOLÓGICOS COM REAGENTES
MARCADOS
Estudamos que as técnicas de precipitação, aglutinação e de fixação do complemento são os principais ensaios imunológicos que utilizam
reagentes não marcados. Agora, vamos conhecer alguns métodos onde a verificação da presença de um antígeno e o anticorpo é realizado
com algum dos elementos (antígeno ou anticorpo) marcados com um corante fluorescente ou quimioluminescentes, radioisótopos, enzimas,
entre outros marcadores.
Vamos juntos estudar um pouco sobre o ELISA, testes de fluorescência, testes imunocromatográficos, radioimunoensaios e algumas técnicas
de imuno-histoquímica. Além disso, vamos entender a importância dos testes de hipersensibilidade celular cutânea tardia na avaliação geral
da imunidade celular.
IMUNOFLUORESCÊNCIA
Em 1941, uma equipe de pesquisadores liderados por Albert H. Coons, desejando analisar as técnicas imunológicas com auxílio de corantes,
utilizou radicais fluorescentes, pois a coloração com os reagentes comuns conferia uma fraca intensidade. Nessa época, já era conhecida a
capacidade dos anticorpos de ligar-se aos radicais químicos sem alterar sua conformação e capacidade de interagir com os antígenos. Foi
desenvolvido assim o teste de imunofluorescência.
O desenvolvimento desse teste só foi possível pela capacidade de algumas substâncias em armazenar energia luminosa e liberá-la depois,
fenômeno esse conhecido como luminescência.
FOSFORESCÊNCIA
Quando a substância consegue armazenar energia luminosa por longos períodos até a sua emissão.
FLUORESCÊNCIA
Quando a substância armazena energia luminosa por curto período até sua emissão.
Os corantes fluorescentes mais utilizados são a rodamina e a fluoresceína. 
Após a coloração, essas amostras podem ser analisadas:
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Fonte: Wikipedia
NO MICROSCÓPIO ÓPTICO DE FLUORESCÊNCIA

 
Fonte: Wikipedia
NO CITÔMETRO DE FLUXO
A imunofluorescência representa um grande avanço na imunologia clínica, pois permitiu a detecção de substâncias de forma direta, mesmo
que em pequenas concentrações, e utilizando pequenas quantidades de corantes fluorescentes, uma vez que esses corantes emitem grande
quantidade de energia. Antes, a detecção de um antígeno ou anticorpo era realizado através de Reações secundárias (aglutinação ou
precipitação) , ou seja, após a formação de um imunocomplexo, sendo necessária grandes quantidades de antígenos e anticorpos para sua
visualização.
A partir dessa técnica, diferentes métodos foram descritos, como a imunoflorescência direta e indireta.
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA
Esta técnica é utilizada para detectar antígenos em biopsias de tecidos, como também a presença de células, bactérias, vírus, fungos e
protozoários. Ela consiste no reconhecimento de antígenos por anticorpo correspondente que está conjugado com uma substânciafluorescente. A presença de fluorescência indica que a amostra tem a substância pesquisada. A análise por esse método costuma ser
qualitativa (Figura 11).
 
Fonte: Vshivkova/Shutterstock
 Figura 11: Células leucêmicas marcadas com corante fluorescente, em que o núcleo está corado em verde e o citoplasma em vermelho.
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
Nesta técnica, utiliza-se um anticorpo secundário conjugado com o radical fluorescente, ou seja, um anticorpo anti-imunoglobulina que é
capaz de reconhecer diferentes imunoglobulinas ligadas a um antígeno específico. A principal vantagem desse método é a diminuição dos
custos, uma vez que o anticorpo secundário pode ser empregado para o reconhecimento de qualquer anticorpo humano e utilizado para
diferentes análises. Além disso, é um método mais sensível e específico quando comparado à imunofluorescência direta. É utilizado para o
diagnóstico e o acompanhamento de diferentes doenças (Figura 12).
 
Fonte: Wikimedia
 Figura 12: Teste de imunofluorescência. Em (A) e (B) fotos de células marcadas pela imunofluorescência. (C) esquema mostrando a
diferença entre a imunofluorescência direta e indireta.
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA-ENZYME LINKED
IMMUNOSORBET ASSAY)
Em 1971, foi introduzido pelos pesquisadores Van Weermen e Schurs e Engvall e Perlmann o método imunoenzimático para detecção e
quantificação de antígenos e anticorpos específicos. Esses pesquisadores verificaram que a interação antígeno e anticorpo poderia ser
detectada e quantificada utilizando como substância reveladora um conjunto enzima-substrato, que, na presença de uma espécie doadora de
elétrons (cromógeno), forma produtos coloridos. Além disso, observaram que as proteínas poderiam ser imobilizadas em superfícies sólidas
como a de poliestireno. Essa foi a base para o desenvolvimento dessa técnica.
O método de ELISA é capaz de detectar antígenos ou anticorpos. Ele é realizado em placas plásticas de 96 poços (placas de microdiluições)
formadas de poliestireno e que seguem uma sequência de procedimentos.
 
Fonte: Wikipedia
 Uma microplaca de 96 poços usada para ELISA.
ETAPA 1
Inicialmente, a placa é previamente sensibilizada com a substância (antígeno e anticorpo) específica que é complementar à molécula que
desejamos identificar.
SENSIBILIZADA
Processo de revestimento da placa com o reagente adequado. Normalmente, utiliza-se um pH alcalino, mantendo os reagentes com
carga negativa e garantindo que ocorra a adsorção na placa, pois essa apresenta carga positiva, devido ao poliestireno.
ETAPA 2
Após a sensibilização, nem todos os espaços da placa são cobertos, restando alguns espaços vazios que podem ser ocupados por qualquer
outra molécula gerando ligações inespecíficas e resultados falso positivos. Assim, é feito um bloqueio com soro albumina bovina (BSA), a
ovalbumina, a caseína ou um complexo proteico, como o soro de cobaia dos espaços vazios da placa.
ETAPA 3
Durante a execução do método, são realizadas várias lavagens (manual, por meio automático ou por um sistema a vácuo) importantes para
a retirada dos excessos de reagentes que não estão ligados a nenhuma molécula, impedindo assim qualquer tipo de ligação cruzada e
interferências.
ETAPA 4
Dependendo do que queremos analisar, podemos utilizar antígenos conjugados com enzimas (Ac-E) e anticorpos ou anti-anticorpos
conjugados com enzimas (Ag-E) . As enzimas mais empregadas são a fosfatase alcalina e peroxidase. Para revelar e verificar se ocorreu
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interação antígeno-anticorpo conjugado com a enzima ou anticorpo-antígenos conjugados com a enzima, é oferecido o substrato dessa
enzima e um componente doador de elétrons (cromógeno).
Quando a enzima está presente no meio reacional, ou seja, quando houve interação e reconhecimento antígeno-anticorpo conjugado, a
enzima quebra o substrato e o produto formado atua no cromógeno, gerando uma cor. Agora, quando a alteração de cor não é verificada,
indica que a interação não ocorreu, não tendo assim no meio reacional a enzima para agir no substrato
ETAPA 5
A leitura pode ser qualitativa, apenas verificando a alteração de cor, ou então pode ser realizada a leitura em espectrofotômetro, o que
converte as diferentes intensidades de cor em valores numéricos (valores de densidade óptica). Quanto maior a cor obtida, maior é a
concentração da enzima conjugada e assim, maior a concentração da substância na amostra investigada.
O método de ELISA, quando realizado em condições excelentes (enzimas ativas, antígenos puros e anticorpo conjugado), é capaz de
apresentar uma sensibilidade muito similar à do radioimunoensaio, porém com vantagem de não se utilizar elementos radioativos. Ele
consegue detectar quantidades muito pequenas de antígenos ou anticorpos. No entanto, alguns reagentes utilizados são teratogênicos e
podem ter interferentes de enzimas endógenas quando utilizadas como antígenos células inteiras e íntegras.
 
Fonte: Jarun Ontakrai/Shutterstock
 ELISA com reação colorimétrica.
O método de ELISA pode ser classificado em direto, indireto ou competitivo, são eles:
ELISA direto
Método utilizado para pesquisar a presença de antígenos. É amplamente empregado em testes imuno-histoquímicos, que buscam em
amostra de tecidos obtidas por biopsias detectar proteínas, enzimas, receptores, alterações celulares etc. Para isso, o tecido ou amostra
(com os antígenos pesquisados) é fixado a uma superfície e, em seguida, é adicionado um anticorpo conjugado com uma enzima (anticorpos
primários) correspondente ao antígeno que investigamos. Quando temos a presença do antígeno, há o reconhecimento com o anticorpo-
conjugado e, ao adicionar o substrato da enzima, teremos uma coloração (Figura 13).
 
Fonte: Adaptado de Soleil Nordic e Fluke Cha /Shutterstock
 Método de ELISA direto. (A) Esquema mostrando a técnica. (B) Esquema mostrando a interação antígeno-anticorpo marcado, uma
reação positiva e uma reação negativa.
ELISA INDIRETO
Método utilizado para pesquisar a concentração de anticorpos presentes em uma amostra de soro ou plasma. Para isso, os antígenos são
imobilizados na fase sólida (Placa de ELISA) . A interação antígeno-anticorpo será evidenciada pela utilização de um segundo
anticorpo (Anticorpo secundário) que está conjugado com a enzima e reconhece o anticorpo ligado ao antígeno (Figura 14). A reação será
visualizada após a adição do substrato da enzima. É empregado no diagnóstico de doenças infectocontagiosas como AIDS e doença de
chagas.
Essa técnica pode ser adaptada para a pesquisa de antígenos em uma amostra biológica e é chamada de ELISA Sanduíche. Para isso:
A placa é sensibilizada com o anticorpo (anticorpos de captura).

Depois, o anticorpo de captura reconhece o antígeno presente na amostra biológica.

Em seguida, a reação é revelada com um anticorpo-conjugado que reconhece o antígeno ligado ao anticorpo de captura (Figura 14).
 SAIBA MAIS
É empregado no teste de gravidez para detecção do hormônio gonodotrofina coriônica no soro.
 
Fonte: Adaptado de Soleil Nordic/Shutterstock
 Figura 14: Método de ELISA Indireto e ELISA Sanduíche.
ELISA COMPETITIVO
Nessa técnica, pesquisamos antígenos nas amostras através da competição com antígenos conjugados com a enzima. Para isso:
ETAPA 1
ETAPA 2
ETAPA 3
ETAPA 1
A placa é sensibilizada com o anticorpo de captura.
ETAPA 2
São adicionados ao mesmo tempo a amostra em investigação e quantidades fixas de antígenos conjugados em que ambos competirão pela
ligação ao anticorpo, que se liga àquela molécula que estiver em maior concentração.
ETAPA 3
Após a adição do substrato da enzima, a interação anticorpo de captura e antígeno marcado gera uma cor, quanto maior a intensidade de
coloração, mais antígenos conjugados estão ligados e menor é a concentração de antígenos na amostra. Agora, quanto menor a
intensidade de cor, maior é a concentração de antígenos na amostra em investigação e menor a ligação dos antígenos conjugados
ao anticorpo decaptura.
O ELISA Competitivo pode ser:
DIRETO
Pesquisa antígenos
INDIRETO
Pesquisa anticorpos
Ocorre através de uma competição simultânea, quando a substância marcada e a investigada são adicionadas ao mesmo tempo, ou uma
saturação sequencial, quando a substância em investigação é adicionada primeiro e depois é adicionado o antígeno ou o anticorpo
conjugado (Figura 15).
 
Fonte: Adaptado de Research Gate
 Figura 15: Método de ELISA Competitivo.
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RADIOIMUNOENSAIO
Em 1956, foi desenvolvida a técnica radioimunoensaio (RIE) para a detecção da insulina. Essa representa a primeira metodologia
padronizada que utiliza reagentes marcados para a detecção de moléculas na ordem de nano e picogramas. O RIE é semelhante ao ELISA
competitivo, no entanto, utiliza substâncias marcadas com o radioisótopo. O radioisótopo mais empregado é o iodo-125.
 SAIBA MAIS
O termo Radioimunoensaio (RIE) é usado apenas quando a substância marcada é o antígeno, e ensaio imunorradiométrico (IRMA) quando o
anticorpo que está marcado.
A detecção de antígenos ou anticorpos ocorre pela competição pelo sítio de ligação entre a substância marcada com radioisótopo e a
substância que se deseja analisar. Os antígenos ou anticorpos são adicionados à fase sólida e acrescentados às moléculas marcadas com
radioisótopo junto com a amostra do paciente. A quantificação é realizada em aparelho específico para a detecção da radioatividade.
Quanto maior for a leitura da radioatividade, maior a formação de imunocomplexos com a substância marcada e menor é a
concentração do antígeno ou anticorpo investigado (Figura 16).
VANTAGENS DESSE TESTE
Alta especificidade e sensibilidade.
É rápido, barato.
Requer pouco volume de amostra para testagem.
Permite dosagem de substâncias em pequenas concentrações.

DESVANTAGEM DESSE TESTE
Apresenta um alto risco ao operador.
É necessário um grande investimento em biossegurança e descarte de material radioativo.
Grande instabilidade dos radioisótopos.
E amplamente empregado para dosar polipeptídeos, catecolaminas, esteroides, hormônios, drogas, vitaminas, verificar a presença de vírus
como o da hepatite B e a presença de alguns marcadores tumorais.
 
Fonte: O autor
 Figura 16: Esquema ilustrando um ensaio imunorradiométrico (IRMA).
TESTES IMUNOCROMATOGRÁFICOS
Os testes imunocromatográficos realizam a detecção da interação antígeno-anticorpo pela difusão cromatográfica, onde o complexo formado
gera uma cor, e a partir deles, podemos detectar antígenos ou anticorpos. Os testes rápidos são um exemplo clássico de imunocromatografia
e são muito utilizados para a detecção de várias doenças, como: HIV, Hepatite, COVID. Essa metodologia é de fácil execução, baixo custo,
que conferem resultados rápidos, versáteis, dispensa equipamentos e que podem ser realizados em diferentes amostras, como o soro,
plasma, sangue total, saliva, swab de nasofaringe e orofaringe, urina e fezes. Entretanto, apresentam baixa sensibilidade.
 
Fonte:Shutterstock
 Teste Imunocromatográfico para HIV.
Você já realizou um teste rápido? 
Sabe por que aparecem duas bandas, uma chamada de “T” e a outra de “C”, vamos entender?
O teste rápido é realizado em um cassete constituído por uma membrana porosa de celulose modificada e membranas absorventes de fibra
de vidro. Envolvendo a membrana, temos um dispositivo plástico que contém os locais de aplicação das amostras e verificação dos
resultados. Ele é constituído por uma fase sólida (Membrana porosa) , onde ocorre a interação antígeno-anticorpo e é o local onde estão
presentes os elementos de captura (Antígeno ou anticorpos específicos) fixados na membrana e uma fase móvel com o deslocamento das
substâncias por capilaridade.
Inicialmente, para a detecção de antígenos, a amostra é colocada em uma região pré-determinada da membrana. Nessa área, estão
presentes anticorpos conjugados normalmente com ouro coloidal (coloração rosa) ou prata coloidal (azul marinho), que serão responsáveis
pela revelação da interação antígeno-anticorpo.

Após aplicação, a amostra migra em direção as regiões testes (T) e controle (C).

Caso haja reconhecimento entre o antígeno-anticorpo conjugado, esse complexo será retido pela ligação com os anticorpos presentes na
região T, que reconhecem os epítopos do antígeno em investigação e gera uma linha colorida. Caso não haja interação, essa linha colorida
não aparecerá.
É importante ressaltar que, após a região teste, temos uma região controle, com anticorpos anti-IgG que são capazes de se ligar a todos os
anticorpos livres presentes na amostra. O aparecimento da linha controle é essencial, pois indica que houve migração da amostra e deve
estar presente nos resultados positivos e negativos. O não aparecimento da linha controle invalidada o teste (Figura 17).
 
Fonte: Adaptado de Biomedicina Padrão
 Figura 17: Esquema ilustrando um teste rápido para detecção do antígeno NS1, que indica infecção pelo vírus da dengue.
IMUNO-HISTOQUÍMICA
O teste de imuno-histoquímica (IHQ) é uma técnica que combina a imunologia, histologia e química e tem como finalidade o
reconhecimento de proteínas de alta afinidade durante os exames histopatológicos. Esse teste é empregado em cortes de tecidos obtidos
após a biópsia para a detecção de doenças degenerativas ou parasitárias, identificação de substâncias e análises de estruturas dos tecidos
normais e alteradas durante a evolução da doença. Atualmente, existe uma série de anticorpos capazes de reconhecer com alta
especificidade proteínas do tecido e que garantem um diagnóstico mais fidedigno.
Existem dois tipos de técnicas que podem ser aplicadas para a imuno-histoquímica:
TÉCNICA DIRETA
Técnica que reconhece os antígenos presentes em um corte de tecido a partir de anticorpos ligados a um marcador (anticorpos primários).
Os cortes de tecidos são colocados em contato com os anticorpos primários e, após um tempo de incubação, é realizada a leitura em
microscópios adequados. Os antígenos pesquisados no tecido serão observados pelo aparecimento de uma cor, indicando que houve
reconhecimento pelo anticorpo. Os anticorpos não ligados são removidos por lavagens realizadas durante a técnica.
TÉCNICA INDIRETA
Técnica que reconhece proteínas pela ligação com um anticorpo (primário não marcado) específico ao antígeno em investigação e depois
essa interação é revelada pela utilização de um anticorpo anti-IgG marcado (anticorpo secundário) e a amostra é observada em um
microscópio adequado.
Normalmente, em sistemas reveladores na IHQ, são utilizadas reações enzimáticas, com destaque para o sistema avidina-biotina-enzima-
cromógeno. Vamos entender como isso acontece?
Nessas reações, o anticorpo secundário é complexado à biotina, e é adicionado ao meio reacional à estreptavidina ligada a uma peroxidase.
A estreptavidina tem afinidade à biotina e liga-se a ela e, consequentemente, ao anticorpo secundário. Em seguida, é adicionado ao meio
reacional a 3,3-diaminobenzina (DAB) , que reage com a peroxidase, reduzindo o DAB que se precipita no local de reação e gera uma cor
marrom- ferruginosa. A coloração marrom indica que houve interação antígeno-anticorpo (Figura 18).
 
Fonte: Vetpathologist/Shutterstock
 Figura 18: Corte histológico mostrando as enzimas pepsinogênicas (coloração marrom) no estômago. Imuno-histoquímica por complexo
avidina-biotina-enzima-cromógeno.
TESTE DE HIPERSENSIBILIDADE CELULAR CUTÂNEA TARDIA
Todas as técnicas que verificamos até aqui estudam a imunidade humoral, com a interação antígeno e anticorpo. Mas e a imunidade celular?
Quais são as técnicas que avaliam in vitro ou in vivo esse tipo de imunidade?
A análise da imunidade celular in vitro é feita pela linfoproliferação e citometria de fluxo e in vivo a partir do teste de hipersensibilidade celular
cutânea tardia. O teste de hipersensibilidade tardia é um método simples e pode ser empregado para confirmar exposição prévia a alguns
agentesinfecciosos, como Mycobacterium tuberculosis, Hanseníase, Leishmania, Candida albicans, Paracoccidioides brasiliensis, dentre
outros. Para isso:
ETAPA 1
ETAPA 2
ETAPA 3
ETAPA 1
São aplicados no antebraço do paciente 0,1 mL de antígeno específico com agulhas e seringas estéreis, por via intradérmica.
A via subcutânea não é recomendada, pois diluiu os antígenos inoculados, levando a resultados falso negativos.
ETAPA 2
No outro antebraço, é aplicado a mesma quantidade de Soro fisiológico 0,9% estéril (salina) como controle.
ETAPA 3
Após 48-72 horas, é realizada a leitura, onde é medido o diâmetro do endurecimento (Parte dura) . Normalmente, caroços superiores a 5
mm são indicativos de uma reação imune celular (Tipo th1) no local e da exposição ao antígeno pesquisado, mas o tamanho depende do
tipo de antígeno (Figura 19).
 
Fonte: Adaptado de Shutterstock
 Figura 19: Ilustração mostrando o teste de PPD.
Um teste positivo não indica que o paciente esteja doente ou que obrigatoriamente tenha tido uma infecção. O aparecimento do eritema e do
endurecimento indica a presença de células de memória do tipo Th1, por uma doença que já foi curada ou uma infecção assintomática, onde
o participante não apresentou sintomas. O teste negativo indica a ausência de contato com aquele agente infeccioso.
Alguns exemplos do emprego do teste hipersensibilidade celular cutânea tardia, ou teste de PPD (derivado proteico purificado):
Pesquisa a exposição ao Mycobacterium tuberculosis, com o antígeno tuberculina, conhecido como teste de Mantoux.
Pesquisa a exposição à hanseníase com o antígeno lepromina, ou antígeno de Mitsuda.
Pesquisa a exposição a Candida albicans com os antígenos candidina ou oidiomicina.
Pesquisa a exposição a Paracoccidioides brasiliensis com o antígeno paracoccidioidina.
Pesquisa de Leishmaniose tegumentar com o extrato de protozoário como antígeno, o famoso teste de Montenegro.
Além disso, essa metodologia é indicada para avaliar a diminuição da imunidade celular do tipo th1 (anergia) em indivíduos que não
respondem mais a microrganismos não patogênicos, situação que é observada em pacientes imunossuprimidos pelo uso de drogas e
doenças, como neoplasias, AIDS, doenças autoimunes. Alguns produtos químicos quando aplicados ao antebraço provocam uma
sensibilização e uma reação imune no local. Essa propriedade tem sido utilizada para analisar casos de anergia e a droga mais empregada é
o DNCB. Esse é um teste que não é de rotina e deve ser feito apenas com pacientes com suspeita de ausência de resposta imune celular.
 
Fonte: Pixel-Shot/Shutterstock
CITOMETRIA DE FLUXO E QUIMIOLUMINESCÊNCIA
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. VIMOS QUE A TÉCNICA DE ELISA É AMPLAMENTE UTILIZADA NO DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO DE
DIFERENTES DOENÇAS INFECCIOSAS, COMO HIV, DOENÇA DE CHAGAS, COMO TAMBÉM É CAPAZ DE
DETECTAR HORMÔNIOS COMO A GONADOTROFINA CORIÔNICA HUMANA. ESSA TÉCNICA APRESENTA
ALGUMAS VARIAÇÕES E, DE ACORDO COM A METODOLOGIA, PODE SER CLASSIFICADA EM ELISA
DIRETO, COMPETITIVO E INDIRETO. SOBRE ESSE ASSUNTO, MARQUE A ALTERNATIVA CORRETA.
A) O teste de ELISA indireto é utilizado para verificar apenas a presença de antígenos em cortes de tecidos.
B) O teste de ELISA direto é utilizado para verificar a presença de antígenos em cortes de tecido.
C) No teste de ELISA competitivo, a intensidade de cor e a concentração de antígenos na amostra em investigação é diretamente
proporcional.
D) O teste de ELISA competitivo é utilizado para verificar apenas a presença de antígenos em cortes de tecidos.
2. APRENDEMOS QUE OS TESTES RÁPIDOS SÃO MUITO UTILIZADOS QUANDO PRECISAMOS DE UM
DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO IMEDIATO, PARA A DETECÇÃO DE DOENÇAS INFECTOCONTAGIOSAS COMO
COVID, DENGUE, HIV E SÍFILIS E É UMA TÉCNICA DE FÁCIL EXECUÇÃO, VERSÁTIL E QUE DISPENSA
EQUIPAMENTOS. OS TESTES RÁPIDOS DETECTAM A INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPOS POR QUAL
REAÇÃO?
A) Imunoenzimática
B) Imunocromatografia
C) Imuno-histoquímica
D) Teste de sensibilidade cutânea
GABARITO
1. Vimos que a técnica de ELISA é amplamente utilizada no diagnóstico imunológico de diferentes doenças infecciosas, como HIV,
doença de chagas, como também é capaz de detectar hormônios como a gonadotrofina coriônica humana. Essa técnica apresenta
algumas variações e, de acordo com a metodologia, pode ser classificada em ELISA direto, competitivo e indireto. Sobre esse
assunto, marque a alternativa correta.
A alternativa "B " está correta.
 
O teste de ELISA direto é um teste para verificar a presença de antígenos em cortes de tecidos. O ELISA indireto e competitivo pode analisar
tanto antígenos como anticorpos. No teste de ELISA competitivo, a intensidade de cor e a concentração da amostra é inversamente
proporcional, quanto maior a intensidade de cor, maior é a concentração de antígenos na amostra em investigação, pois menor é a ligação
dos antígenos conjugados ao anticorpo de captura.
2. Aprendemos que os testes rápidos são muito utilizados quando precisamos de um diagnóstico imunológico imediato, para a
detecção de doenças infectocontagiosas como COVID, dengue, HIV e sífilis e é uma técnica de fácil execução, versátil e que
dispensa equipamentos. Os testes rápidos detectam a interação antígeno-anticorpos por qual reação?
A alternativa "B " está correta.
 
Os testes imunocromatográficos realizam a detecção da interação antígeno-anticorpo pela difusão cromatográfica, onde o complexo formado
gera uma cor, e a partir dele podemos detectar antígenos ou anticorpos. Um exemplo clássico de teste imuncromatográfico são os testes
rápidos comerciais para detecção de várias doenças, como: HIV, Hepatite, COVID.
CONCLUSÃO
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Ao longo desta jornada, conhecemos os diferentes testes imunológicos empregados para a confirmação diagnóstica, o diagnóstico precoce,
acompanhar a evolução e o tratamento de uma doença, além de confirmar a presença de uma substância no organismo. Vimos que a maioria
dos testes utilizados consistem na interação antígeno-anticorpo. Essa interação pode ser visível a olho nu (teste de precipitação, aglutinação
ou fixação de complemento) ou então um dos componentes da interação deve estar marcado com corante fluorescente ou
quimioluminescentes, radioisótopos, enzimas, entre outros marcadores, para que essa interação seja visível (ELISA, radioimunoensaio, teste
de fluorescências).
Ao final, foi verificado que o teste de hipersensibilidade cutânea tardia é uma forma de verificação in vivo da imunidade celular, sendo
essencial para confirmar a exposição prévia a alguns agentes infecciosos e estudar casos de diminuição da imunidade celular do tipo th1
(anergia).
Juntos podemos entender a metodologia de cada teste, aplicabilidade, sua vantagem e desvantagem, ampliando ainda mais o conhecimento
sobre imunologia clínica.
AVALIAÇÃO DO TEMA:
REFERÊNCIAS
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H. Imunologia Celular e Molecular. 5. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2005.
MACHADO, S. L; MACHADO, R. D. Imunologia básica e aplicada às análises clínicas. Consultado em meio eletrônico em: 18 ago. 2020.
MOLINARO, E. M.; CAPUTO, L. F. G; AMENDOEIRA, M. R. R. Conceitos e métodos para a formação de profissionais em laboratórios
de saúde. 3. ed. Rio de Janeiro: EPSJV: IOC, 2013.
WASTOWSKI, I.; DONADI, E. Imunologia básico para o clínico. Consultado em meio eletrônico em: 18 ago. 2020.
EXPLORE+
Aprendemos que o efeito prozona acontece quando a concentração de anticorpos está maior do que de antígenos e que isso pode levar a
resultados falso negativos, pois a visualização desses precipitados fica prejudica. Esse efeito é muito comum nos testes para detecção de
sífilis pelo teste de VDRL. Para conhecer mais sobre isso, busque o artigo Efeito prozona no diagnóstico de sífilis pelo método VDRL:
experiência de um serviço de referência no sul do Brasil.
Conhecemos um pouco sobre o diagnóstico por ELISA e de que forma pode ser realizado. Para saber mais, não deixe de pesquisar artigo
Teste de ELISA indiretopara o diagnóstico sorológico de pitiose.
Para conhecer um pouco mais da aplicabilidade do teste rápido para HIV e como são utilizados na clínica, leia o artigo Teste Rápido para
Detecção da Infecção pelo HIV-1 em Gestantes.
Para compreender um pouco mais sobre o teste de sensibilidade cutânea Montenegro, leia o artigo Avaliação do poder sensibilizante da
reação de Montenegro.
Apreendemos que a citometria de fluxo é uma forma de avaliação da imunidade celular in vitro, para conhecer mais sobre essa técnica leia
Citometria de Fluxo no estudo das doenças infecto-parasitárias.
CONTEUDISTA
Gabrielly Sbano Teixeira
 CURRÍCULO LATTES
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